A fakultatív fehérje szelénáció szabályozza a redox érzékenységet, a zsírszövet termogenezisét és az elhízást

Keresse meg ezt a szerzőt a Google Tudósban
Keresse meg ezt a szerzőt a PubMed oldalon
Keresse meg ezt a szerzőt ezen a webhelyen
Levelezés céljából: Mark_Jedrychowski @ hms.harvard.eduEdwardT_Chouchani @ dfci.harvard.eduBruce_Spiegelman @ dfci.harvard.edu

Közreműködött: Bruce M. Spiegelman, 2020. március 27. (felülvizsgálatra elküldve 2020. január 24.; David J. Mangelsdorf és Lucia A. Seale áttekintve)

Jelentőség

A ciszteinek reaktív oxigénfajokkal történő oxidációja (ROS) termogenezist indít el a barna és a bézs zsírszövetekben. A sejtszelenolok, ahol a szelén helyettesíti a ként, fokozott reakcióképességet mutatnak az ROS-szal. Itt kifejlesztettünk egy tömegspektrometriás módszert a szelenolok fehérjékbe való beépülésének vizsgálatára. Ez a megközelítés váratlanul feltárta a szelén fakultatív beépülését olyan fehérjékbe, amelyekben nincs szelektocisztein kanonikus kódolása. A szelént szelektíven beépítették a kulcsfontosságú metabolikus fehérjék szabályozó helyeibe, ideértve az UCP1 253. helyzetében levő ciszteint helyettesítő szelenociszteint az 1-es fehérjét (UCP1). Figyelemre méltó, hogy az étrendi szelénpótlás fokozta a fakultatív beépülést az UCP1-be, megnövelte az energiafelhasználást a termogén zsírszöveten keresztül, és védett az elhízás ellen. Ezek a megállapítások együttesen feltárják a fakultatív fehérje szelénáció létezését, amely korrelál a termogén adipocita működésre gyakorolt hatásokkal.

Absztrakt

Eredmények

Tömegspektrometriás módszer a szelenociszteint tartalmazó fehérjék azonosítására.

Először kidolgoztunk egy célzott MS megközelítést a Sec-tartalmú peptidek meghatározására. A Cys-hez hasonlóan a Sec is hatékonyan és irreverzibilisen reagál tiolszármazékokkal, például N-etil-maleimiddel (NEM) és jódacetamiddal (IAM), amelyeket tipikusan a redox-proteomikus munkafolyamatokban használnak (9). Ezért elvileg a Sec-tartalmú peptidek könnyen azonosíthatók egy külön tömegeltolódással, amely megfelel a Sec + a derivatizálószer kovalens konjugátumának tömegének (9, 10). Fontos, hogy a szelén olyan természetben előforduló stabil izotópokat mutat, amelyek egyetlen más elemben sem találhatók meg. A legelterjedtebb izotóp, a 80 Se (összesen ~ 50%) mellett további négy stabil izotóp elegendő természetes bőséggel rendelkezik, hogy az MS megkülönböztesse őket, így egyedi izotópos aláírást generálva (SI függelék, S1A ábra). Ezért egy jóhiszemű cisztein-szelenocisztein szubsztitúciót tartalmazó peptid az alábbi elemeket mutatja az MS elemzés során. A Cys-lokuszban Sec-nek tulajdonítható fragmens-spektrum tömeggel kell rendelkezniük (1B ábra, alul), amely tömegben eltolható a Sec-reaktív nukleofilekkel végzett derivatizálás révén a Sec + derivatizálószer tömegéhez (1B ábra, Közép) . Ezenkívül ennek a peptidnek meg kell mutatnia az egyedülálló Sec tömegű izotóp ujjlenyomatot (1B ábra, felső rész).

Az UCP1-Sec253 validálása és számszerűsítése.

A feltételezett UCP1 szeléntartalmú peptid azonosságának igazolására létrehoztunk egy szintetikus peptidet, amely azonos az endogén UCP1 Cys253 peptiddel, szelenocisztein helyettesítővel a 253. pozícióban és izotóposan nehéz tirozinnal (AQUA [Absolute Quantification] peptid + 10.0272 Da; SI függelék)., S3 ábra A és B). Ez a molekula lehetővé teszi az endogén szelénezett peptid azonosítását és mennyiségi meghatározását. Az UCP1 Sec253 jelenlétének meghatározására a barna zsírproteomban az AQUA standardot egy különálló izobár tandem tömegjelző (TMT) riporterrel derivatizáltuk. Ily módon az AQUA peptid lehetővé teszi az endogén peptid multiplexeléssel történő azonosítását (SI függelék, S3D. Ábra). Megállapítottuk, hogy az endogén UCP1 peptid fiziokémiai tulajdonságai azonosak az AQUA standarddal, megerősítve a Sec jelenlétét az UCP1 253. pozíciójában (SI függelék, S3D ábra).

Az AQUA belső standard alkalmazása lehetővé tette a cisztein szelénpótlásának sztöchiometriájának megbecsülését a 253. pozícióban. Megvizsgáltuk a vad típusú (WT) hím egerek szelénezésének sztöchiometriáját standard tartási körülmények között. Ebben az esetben a szelén beépülését a teljes UCP1 fehérje ~ 4-5% -ára becsülték (2A. Ábra). Ilyen körülmények között tehát úgy tűnik, hogy az UCP1 kis, de jelentős része szelénált formában létezik.

A szelenocisztein beépülésének jellemzése az UCP1 253 lokuszba. (A) Az UCP1 szelenocisztein 253 formájának aránya belső standard AQUA peptidek alkalmazásával becsült. (B) Az UCP1 szelénsav- és szulfénsav-formáinak relatív bősége; n = 3. (C) A WT és az UCP1KO barna adipocita lizátumok autoradiogramja, nátrium-75 Se-selenittel kezelve a differenciálás során. A 20-25 kDa-os régió kiemelkedő sávja a jól bejáratott GPx szelenoprotein családot jelzi. Nincs megfigyelhető jel az UCP1 (~ 33 kDa) molekulatömegű (MW) régiójában. (D) Az UCP1 szelenocisztein formájának viszonylagos változásai nátrium-szelenittel kezelt barna adipocitákban; n = 3. (E) Az UCP1 szelenocisztein formájának relatív változásai szelenometioninnal kezelt barna adipocitákban; n = 3. (F) Relatív változások az UCP1 szelenocisztein formájának tartalmában szelenociszteinnel (SeCys) kezelt barna adipocitákban; n = 3.

Korábban azt tapasztaltuk, hogy az UCP1 Cys253 tiol oxidatívan átalakulhat szulfénsavvá a termogenezis in vivo aktivációja révén, amely fiziológiai inger növeli a BAT ROS szintjét. Ezenkívül a maradék mutagenezise és farmakológiai manipulációja alapján a hely módosítása elegendő az UCP1 működésének befolyásolásához. A Sec rendkívüli érzékenységet mutat az oxidatív módosítással szemben a Cys-hez képest, ezért megvizsgáltuk, hogy a szelénált UCP1 érzékenyebb-e az oxidatív módosításokra. Figyelemre méltó módon azt tapasztaltuk, hogy a kiindulási körülmények között, amikor a Cys253 túlnyomórészt módosítatlan, a Sec253 lényegében szelénsavvá oxidálódik (2B. Ábra). Ezért az UCP1 Sec253 formája a fehérje jelentős és elkülönülő készletét képviseli, amely nagyon érzékeny az oxidációra.

A szelén fakultatív beépülése a fehérjékbe egy nem kánonikus úton halad.

Ezt követően megvizsgáltuk, hogy a szelén hogyan épülhet be olyan fehérjékbe, mint az UCP1, amelynek szekvenciája nem tartalmaz nyilvánvaló kódolást a Sec beépüléshez a kialakult kotranslációs utakon keresztül. A szelén Sec-ként történő transzlációs beépülését megkönnyíti egy külön transzfer RNS (tRNS) töltési mechanizmus, amely szervetlen szelenitet használ a szelén forrásaként. Ezenkívül a szelén szerves formái a szelén vagy származékainak felszabadulásával hozzájárulhatnak ehhez a kotranslációs útvonalhoz. Ez a beépülési mód fehérje autoradiográfiával figyelhető meg a 75 Se-szelenit kiegészítését követően. 75 Se-selenittel kezelt barna adipociták robusztus jelölést mutattak a fehérjéknek a jól megalapozott szelenoproteineknek megfelelő molekulatömegű jelöléssel, de az UCP1-nek megfelelő molekulatömegnél nem figyeltek meg jelet (2C. Ábra). Ennek ellenére az MS könnyen észrevehette a Sec253 beépülését az UCP1-be a barna adipocita fehérjéből, ami arra utal, hogy a fakultatív Sec beépülés ettől a kotranslációs úttól függetlenül történik.

Ennek további tesztelésére az elsődleges barna adipocitákat növekvő koncentrációjú nátrium-szelenitben kezeltük a differenciálódás során, amikor az UCP1 fehérje de novo magas szinten keletkezik. Ahogy az várható volt, a nátrium-szelenit növelte a klasszikus szelenoproteinek számát, amelyek esetében Sec-beépülés kotransláción keresztül történik (SI függelék, S3E. Ábra). Ilyen körülmények között azonban a nátrium-szelenit nem volt hatással az UCP1-Sec253 szintjére (2D. Ábra). Ezt követően megvizsgáltuk, hogy a szelén más formái hozzájárulhatnak-e a fakultatív beépüléshez a fehérjékbe. A szelén szerves formái a szelén egyik fő forrása, és a szelenitből mikrobák és sok más organizmus szisztémás anyagcseréjén keresztül keletkezhetnek. A szerves szelén legelterjedtebb formái közé tartozik a szelenometionin. Amikor a barna adipocitákat szelén-metioninnal egészítették ki a differenciálás során, az UCP1 Sec253 formájának aránya jelentősen megnőtt (2E. Ábra). Érdekes módon ezt nem figyelték meg, amikor a sejteket kiegészítették a szelén másik fő szerves formájával, a szelenociszteinnel (szelenocisztin formájában, amely a szelenocisztein oxidált formája) (2F ábra).

Fontos, hogy a Sec253-at tartalmazó UCP1 triptikus peptidje két metionint is tartalmaz. Ezért ennek a peptidnek a szelénmetioninnal végzett kezelést követően megfigyelt növekedése a selenocisztein helyett a szelenometionin beépülésének tulajdonítható. E két lehetőség megkülönböztetésére megvizsgáltuk a szelénezett UCP1 triptikus peptid fragmens spektrumát. A Cys és Met lókuszon átívelő b és y ionok vizsgálatával azt találtuk, hogy a szelén-addíció kizárólag a 253. pozíciónak tulajdonítható (1. ábra D – G és SI függelék, S3E ábra).

Az étrendi szelénpótlás módosítja a kötelező és a fakultatív szelenoproteineket, de eltérő étrendi koncentrációban.

Az étrendi szelén differenciálisan módosítja a fehérjék kanonikus és fakultatív szelénezését. (A) A BAT ezen vizsgálatában feltérképezett és 0,1–0,4 ppm diétás nátrium-szelenit által modulált kanonikus szelenoproteinek expressziója; n = 5. (B) A BAT metabolikus fehérjékbe történő szelektív fakultatív szelenocisztein inszerció azonosítása; n = 5. (C) A BAT metabolikus fehérjékbe történő szelektív fakultatív szelenometionin-inszerció azonosítása; n = 5. (D) A szelektív fakultatív szelenometionin és szelenocisztein beillesztése az s.c. fehér zsírszöveti fehérjék; n = 5. (E) 2,25 ppm étrendi szelén növeli a Sec253 UCP1 mennyiségét; n = 5.

Számos olyan esetet is azonosítottunk, amikor a szelén szelén-metioninként szelektíven, véletlenszerűen beépült a metionint kódoló lókuszokba (3C. Ábra). A szelenometionin inszerció célpontjainak többsége szintén fő metabolikus enzimek és zsírsavat kezelő fehérjék voltak. Ezenkívül egyes fehérjék, mint például a zsírsavat kötő fehérje 4, külön-külön mutatják be a szelenocisztein és a szelenometionin beépülését (3. B és C ábra). Ezzel párhuzamosan megvizsgáltuk a szubkután fehér zsírszövetet a fakultatív szelenometionin és a szelenocisztein helyek jelenlétére nézve. Egy fakultatív szelenocisztein és egy szelenometionin helyet azonosítottunk (3D ábra). Ezután azt vizsgáltuk, hogy a fakultatív szelenocisztein és szelenometionin helyeket tartalmazó fehérjéket kódoló transzkriptumok mutatnak-e valamilyen szerkezeti jellemzőt, ami a kotranslációs szabályozó elemekre utalna.

Fakultatív szelénezéssel fehérjéket kódoló gének genomi sajátosságai.

Az étrendi szelén állapota szabályozza a zsírszövet termogenezisét és módosítja az obezogenezist.

Nevezetesen, 0,1–0,4 ppm étrendi szelén elegendő volt a klasszikus szelenoprotein expressziójának maximalizálására BAT-ban. Az UCP1-Sec253 számszerűsítésével azonban megállapítottuk, hogy ennek a helynek a szelénációját csak 2,25 ppm szelenit növeli (3E. Ábra). Ezért a kötelező szelenoprotein szintézis és az UCP1 fakultatív szelénálás küszöbértéke egyértelműnek tűnik.

Mivel az étrendi szelén emelése elegendő volt a BAT termogenezisének β3-adrenoreceptor agonizmus általi fokozásához, feltártuk, hogy ez a beavatkozás módosíthatja-e a magas zsírtartalmú táplálkozásra adott fiziológiai választ. Összehasonlítottuk 1) az egereket, amelyek magas zsírtartalmú étrendet (HFD) fogyasztottak, kiegészítve 0,1 ppm étrendi szelinnel, amely szint elegendő a szelenoproteinek BAT-ban történő expressziójához (3A. Ábra), és nincs hatással a BAT termogenezisére (4. ábra D – F ); és 2) egerek 2,25 ppm étrendi szelénnel kiegészített HFD-t fogyasztanak, ami elegendő ahhoz, hogy a BAT-ban megemelje a fakultatív UCP1 szelénációt (3C. ábra) és stimulálja a BAT termogenezisét (4. ábra D – F). Amint a 4. G és H ábrán látható, a 2,25 ppm szelén-étrendet felvevő egerek robusztus védelmet mutattak a súlygyarapodás ellen a 14 hetes zsírtartalmú táplálkozáskor. Sőt, ez a hatás kifejezetten a zsírtömeg csökkenésének tulajdonítható (4I. Ábra). Nevezetesen ez az elhízás elleni védelem annak ellenére következett be, hogy nem volt észlelhető változás az élelmiszer-bevitelben (4J ábra), és hiányzott a májgyulladás vagy a fibrózis emelkedése (4K ábra és SI függelék, S6 ábra).

Vita

Ezek az eredmények együttvéve nem kanonikus paradigmára utalnak a fokozott redox érzékenység és funkcionalitás kódolásához a fehérjékben. Sőt, bebizonyítják, hogy a szelénállapot módosítása az étrendben viszonylag egyszerű eszköz lehet a zsírszövetekben a termogén funkció javítására és az emberek elhízásának módosítására.

Mód

Állatkísérletek.

Az állatkísérleteket a korábban leírtak szerint hajtották végre (3), a Beth Israel Deaconess Medical Center intézményi állatgondozási és felhasználási bizottságának jóváhagyásával. Az egerek C57BL/6J hímek voltak (12 hetes kor; Jackson Laboratories), és egy szabályozott hőmérsékletű (23 ° C) helyiségben voltak elhelyezve, 12 órás világos-sötét ciklusban.

Elsődleges barna adipocita előkészítés és differenciálás.

Az interscapularis barna zsírsztrómás vaszkuláris frakciót a korábban leírtak szerint kaptuk (3).

Minta előkészítés a tömegspektrometriához.

A mintákat 100 mM NaCl-ot, 100 μM dietilén-triamin-pentaacetátot (DTPA), 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot (SDS), 0,5% nátrium-dezoxi-kolátot, 0,5% Triton X-100, 0,5 mM tris-t ( 2-karboxi-etil) -foszfin (TCEP) és a kísérlettől függően 50 mM jód-acetamid vagy 50 mM NEM. 15 percig tartó inkubálás után SDS-t adtunk 1% -os végkoncentrációhoz, és a mintákat további 15 percig inkubáltuk.

Fehérje emésztés.

A fehérjepelleteket szárítottuk, és 50 mM Hepes-t (pH 8,5) tartalmazó 8-M karbamidban szuszpendáltuk. A fehérjekoncentrációkat bicinchonininsav-vizsgálattal (ThermoFisher Scientific) mértük a proteáz emésztése előtt. A fehérje-lizátumokat 4-M karbamidra hígítottuk és LysC-vel (Wako, Japán) emésztettük 1/100 enzim/fehérje arányban egy éjszakán át. A fehérjekivonatokat tovább hígítottuk 1,0-M karbamid-koncentrációra, és tripszint (Promega) adtunk az 1/200 enzim/fehérje végső arányhoz 6 órán át 37 ° C-on. Az emésztéseket 20 μl 20% -os hangyasavval (FA) savanyítottuk pH = 2 értékre, majd C18 szilárd fázisú extrakciónak vetettük alá (50 mg SepPak, Waters).

LC – MS/MS paraméterek a peptidanalízishez.

Valamennyi spektrumot Orbitrap Fusion tömegspektrométerrel (ThermoFisher Scientific) nyertük, egy Easy nLC 1000 (ThermoFisher Scientific) ultrahagynyomású folyadékkromatográfia (LC) szivattyúval összhangban, a korábban leírtak szerint (3, 18).

A fehérje-tiol-szulfénsavak értékelése.

A BAT-ot az endogén fehérje-szulfénsavak stabilizálásához korábban használt protokoll adaptálásával készítettük (18). Röviden, a mintákat 50 mM Tris bázison homogenizáltuk, amely 100 mM NaCl-ot, 100 μM DTPA-t, 0,1% SDS-t, 0,5% nátrium-deoxi-kolátot, 0,5% Triton-X 100-at és 5 mM dimedont tartalmazott. A lízisfüggő oxidáció minimalizálása érdekében használat előtt puffereket buborékoltattak argonnal. A mintákat 15 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, ekkor SDS-t adtunk 1% végkoncentrációhoz, és a mintákat további 15 percig inkubáltuk. Dimedonkezelés után 10 mM TCEP-t és 50 mM NEM-t adtunk hozzá, és a mintákat további 15 percig inkubáltuk 37 ° C-on az összes nem szulfénsavfehérje-cisztein maradék redukciója és alkilezése céljából. A mintákat ezután fehérje emésztésnek és LC-MS/MS-nek vetettük alá a fent leírtak szerint.

Szelenociszteint és szelenometionint tartalmazó peptidek meghatározása.

Az UCP1 Sec253 peptid mennyiségi meghatározása nehéz standard AQUA peptidek alkalmazásával.

Az ebben a vizsgálatban alkalmazott AQUA peptidek a következők, ahol U * = szelenocisztein és Y = nehéz tirozin 10,027228): AQUA peptid/szekvencia/tömeg (Da) nehéz; UCP1 240–261/FINSLPGQYPSVPSU * AMSMYTK/2477.20; és UCP1 240–261/FINSLPGQYPSVPSCAMSMYTK/2430.149.

A Skyline 19.1.0.193 verzióját alkalmazták az UCP1 253 szelenocisztein és cisztein abszolút és relatív mennyiségének mennyiségi meghatározásához minden kísérletben, nehéz AQUA peptidekkel referenciaként (21).

Fakultatívan szelénezett fehérjék genomikai elemzései.

A szelenit beépülésének meghatározása nátrium 75 szelenit alkalmazásával.

A barna adipocitákat a fent leírtak szerint differenciáltuk. Frissen semlegesített 75 Se-szelenitet adunk a sejtekhez (5 mCi/ml tápközeg) a 0. naptól kezdve, és minden tápközegben változik a differenciálódás a 7. napig. Jelölés után a sejteket összegyűjtjük, lizáljuk, a fehérjéket mennyiségileg meghatározzuk és SDS/poliakrilamidon elválasztjuk. gélelektroforézis. Az elválasztott fehérjéket polivinilidén-fluorid membránokra vittük át, és Typhoon PhosphorImager-rel elemeztük a korábban leírtak szerint (26).

Nátrium-szelenit diétás beavatkozás és magas zsírtartalmú táplálás.

Minden egér diétás és magas zsírtartalmú etetési kísérletet életkornak megfelelő alomtárs kontrollokkal végeztünk. 8 hetes korban az egereket chow-ra [Envigo 99256 – szelénhiányos (SD; 99257–0,1-ppm Se; 01390–0,4-ppm Se; 01391–2,25-ppm Se)] vagy magas zsírtartalmú étrendre (Envigo SD 170392) Meghatározott mennyiségű nátrium-szelenitet tartalmazó 2,25 ppm (Se 170441). Az étrendi beavatkozás 8 hétig folytatódott a molekuláris elemzések előtt.

A testösszetétel elemzése.

A testösszetételt Echo MRI-vel (Echo Medical Systems) vizsgáltuk a 3 az 1-ben Echo MRI kompozíció-analizátorral.

Metabolikus fenotipizálás.

Az egész test energia-anyagcseréjét egy átfogó laboratóriumi állatfigyelő rendszer (CLAMS; Columbia Instruments) alkalmazásával értékeltük. A CO2 és O2 szinteket 30 másodpercenként gyűjtöttük össze. A CL 316 243-at (1 mg kg -1; Sigma-Aldrich;) intraperitoneálisan injektáltuk az egerekbe a megadott időpontokban.

Adatelérhetőségi nyilatkozat.

Az adatok a ProteomeXchange szolgáltatáson keresztül érhetők el, a PXD018225 azonosítóval.

Köszönetnyilvánítás

A munkát a Claudia Adams Barr Program (az ETC-hez és az MPJ-hez), az NIH Grant DK123095 (az ETC-hez), az NIH Grant DK117149 és CA080946 (a VNG-hez), az NIH Grant GM132129 (a JAP-hoz) és a JPB Foundation (a BMS-hez) támogatta. ).

Lábjegyzetek

↵ 1 Kinek lehet címezni a levelezést. E-mail: Mark_Jedrychowskihms.harvard.edu, EdwardT_Chouchanidfci.harvard.edu vagy Bruce_Spiegelmandfci.harvard.edu .

A szerző közreműködései: M.P.M., V.N.G., S.P.G., E.T.C. és B.M.S. tervezett kutatás; M.P.J., G.Z.L., J.S., M.M., R.G., J.A.P., D.K.S., D.L.-B. és L.K. végzett kutatás; és M.P.J., E.T.C. és B.M.S. írta a lap.

Lektorok: D.J.M., a Texas Egyetem délnyugati orvosi központja; és L.A.S., Hawaii Egyetem, Manoa.

A szerzők kijelentik, hogy nincs versengő érdeklődés.

Adatok lerakása: Az adatok a PXD018225 azonosítójú ProteomeXchange szolgáltatáson keresztül érhetők el.