A Drosophila melanogaster Stress Odorant (dSO) valóban riasztó feromon?

ABSZTRAKT

A társas interakciók kulcsfontosságúak számos organizmus szaporodásához és túléléséhez, beleértve azokat is, amelyek vizuális, hallási és szaglási jeleket használnak a veszély jelenlétének jelzésére. A Drosophila melanogaster szagló riasztási jelet bocsát ki, amelyet mechanikus felkavarásra vagy áramütésre reagálva Drosophila stressz szagúnak (dSO) neveznek, és a rokonok elkerülik azokat a területeket, amelyeket korábban stresszes emberek foglaltak el. A dSO emissziójának és a dSO-ra adott válasz kontextusának, genetikai és idegi hátterének azonban kevés figyelmet szenteltek. Bináris választási assay segítségével megállapítottuk, hogy sem a kibocsátók kora és neme, sem a napszak nem befolyásolta a dSO kibocsátását vagy elkerülését. Mind a nem, mind a párzási állapot azonban befolyásolta a dSO-ra adott választ. Kimutattuk azt is, hogy a dSO nem fajspecifikus, ezért nem feromonnak, hanem általános riasztási jelnek kell tekinteni a Drosophila esetében. Az intra és az inter-specifikus jelekre adott válaszszintek azonban fajonként eltérőek voltak, és megvitatják e különbségek lehetséges okait.

KIEMELTEK

A dSO, egy nagyon illékony kémiai keverék, amelyet a stresszes legyek bocsátanak ki, nem kontextus-specifikus

A dSO-ra adott válasz kontextusfüggő, olyan tényezők befolyásolják, mint az életkor és a párzási állapot.

Mivel a legyek reagálnak a stresszes heterospecifikus anyagok illékony anyagaira, a dSO-t nem riasztó feromonnak, hanem riasztási jelzésnek kell tekinteni.

BEVEZETÉS

A vizuális, hallási, szaglási és/vagy tapintási jeleket alkalmazó társadalmi interakciók döntő fontosságúak az organizmusok sikeres fejlődése, túlélése és szaporodása szempontjából (Dahanukar & Ray, 2011; Sokolowski, 2010), beleértve a veszélyekkel kapcsolatosakat is. A veszélyekre való reagálás különféle viselkedési reakciókat válthat ki (Yew & Chung, 2015), különféle érzékszervi modalitásokkal, amelyek a fajtól és az ökológiai kontextustól függenek (Verheggen, Haubruge és Mescher, 2010). A szagló riasztási jelek jellemzően erősen illékony, nem perzisztens molekulákból állnak (egyes vegyületek vagy keverékként), amelyek gyorsan tájékoztatják a rokonokat a lehetséges veszélyről anélkül, hogy tartós riasztási állapotot generálnának (Verheggen et al., 2010). A riasztó feromonokról, amelyek definíciójuk szerint modulálják a fajtársak közötti kölcsönhatásokat, az állatok széles körében számoltak be a fonálférgektől az emberekig (Chao, Fleischer és Yang, 2018; Hunt, 2007; Mathuru és mtsai, 2012; Mujica-Parodi et al., 2009; Vandermoten, Mescher, Francis, Haubruge és Verheggen, 2012; Zhou és mtsai, 2017), bár egyes esetekben ezek a szagjelek válaszokat váltanak ki a szoros rokonságban lévő, közös természetes ellenségeket megosztó szimpatikus fajokban (Napper & Pickett, 2008 ).

A Drosophila melanogaster stresszben szenvedő személyek szagú riasztási jelet bocsátanak ki, a Drosophila stressz szaglószer (dSO) és a legyek elkerülik azokat a területeket, amelyeket korábban stresszes rokonok foglaltak el (Suh et al., 2004). A szén-dioxid (CO2) a dSO egyik alkotóeleme, és a CO2 érzékelésének érzékszervi útját megvizsgálták (Bracker et al., 2013; Faucher, Forstreuter, Hilker, & de Bruyne, 2006; Krause Pham & Ray, 2015; Kwon, Dahanukar, Weiss és Carlson, 2007; Siju, Bracker és Grunwald Kadow, 2014; Suh és mtsai, 2007; Suh és mtsai, 2004; Turner és Ray, 2009). Az elkerülési válasz azonban gyengébb önmagában a CO2-ra, mint a dSO-ra, ami arra utal, hogy más komponensek vannak jelen (Suh et al., 2004). Tudjuk, hogy mindkét nem reagál a dSO-ra, bár a válasz szintje a genetikai háttér (Fernandez et al., 2014) és az életkor (Brenman-Suttner et al., 2018), valamint a kibocsátók sűrűségének függvényében változik. (Fernandez et al., 2014). A dSO teljes keverékének, valamint az érintett géneknek és érzékszervi utaknak az azonosításának megkönnyítése érdekében elengedhetetlen ismerni azokat a körülményeket, amelyek a szagló jel magas termelését eredményezik. Ezért kísérleteket végeztünk a különböző tényezők hatásának vizsgálatára a dSO emissziójára és észlelésére.

MÓD

Kísérleti állatok

A különböző vizsgálatokban használt összes D. melanogaster (Canton-S), D. simulans és D. suzukii felnőtteket a Western University-n fenntartott laboratóriumi telepekből nyertük. D. melanogastert és D. simulaneket Drosophila Jazz-Mix ™ diétán (Fisher Scientific, ON, Kanada) 25 ° C-on, 50% relatív páratartalom mellett 12L: 12D fényciklus alatt tenyésztettünk. A D. suzukii-t banán-kukoricadara-agar táptalajon (Jakobs, Ahmadi, Houben, Gariepy és Sinclair, 2017) 21 ° C-on, 65% relatív páratartalom mellett, 14 literes: 10 órás fényciklus alatt tartottuk. A szűzeket úgy kapták meg, hogy a legyeket nemi életkorban nemezték meg, és a felnőtteket azonos nemű tartályokban tartották (kb. 40 legyek/tartály), amíg szükség volt rá. A párosodott legyek megszerzéséhez az újonnan megjelenő legyeket (20 hím és 20 nőstény) együtt tartották a vizsgálatig.

dSO elkerülési vizsgálatok

Hacsak másként nem jelezzük, minden kísérletben párosított, 3-7 napos felnőtteket használtunk, és 12:00 és 16:00 között 25 ° C-on és 50% relatív páratartalom mellett végeztük a viselkedés bármely diel-periodicitásával járó variáció csökkentését (Dubruille & Emery, 2008). A dSO elkerülési vizsgálat részletes leírása megtalálható (Fernandez et al., 2014). Röviden, a válaszadó legyeket egy bináris választású T-labirintusba helyezik egyenletes fényviszonyok között, ahol választhatnak egy kontroll fiola és egy vagy 1 perc alatt (15 másodperc, 5 másodperc nyugalomban, háromszor megismételve), vagy egy fiolát, amelyet korábban stressz nélküli legyek foglaltak el. 1 perc elteltével rögzítettük az összes legyek helyzetét, majd kiszámítottuk a teljesítményindexet (PI) úgy, hogy a kísérleti fiolában levő válaszadó legyek számát levontuk a légi fiolában található legyek számáról, elosztva az összes légy felhasználásával. Ez megadja a preferencia mértékét, ahol egy pozitív érték azt jelzi, hogy a válaszadók elkerülték a kísérleti fiolát, míg egy negatív érték azt jelezte, hogy vonzódtak hozzá. Így a kísérleti üveg teljes elkerülésével a PI értéke 100, míg ha a legyeket egyenlően osztanák meg a kontroll és a kísérleti fiolák között (nincs előnyben), a PI 0.

Ha zavartalan legyek jelzésére volt szükség, akkor az ellenáramú készüléket használtuk, amelyet először Benzer jelentett (1967), amint azt Fernandez és mtsai. (2014). A legyeket egy árnyékolt tartályos injekciós üvegből 15W-os fehér fény alkalmazásával világított, tiszta fiolába vontuk, ahol 1 percig maradtak, majd ugyanazzal a technikával eltávolították őket.

Korábbi kísérletek (Fernandez és mtsai, 2014) azt találták, hogy a 3-7 napos párosodott legyek elkerülik a dSO-t, amelyet bármelyik szex önmagában vagy vegyes nemű populációban termel. Azonban nem volt ismert, hogy a párzási állapot befolyásolja-e a válaszokat, ezért összehasonlítottuk a párosodott és szűz legyek válaszait 30 párosodott vagy szűz válaszadóval (mind hím, mind nőstény, vagy 15 hím és 15 nő) 70 emitter (egyetlen vagy vegyes neműek). Ezek ugyanazok a sűrűségek voltak, amelyeket a korábbi vizsgálatokban teszteltek, de mivel az index a kibocsátók számával csökken (Fernandez et al., 2014), megismételtük a kísérletet 20 kibocsátó és 15 válaszadó felhasználásával.

Az életkor dSO-emisszióra gyakorolt hatásának tesztelésére 9 ismétlést végeztünk, ahol 30 legyet (vegyes neműek) tettünk ki 70 felnőtt jelzésére, 2-5 napos és 7 hét közötti korúak. Megvizsgáltuk a sugárzók nemét is: 15 vegyes nemű válaszadót tettünk ki dSO-nak, amelyet 20 hímtől, 20 nősténytől vagy mindkettő keverékétől kaptunk, minden kombináció esetében legalább 9 ismétléssel. Vizsgáltuk a válaszadók életkorának hatását úgy, hogy 15 válaszolót tettünk ki a 20 3-4 vagy 7-10 napos férfitól vagy nőtől kapott dSO-ra. Kezelésenként 9 ismétlés volt.

Annak eldöntésére, hogy lehet-e diel periodicitás a dSO emissziójában vagy az arra adott válaszban, két kolóniát tartottunk 12L: 12D fotoperiodikus rezsim alatt, de a bekapcsolt jelzéssel 04:00 egyben és 08:00 órakor. Egyéb. Ez lehetővé tette számunkra, hogy különböző kombinációkat teszteljünk mind a kibocsátók, mind a válaszadók számára, amint az a 1.ábra, ahol a ZT a jelzőfények idejére utal. Az összes kombinációra 9 ismétlés volt, a nemeket külön teszteltük.

A napszak potenciális hatásának meghatározására használt kísérleti terv a D. melanogaster dSO emissziójára és vételére egyaránt.

Míg Fernandez et al. (2014) kimutatta, hogy csak 10 legyet lehet felhasználni dSO forrásaként, nem tudni, hogy az alacsonyabb sűrűség elegendő-e a válasz kiváltására. Ezért megvizsgáltuk 30 válaszadó viselkedését, amikor 1 (férfi vagy nő - adat összegyűjtve statisztikailag nem különbözik, az adatokat nem mutatjuk be), 2, 5 vagy 10 legyet kevert neműekből, legalább 11 ismétléssel teszteltünk. minden kibocsátó korra.

Megvizsgáltuk a stressz intenzitásának fontosságát, összehasonlítva 15 vegyes nemű válaszadó 20 kibocsátó dSO-jára adott válaszát, amelyet 1 perc alatt 1, 2 vagy 3 (15 mp) örvényezésnek vetettek alá, vagy amelyeket az ampullába helyeztünk rázással. Összehasonlítottuk mind a hímek, mind a nők válaszát a 20 legyek (10 hím/10 nő) szagára, amelyek nem voltak stresszesek (a fényre adott reakciót a fentiek szerint átadták), 1 percig vortexelték vagy egy injekciós üvegben tartották keverés vagy étel 12 órán át. Minden esetben kezelésenként legalább 9 ismétlés volt.

A dSO disszipációjának teszteléséhez összehasonlítottuk mind a hímek, mind a nők reakcióját a forrásokkal közvetlenül, vagy 1 vagy 2 perccel azután, hogy a sugárzókat vortexeltük és eltávolítottuk. Megvizsgáltuk a dSO kibocsátásának örvényezés utáni idejét is. Ebben az esetben a legyeket vortexeltük, hagytuk pihenni 10 másodpercig, 1 percig, 1 vagy 2 órán át, mielőtt 1 percig tiszta fiolába helyeztük. A legyeket a fényválasz útján bevezettük és eltávolítottuk a teszt fiolából, hogy biztosítsuk a további keverés hiányát. Minden vizsgálatban 9 ismétlés volt.

Mivel bizonyíték van arra, hogy a D. melanogaster által kibocsátott dSO a CO2-n kívül más komponenseket is tartalmaz (Suh és mtsai., 2004), teszteket végeztünk, összehasonlítva a D. melanogaster, D. simulans és D. suzukii intra és interspecifikus válaszait minimum 9 ismétlés minden kombinációhoz.

Statisztikai analízis

Egyirányú és kétirányú ANOVA-kat használtak, ezt követte Tukey post hoc tesztje a GraphPad Prism többszörös összehasonlításának kijavítására (7.0a verzió Mac-hez, GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com). Minden vizsgálatban, amely kontrollként levegőcsöveket tartalmazott, Welch t-tesztjeivel megerősítettük, hogy a levegőre adott válasz nem különbözött szignifikánsan a 0-tól, és mivel ez mindig így volt, az értékeket nem vették figyelembe. Welch t-tesztjét is használták, hogy összehasonlítsák az idős férfiak hatását a dSO-ra adott válaszra.

EREDMÉNYEK

A választ nem befolyásolta sem a nem (F1,32 = 0,9248, P = 0,3434), sem a párzási állapot F1,32 = 4,098, P = 0,0514), amikor 70 válaszadó dSO-ra 30 válaszadót teszteltek (Ábra 2A, B).

A nem (A és C) és a párzási állapot (B és D) hatása a D. melanogaster felnőttek dSO-re adott válaszára két különböző sűrűségű kibocsátó és válaszadó denzitásnál.

Ugyanakkor 15 válaszadó válasza a 20 kibocsátó dSO-jára mind a nem (F1,29 = 7,191, P = 0,0120), mind a párzási állapot (F1,29 = 8,088, P = 0,0081) szempontjából szignifikáns volt. A nők nagyobb reakciót mutattak, mint a hímek (ez kis mértékben a nagyobb sűrűségnél is így volt), és mindkét nemnél a párosodott egyedek jobban reagáltak, mint a szüzek (2C, D ábra).

A kibocsátók életkorának (A) és nemének (B), valamint a válaszadók életkorának (C) hatása a D. melanogaster felnőttek dSO-ra adott válaszára.

A fotofázis alatt eltelt idő hatását, amelyet a sugárzók és a válaszadók tesztelnek, a D. melanogaster felnőttek dSO-válaszára.

A sűrűség és a stressz-kibocsátók formájának hatását a D. melanogaster felnőttek dSO-reakcióra gyakorolt hatásának vetették alá.

Az idő hatása a dSO (A) perzisztenciájára és az az idő, amely az emittátorok felkavarása óta felmerült a D. melanogaster felnőttek dSO-ra adott válaszára.

Hőtérkép, amely összehasonlítja a D. melanogaster, D. simulans és D.susukii felnőttek válaszát a faj- és heterospecifikus felnőttek által kibocsátott dSO-ra. Az elemzés összehasonlította az összes értéket a D. melanogaster válaszával a fajtársakra.

VITA

Eredményeink alátámasztják azt az elképzelést, hogy a D. melanogaster felnőttek olyan szagjelzéseket bocsátanak ki, amelyek befolyásolhatják a rokonok viselkedését, ha bármilyen stressznek vannak kitéve. Részben ez valószínűleg fiziológiai változások eredménye, amint azt az örvényelt méheknél látták (Bateson, Desire, Gartside és Wright, 2011), amelyek növelik a dSO fő alkotóelemét képező CO2 termelését (Suh et al., 2004).

A riasztási jelekre adott válasz azonban kontextuális, valószínűleg a kapcsolódó költségek és a szaporodási sikerrel járó előnyök közötti kompromisszumok miatt, amint azt a zöld barack levéltetű (E) -β-farnesén ( Montgomery és Nault, 1978). Ez a helyzet a dSO-ra válaszoló D. melanogaster esetében is. Például a szűz legyek alacsonyabb válaszai a párosodott egyedekhez képest kapcsolódhatnak a párzási lehetőségekhez, mivel a Drosophila felnőttek becsült átlagos élettartama terepi körülmények között körülbelül 3-7 nap (Rosewell & Shorrocks, 1987). Így, bár a telephelyet elhagyó szűz és párosított személyek számára is előnyös lenne a potenciális veszély elkerülése, a fajfiakkal rendelkező telephelyet elhagyó szüzek csökkentik annak esélyét, hogy társat szerezzenek.

Számos kísérletünk adatai azt mutatják, hogy a párosodott hímek alacsonyabb válaszszintet mutatnak, mint az azonos korú párosított nőstények, ami ismét a reprodukciós siker szempontjaira vonatkozhat. Minél több társ van egy hímnél, annál magasabb lesz potenciális reprodukciós élettartama (pl. Royer & McNeil, 1993), így a dSO-ra adott alacsonyabb válasz növelheti esélyeit egy fogékony nővel való találkozásra. Hasonlóképpen, ha veszélyes helyen tartózkodik, csökkenhet a párosodott nőstény rövid távú petevetésének lehetősége, tekintettel arra, hogy egy párosítás elegendő spermiumot biztosít számára a teljes petesejt-bók megtermékenyítéséhez, így a távozás növelné a túlélési esélyeket, és növelné a későbbi petevetés lehetőségeit. Hasonlóképpen, a dSO-val kapcsolatos életkorhoz kapcsolódó válasz hiánya nem meglepő, mivel bár a legmagasabb napi tojástermelés az első hét folyamán következik be (Tatár, Promislow, Khazaeli és Curtsinger, 1996), a potenciális veszélytől való elmozdulás kiterjesztheti az ovipozíció jövőbeli lehetőségei. Ezzel ellentétben, mivel a férfiak párzási lehetőségei az életkor előrehaladtával csökkennek (lásd Ruhmann, Koppik, Wolfner és Fricke, 2018), az idősebb férfiaknak kevesebb vesztenivalójuk lenne, mint a fiataloknak a jövőbeli szaporodás szempontjából.

A D. melanogaster és a D. simulans válaszai mind a fajlagos, mind a heterospecifikus jelekre mindig magasak voltak, míg a D. suzukii reakciója alacsony volt minden forrásra. Krause Pham és Ray (2015) megjegyezte, hogy a fiatalabb gyümölcsök magasabb CO 2 -szintet bocsátanak ki, és feltételezték, hogy a D. suzukii felnőttek alacsony reakciókészsége megkönnyíti a megfelelő helyek táplálkozását. Ezenkívül a rendelkezésre álló táplálkozási/peteérési helyek természetes ökológiai körülmények között tapasztalható nagy bősége és eloszlása általában a D. suzukii alacsony térbeli sűrűségét eredményezné, így a gyorsan eloszló fajlagos riasztási jelre reagálva elért relatív előny korlátozott lenne . Ezzel szemben a D. melanogaster és a D. simulans relatív sűrűsége nagyobb lenne az erjesztő gyümölcsöknél, így nagyobb a valószínűsége annak, hogy a dSO-t kimutassák a közeli rokonokból, és reagálni tudjon egy közeli veszélyforrásra.

Az egyetlen faj, amely a heterospecifikus, nem pedig a fajspecifikus fajokra adott magasabb reakciót, a D. simulans volt, amire számítani lehet, ha a CO2 mellett a dSO-ban fajspecifikus komponensek is találhatók (Enjin & Suh, 2013; Suh et al., 2004). Még ha fajspecifikus is van, a D. melanogaster és a D. simulans heterospecifikus reakciókra adott magas válaszai arra utalnak, hogy a stressz által okozott legyek önmagában elegendő mennyiségű CO2-t adnak ki a válaszok kiváltására és/vagy hogy a két faj más dSO közös komponensekkel rendelkezik. Nyilvánvaló, hogy további kutatásokra van szükség annak megállapításához, hogy vannak-e más komponensek a dSO-ban az egyes fajoktól, és annak meghatározásához, hogy ezek mennyiben változtatják meg az elkerülő viselkedést. Továbbá, miután minden összetevőt azonosítottak, meg lehet határozni, hogy a profilok milyen mértékben változnak az életkor, a párosodási állapot vagy a fájlok által okozott stressz típusa szerint. Ez az információ fontos lesz, ha megvizsgáljuk a dSO potenciális felhasználását a kártevő-kezelési programokban olyan fajok ellen, mint a D. melanogaster, bár eredményeink szerint egy ilyen megközelítés nem lenne olyan hatékony a D. suzukii ellen.

A D. melanogaster nagyszerű modell a neuro-genetikai vizsgálatokhoz, mivel rendelkezésre állnak olyan inszertek és deléciók, amelyek lefedik a teljesen azonosított genom, RNAi könyvtárak és transzgénikus vonalak nagy részét, bizonyos gének expressziójának visszaszorítására vagy fokozására (Hales, Korey, Larracuente És Roberts, 2015). Eredményeink jobban megértik azokat a paramétereket, amelyeket figyelembe kell venni a dSO kimutatását, a rovar szaglás neurofiziológiai aspektusainak jobb megértését célzó jövőbeni munkában.

Az eredmények azt is mutatják, hogy a legyek átadására alkalmazott rendszeres technikák dSO felszabadulást eredményeznek, és hogy míg a szagló jel gyorsan eloszlik, a stresszes legyek legalább egy órán keresztül tovább bocsáthatnak ki. A manipuláció ezen hatásai fontos zavaró tényezők lehetnek a viselkedés bizonyos aspektusainak tanulmányozásakor, amint az az agressziót vizsgáló tanulmányokban is látható (Trannoy, Chowdhury és Kravitz, 2015). Következésképpen azt javasoljuk, hogy bárki, aki kutatást végez a Drosophila viselkedésével kapcsolatban, alkalmazza a fényválaszt megközelítést a legyek átadásakor.

ÖSSZEFÉRHETETLENSÉG

A SZERZŐ HOZZÁJÁRULÁSAI

Az adatgyűjtést és -elemzést RTY, EL, ISM, SC, ISM, AFG és MS végezte; Az AFS és a JNM által kidolgozott protokollok; az első tervezetet az RTY, az EL és az AFS, a véglegeset pedig az RTY, az AFS és a JNM írta.

ETIKAI MEGJEGYZÉS

A gerinctelenek vizsgálatához nincs szükség a Western állatgondozási bizottságának, illetve a tartományi és szövetségi szabályozó testületek jóváhagyására. Ugyanakkor megfelelő tenyésztési feltételeket biztosítottunk, és CO2-t vagy hideg érzéstelenítést alkalmazva altattuk a legyeket, amikor a kolóniák fenntartása érdekében manipuláltuk a legyeket. A dSO előállításához szükséges stresszkezelések nem eredményeztek mortalitást

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Ezt a munkát egy Western Science alapszakos elődolgozat-díj és egy belső diplomás ösztöndíj támogatta az RTY-nek, a Western Foundation belső támogatása és az NSERC Discovery Grants 04507-2015 a JNM-nek és 04275-2015 az AFS-nek. Köszönjük Ian S. McDonaldnak a technikai hozzájárulást, Yanira Jimenez Padillának és a Sinclair laboratóriumnak a Drosophila suzukii táplálékának biztosítását a kísérlet ideje alatt.

Lábjegyzetek

Ezek a szerzők egyetemi hallgatók voltak az adatgyűjtés idején