Alacsony fejlettségű méh és csökkent ösztrogén-válaszkészség egerekben az ösztrogénre reagáló ujjfehérje-gén megszakadásával, amely az ösztrogén receptor közvetlen célpontja

Szerkesztette Pierre Chambon, I.G.B.M.C., Strasbourg, Franciaország, és jóváhagyta 1999. augusztus 4-én (felülvizsgálatra érkezett 1999. június 11-én)

Absztrakt

Az ösztrogénre reagáló ujjfehérje (efp) biológiai szerepét in vivo értékeltük olyan egerekben, amelyek gén-célzott mutagenezissel hordozták az efp funkcióvesztését. Bár az efp homozigóta egerek életképesek és termékenyek voltak mindkét nemben, a bőséges ösztrogénreceptor α-t expresszáló méh jelentős fejletlenséget mutatott. Amikor az ovariectomizált homozigótákat 17β-ösztradiol-kezelésnek vetették alá, figyelemre méltóan gyengített válaszokat mutattak ki az ösztrogénre, ezt példaként említi a csökkent intersticiális vízimbiibilitás és a retardált endometrium sejtek növekedése, legalábbis a G1 és az S-fázis progressziójának alacsonyabb arányának tulajdonítható az epithelium sejtek. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy az efp elengedhetetlen a normális ösztrogén által kiváltott sejtproliferációhoz és a méh duzzadásához, mint az α ösztrogén receptor közvetlen célpontjaihoz.

Anyagok és metódusok

efp géncélzási stratégia és Knockout egerek generálása.

Állatok és injekciók ütemezése az ösztrogén érzékenységének becslésére.

A felnőtt F2 nőstényeket a 0. napon petefészek-eltávolításnak vetették alá, és a 28. naptól a 30. napig 17β-ösztradiollal (E2) (20 μg/kg/nap) vagy olívaolajjal (oldószer-kontroll) kezelték őket, és minden egyes méh nedves súlyát E2-vel kezelt vadakból. típusú egereket (+/+) (n = 11), heterozigótákat (+/−) (n = 11), homozigótákat (-/-) (n = 11) és nem E2-vel kezelt egereket mértünk a 31. napon Kiszámítottuk a nedves tömeg (milligramm) és a testtömeg (gramm) arányát. Ezután az egyes mintákból fagyasztott metszeteket állítottunk elő szövettani elemzés céljából. Ezt követően a folyadékfelvétel figyelemmel kísérésére a felnőtt F2 nőstényeket ovariektomizáltuk a 0. napon, és a 28. naptól a 30. napig E2-vel (20 μg/kg/nap) vagy olívaolajjal (oldószer-kontroll) kezeltük, a fentiek szerint. E2-kezelt vad típusú egerek (+/+) (n = 6), homozigóta (-/-) (n = 6) és nem E2-kezelt egerek felszívódását és száraz tömegét a 31. napon mértük. állatokból hosszanti irányban hasítottuk, és a luminalis folyadék eltávolítása céljából blottoltuk, majd a szerveket 60 ° C-os kemencében inkubáltuk 1 napig, majd végül lemértük őket. Kiszámítottuk a nedves és a száraz tömeg közötti különbséget, amely lehetővé tette a víz felszívódásának meghatározását, valamint a méh vízbeszívásának és száraz tömegének (milligramm) és a testtömeg (gramm) arányát.

Állatok és injekciók ütemezése a BrdUrd címkézési kísérlethez.

A felnőtt F2 nőstényeket a 0. napon petefészek-eltávolításnak vetettük alá, és a 28. napon 12 órán át E2-vel (2 μg/kg) vagy olívaolajjal (oldószer-kontroll) kezeltük őket. Az állatok 2 órával azelőtt intraperitoneális BrdUrdrd-injekciót kaptak (30 mg/kg). hogy megölik. Az in vivo BrdUrd jelölést a BrdUrd intraperitoneális injekciójával hajtottuk végre (35). Ezután az E2-vel kezelt vad típusú egerek (+/+) (n = 8), a homozigóta (-/-) (n = 8) és a nem E2-vel kezelt egerek mindegyik méhét keresztirányban három részre osztottuk. Ezt követően három megfelelő, a méhből származó fagyasztott metszetet immunfestettünk anti-BrdUrd monoklonális antitesttel, és kiszámítottuk a BrdUrd-pozitív hámsejtek számának átlagát. A BrdUrd jelölési indexet végül a 4 ′, 6 ′ diamino-2-fenilindollal festett teljes hámsejtekben elért pontszámú BrdUrd-pozitív hámsejtek százalékában számítottuk ki, és legalább 400 sejtet pontoztak.

Northern Blot elemzés.

Minden mintához 5 μg Poly (A) + RNS-t választottunk ki vad típusú (+/+), heterozigóta (+/−) és homozigóta (-/-) egerek méhéből 1% agarózban. A Northern blot analízist a leírtak szerint hajtottuk végre (36). A 32 P-jelölt 1,3 kb méretű EcoRI-XhoI fragmens, amely magában foglalja a tekercs tekercsét és a C-terminális régiót, de nem tartalmazza az egér efp cDNS (24) vagy a glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz cDNS RING ujj doménjét, szondaként használják. Az autoradiográfiát −80 ° C-on intenzívebb szűrővel végeztük 3 napig az egér efp cDNS-próbájával és 1 napig a glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz cDNS-próbával.

Nukleáris kivonatok készítése és Western blot elemzés.

Nukleáris kivonatokat készítettünk egy vad típusú (+/+), egy heterozigóta (+/−) és egy homozigóta (-/-) méhéből a leírás szerint (37). Harminc mikrogramm magkivonatot oldottunk fel elektroforézissel 15% SDS poliakrilamid gélen. Az immunfoltos membránt anti-egér efp antitesttel (24) reagáltattuk (1: 5000), torma-peroxidázzal (HRP) (1: 7500) konjugált anti-nyúl IgG-vel (Fc) kezeltük, majd ECL alkalmazásával detektáltuk. detektáló reagensek (Amersham Pharmacia).

Immunhisztokémia.

Az immunhisztokémiát a leírás szerint hajtottuk végre (36). Egy 8 hetes ICR egér méhének fagyasztott szakaszait reagáltattuk anti-egér efp antitest alkalmazásával (24). Ezt követően biotinilezett anti-nyúl IgG antitestet reagáltattunk, és tormaperoxidáz (HRT) -streptavidint és szubsztrátoldatot adtunk hozzá. Ezután a metszeteket kissé festette a hematoxilin. Ezenkívül a BrdUrd jelölési index kiértékeléséhez az egyes genotípusokból (+/+, -/-) BrdUrddal kezelt méh fagyasztott szakaszait állítottuk elő, majd immunfluoreszcenciát használtunk anti-BrdUrd monoklonális antitest alkalmazásával (Caltag, South San Francisco, CA) a leírtak szerint hajtottuk végre (35). FITC-vel anti-egér IgG-vel (Jackson Immuno-Research) festettük őket, és 25% -os glicerinbe ágyazottuk 4 ', 6' diamino-2-fenilindollal (Sigma).

Eredmények

Az efp homozigóta mutánsok normálisan nőttek, és nem mutattak nyilvánvaló külső hibát a fenotípusban. Még termékenyek voltak mindkét nem számára. Ezért megvizsgáltuk az ösztrogén célszerveit tiszta, 129 SV genetikai háttérrel rendelkező F2 állatokban. Először megvizsgáltuk a méh szarvának méretét és súlyát 10 hetes F2 utódoknál. A menstruációs ciklus szekréciós szakaszában számos méhet gyűjtöttünk az F2 utódoktól a hüvelyi kenet ellenőrzésével. A homozigóta egerek méhe szignifikánsan kisebb volt (2A. Ábra), ami a méh és a testtömeg arányát mutatja 36% -kal alacsonyabb, mint a vad típusú egereké (2B. Ábra), bár a teljes testtömegben nem volt szignifikáns különbség közöttük. A homozigóta egerek méhsejtjeiben azonban hematoxilin- és eozinfestéssel nem észleltünk szövettani rendellenességet (az adatokat nem mutatjuk be). A heterozigóták méhei is általában kisebbek voltak, de a vad típusú egerekhez viszonyított különbség statisztikailag nem volt szignifikáns (2B. Ábra). Fennáll annak a lehetősége, hogy az efp haploinsufficiency bizonyos mértékben befolyásolja a méh fejlődését. Ezzel szemben a máj súlya az F2 állatokban megközelítőleg azonos volt (az adatokat nem mutatjuk be).