A citoszolos foszfolipáz A2α döntő szerepet játszik a DSS által kiváltott colitis patogenezisében egerekben

Immunológiai és fertőző betegségek laboratóriuma, Klinikai Biokémiai és Farmakológiai Tanszék, Egészségtudományi Kar, Negev Ben-Gurion Egyetem, Soroka Medical University Center, Beer-Sheva, Izrael

Teljes levelezés: Rachel Levy professzor, Immunológiai és fertőző betegségek laboratóriuma, Klinikai Biokémiai és Farmakológiai Tanszék, Egészségtudományi Kar, Negev Ben-Gurion Egyetem, Soroka Orvostudományi Egyetem, Beer Sheva 84105, Izrael

Absztrakt

Bevezetés

A gyulladásos bélbetegségek (IBD) a vékonybél és a vastagbél krónikus, kiújuló rendellenességeinek csoportját foglalják magukban, amelyek közül a leggyakoribb a fekélyes vastagbélgyulladás (UC) és a Crohn-kór (CD). A vastagbélben az UC és a CD is számos olyan tünetet generál, amelyek krónikus gyulladást, hasmenést, végbélvérzést, hasi fájdalmat és súlycsökkenést tartalmaznak. Bár az IBD hátterében álló pontos molekuláris és sejtes események nincsenek teljesen megmagyarázva, az IBD-t legjobban egy komplex betegségként definiálják, amelyet mind a genetikai, mind a környezeti komponensek provokálnak. Az IBD legnyilvánvalóbb jellemzői a krónikus gyulladás, amely magában foglalja a bélrendszer különféle régióit, és a megnövekedett rákos kockázat, amely szövődmény közvetlenül összefügg a gyulladásos folyamat időtartamával és mértékével 1, 2. Az IBD immunpatogenezise a gyulladásos mediátorok, köztük a nitrogén-oxid (NO) 3, 4, a prosztaglandinok 5 és a gyulladásgátló citokinek, például a tumor nekrózis alfa (TNF-α), az interleukin (IL) 6 és az IL- növekedésével jár. 23 6, 7 .

Eredmények

cPLA2α upreguláció és aktiváció a vastagbélgyulladás kialakulásában DSS-indukálta colitis egér modellben

A cPLA2α szerepének meghatározása a vastagbélgyulladás kialakulásában annak expresszióját egér colitis-modellben határozták meg a DSS-kezelés 7 napja alatt, egyidejűleg a betegség kialakulásával, amelyet a vastagbél hossza, testtömege és Disease Activity Index (DAI) pontszám. Az 1A. Ábra a DSS-kezelés minden napján megvizsgált reprezentatív vastagbéleket (öt egér/csoport) mutat be. Az egyes csoportok vastagbélhosszának átlagát ± SEM az 1B. Ábra mutatja. Egy jelentős (o

A mieloperoxidáz (MPO) egy enzim, amelyet főleg polimorfonukleáris leukociták termelnek, és megbízható jelzője a szövetekbe való beszivárgás mértékének. Megállapították, hogy a DSS-sel kezelt egereknek a vastagbél-lizátumokban az MPO által kimutatott neutrofil rekrutációja szignifikánsan magasabb volt a betegség 4. napjától (o

A cPLA2α upreguláció szerepe a vastagbélgyulladás kialakulásában DSS-indukálta colitis egér modellben

A cPLA2α upreguláció szerepének meghatározása a vastagbélgyulladás kialakulásában DSS által indukált vastagbélgyulladás egérmodelljében a cPLA2α upregulációt megakadályoztuk antisense nukleotid in vivo beadásával cPLA2α (AS) ellen. Két milligramm/kg AS-t vagy ennek megfelelő érzéket (SE) adtunk intravénásan 1 nappal az ivóvízben történő DSS-expozíció előtt és előtt minden nap a 7 napos expozíció előtt. A vastagbél-lizátumok immunblot-analízise (3A. Ábra) és a vastagbélszövet-szakaszok immunfluoreszcencia-elemzése (3B. Ábra) azt mutatta, hogy az AS-kezelés, de az SE-kezelés nem, megakadályozta a cPLA2a túlzott expresszióját. A cPLA2α aktivitást, amelyet az 505-es szerin foszforilezésével mértünk, szintén gátoltuk az AS-sel kezelt egerek DSS-nek kitett vastagbél-lizátumaiban (3A. ábra). Amint azt a vastagbél reprezentatív képe (3C. Ábra) és a vastagbél hossza mutatja az egyes egerekben a különböző csoportokban (3D ábra), az AS-val kezelt egerekben a vastagbél hossza szignifikánsan megnőtt a kontroll SE hosszához képest Kezelt egerek, a csoportok közötti átfedés nélkül (o

A vastagbél szöveti szakaszainak szövettani vizsgálatát végeztük a bél gyulladásos állapotának felmérésére (3F. Ábra). Mikroszkóposan a DSS által kiváltott vastagbélgyulladásos egerekből gyűjtött vastagbélminták tipikus nyálkahártya sérülést és gyulladásos változásokat mutattak a vastagbél felépítésében, például fekélyképződést, kriptatágulatot és serlegsejt-kimerülést, valamint gyulladásos sejtek beszűrését. Ezzel szemben az AS-vel kezelt egerekből származó vastagbélek szövettani elemzése szignifikánsan alacsonyabb számú beszűrődő sejtet és kisebb mértékű nyálkahártya-sérülést és ödémát mutatott.

Ilyen körülmények között az AS-kezelés, az SE-kezelés nem, szignifikánsan megakadályozta a neutrofil toborzást, amelyet az MPO, az ICAM-1 felpörgetés (4A. Ábra), az LTB4 szekréció (4C. Ábra), az iNOS és a COX-2 (4D. Ábra) értékelte, TNF-α szekréció (4E. Ábra) és NF-KB aktiváció (4F ábra). A neutrofil infiltráció AS kezeléssel történő megelőzését NIMP ‐ R14 festéssel is bizonyították (4B. Ábra). A vastagbél hossza, a DAI-pontszám és a mikroszkópos jellemzők nem változtak az egészséges kontroll egerek AS-kezelésével (az adatokat nem közöljük).

Vita

Eredményeinkkel ellentétben egy nemrégiben végzett tanulmány 26 a vastagbélgyulladás fokozódásáról számolt be DSS-nek kitett cPLA2α-knockout egerekben. A szerzők azt javasolták, hogy a betegség súlyosbodása a megnövekedett nyálkahártya-fekély következménye volt, amely számos eikozanoid-metabolit, köztük a PGE2 csökkent szintjéhez kapcsolódik, amely kulcsfontosságú a nyálkahártya integritása és a gyomor-bél traktus sebgyógyulása szempontjából 27. A cPLA2α-knockout egereknél azonban a gyógyulási arány hasonló volt, mint a DSS-sel kezelt egereknél. Az egerekkel ellentétben a cPLA2α hiányban szenvedő humán betegeknél a vékonybél 28-30 közötti vérzése ellenére normális vastagbélük volt. Az AS technika előnye a knockout egerekkel szemben az a képesség, hogy megakadályozza a felgyorsult fehérje indukcióját a gyulladás helyén, és lehetővé teszi annak expresszióját bazális szinten. Míg a knockout egér modellekben a fehérje teljes eliminációja drámai homeosztázis-változásokat és/vagy kompenzációt eredményezhet más fehérjék (hasonló biológiai jellemzőkkel) felszabályozásával.

Összegzésként elmondhatjuk, hogy a jelen tanulmányban a vastagbélgyulladás DSS-egér modelljét használva kimutattuk, hogy a cPLA2α upreguláció gátlása az egér vastagbélében megakadályozta az NF-κB transzkripciós faktor aktiválódását és számos gyulladásos mediátor termelését, ideértve a neutrofilek infiltrációját is, eikozanoidok és citokinek képződése, valamint az iNOS és COX ‐ 2 upreguláció, amelyek mindegyike részt vesz a vastagbélgyulladás kialakulásában. Úgy gondoljuk, hogy a cPLA2α túlzott expresszió mechanikus szerepe a vastagbélgyulladás proinflammatorikus mediátorainak széles spektrumának upregulációjában megerősíti azt a nézetet, hogy a cPLA2α döntő szerepet játszik a betegség kialakulásában.

Anyagok és metódusok

Colitis egér modell

A vizsgálatot a Ben ‐ Gurion Egyetemi Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottság hagyta jóvá (IL-40-05-2012), és az izraeli állatjóléti törvénynek megfelelően végezték el a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutató útmutatásait követve (National Research Tanács, 1996). Négy hetes hím C57BL/6J egereket a Jackson Laboratories-tól (Jackson, Bar-Harbor, ME, USA) vásároltak. 1 hét adaptáció után a vastagbélgyulladást 2,5% DSS adagolásával indukálták (6 16. A DSS oldatot naponta cserélték. Az egereket naponta megvizsgálták a vastagbélgyulladás tüneteire a testtömeg, a rektális vérzés és a széklet konzisztenciájának monitorozásával. A betegség általános súlyosságát egy klinikai pontozási rendszerrel értékeltük, 0–4 skálán minden egyes paraméterre 48. A 7. napon az egereket Isoflurane-nal (Minrad, Buffalo, NY, USA) eutanizáltuk.

Szövettani értékelés

Az egész vastagbelet eltávolítottuk, alaposan mostuk, 24 órán át fixáltuk 10% -os pufferolt formalinban, és feldolgoztuk paraffin beágyazás céljából. A deparafinizált vastagbélszövet-metszeteket PBS 1% Triton X-100-ban mostuk 30 percig. A szöveti metszeteket hematoxilinnal és eozinnal (H&E) vagy immunfluoreszcenciával festettük. A nem specifikus reaktivitást 60 percig tartó inkubálás gátolta 10% normál szamár szérum blokkoló oldatban. A szöveti metszeteket ezután egy nyúl poliklonális antitest 1: 100 hígításával inkubáltuk egér cPLA2a ellen (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornia, USA) egy éjszakán át blokkoló oldatban. Három PBS-ben végzett mosás után a metszeteket 2 órán át inkubáltuk a szekunder Cy-3 antitesttel 1: 200 antitesttel (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA).

A neutrofilek festését patkány anti-egér monoklonális anti-NIMP-R14 antitesttel a neutrofilek azonosítására (Novus Biological) 15 előtt elemeztük. A nemspecifikus reaktivitást blokkoltuk, ha a tárgylemezeket 20% normál nyúlszérummal inkubáltuk 20 percig avidin-biotin VECTA-STAIN Kit Elite PK 6105-tel (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). A metszeteket ezután anti-NIMP-R14 antitestek 1:10 arányú hígításával inkubáltuk PBS-ben 1 órán át szobahőmérsékleten, mostuk, majd tovább inkubáltuk biotinilezett anti-patkány IgG 1: 200 hígításával, majd avidin-biotin komplex/HRP-vel. ‐DAB, ami a neutrofilek barna festését eredményezte. A metszeteket hematoxilinnel ellenfestettük.

Minden kezeléshez negatív kontrollt készítettünk az elsődleges antitest nélkül. Az összes festést vakon elemezték Olympus BX-60 mikroszkóppal.

Antiszensz oligonukleotidok

A cPLA2α elleni oligonukleotidokat (amelyek mind az embernek, mind az egérnek megfelelnek) az RNADraw V1.1 (Mazura Multimedia, Svédország) számítógépes megközelítéssel terveztük. Antiszensz oligonukleotidot (tcaaaggtctcattccacaand) és annak megfelelő értelmét foszforotioát-módosításokkal az utolsó három bázison használtuk mind az 5 ', mind a 3' végén.

Western blot elemzés

ELISA vizsgálatok

Az LTB4 és a TNF-α szintet szöveti lizátumokban mértük kereskedelmi ELISA készletek alkalmazásával: TNF-α (Biolegend) és LTB4 (R&D rendszerek, Minneapolis, MN, USA).

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± SEM-ként mutatjuk be. Jelentős különbségeket a kontroll körülményektől egy- vagy kétirányú varianciaanalízissel (ANOVA) határoztunk meg, majd egy utólagos Bonferroni tesztet többszörös összehasonlításra, amelyet a GraphPad Prism 5.03 verzió Windows szolgáltatott (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Összeférhetetlenség

A szerzők nem jelentenek be kereskedelmi vagy pénzügyi összeférhetetlenséget.