A neuronális apoptózis gátló protein 1 (NAIP1) törölt egerek hippokampusos neuronjai fokozott sebezhetőséget mutatnak a kaininsav által okozott sérüléssel szemben.

Szerk .: W. Maxwell Cowan, Howard Hughes Orvostudományi Intézet, MD, Chevy Chase, jóváhagyva 1999. december 17-én (1999. október 29-én érkezett felülvizsgálatra)

Absztrakt

A neuronális apoptózist gátló fehérje (NAIP) az apoptózis (IAP) fehérjék inhibitorainak új családjába tartozik. Az IAP gének nagymértékben konzerválódnak a bakulovírustól a metazoánokig, és elnyomják a különböző kiváltó okok által kiváltott apoptózist mind in vitro, mind in vivo. Itt leírjuk az egerek generálását és jellemzését a NAIP1 célzott törlésével. Bemutatjuk, hogy a NAIP1-deletált egerek normálisan fejlődnek. Azonban a piramidális idegsejtek túlélése a hippocampusban a kaininsav által kiváltott limbikus rohamok után nagymértékben csökken a NAIP1 knock-out állatokban. Így, noha a NAIP1 nem szükséges az egér központi idegrendszerének normális fejlődéséhez, az endogén NAIP1 szükséges a neuronok túléléséhez patológiás körülmények között.

Az apoptózis kritikus szerepet játszik a sejthalál szabályozásában a perifériás és a központi idegrendszerben (CNS) mind fiziológiai körülmények között, mind pedig a neurológiai betegségben. Az apoptózis diszregulációja krónikus neurodegenerációkban, például Alzheimer-kórban, amiotróf laterális szklerózisban, Parkinson-kórban, valamint epilepsziában és iszkémiában fordul elő (1). A gerinc izom atrófiája (SMA) egy neurodegeneratív rendellenesség, amelyet a gerincvelő motoros neuronjainak fokozatos elvesztése jellemez. A közelmúltban javaslatot tettünk a nem megfelelő apoptózis és az SMA súlyosságának modulációja közötti kapcsolatra. Megmutattuk, hogy a neuronális apoptózist gátló fehérje (NAIP) az SMA-betegek jelentős részében törlődik (2). A teljes hosszúságú funkcionális NAIP hiányzik a legtöbb, I típusú SMA-val rendelkező egyénnél, és szoros összefüggés van a központi idegrendszeri NAIP regionális megoszlása és az SMA neurodegeneratív változásai között (3). Ezek a megfigyelések összhangban vannak az SMA neurodegeneratív jellegével. Bár az SMA-ban részt vevő ok-okozati génről úgy gondolják, hogy az SMN (túlélő motoros neuron) gén (4), a NAIP szerepét az SMA-ban moduláló jellegűnek javasolják, ami súlyosbítja a betegség súlyosságát (5).

A NAIP gén egy nemrégiben azonosított apoptózis belső sejtszabályozók családjának tagja, amely az apoptózis (IAP) géncsalád inhibitora (6). Az IAP-géneket kezdetben a bakulovírusokban fedezték fel, de homológjaikat azóta más vírusokban, rovarokban, madarakban és emlősökben azonosították, ami közös evolúciós eredetre utal (7). Figyelemre méltó, hogy az IAP fehérjék elnyomják a kiváltó okok sokfélesége által kiváltott apoptózist, amely nagyobb, mint bármely más antiapoptotikus gén esetében, ideértve a bcl-2 családot is (8). Úgy gondolják, hogy az IAP gének működési módja a legfontosabb kaszpázok és prokaszpázok (elsősorban a 3. és 7. kaszpáz) közvetlen megkötése és gátlása (9–12). Jelentősen kimutattuk, hogy a tranziens előagyi ischaemia szelektíven megemeli a NAIP szintjét az ischaemiás károsodásokkal szemben rezisztens neuronokban. Ezenkívül a NAIP méhen kívüli túlzott expressziója a központi idegrendszerben csillapította az átmeneti előagyi ischaemia által okozott idegsejtkárosodást, ami arra utal, hogy a NAIP kulcsszerepet játszik a neuroprotekcióban (13.

Az IAP gének szerepét a programozott sejthalál szabályozásában és modulálásában főleg az in vitro kísérletekből következtették. Az endogén IAP gének in vivo fiziológiai szerepei kevésbé egyértelműek, mivel a knock-out modellekből hiányzik az adat. Jelen cikkben a NAIP1 kiütéses egerek létrehozását és jellemzését írjuk le. Megmutattuk, hogy a Naip1 célzott deléciójával rendelkező egerek morfológiailag normálisak és nem mutatják az SMA jellemzőit. A Naip1 törlése azonban a hippocampus piramis idegsejtjeinek fokozott érzékenységét eredményezi a kaininsav (KA) által kiváltott epilepsziás rohamok által okozott apoptotikus halál iránt. Adataink azt mutatják, hogy a NAIP1 endogén, fiziológiai szintje kritikus szerepet játszik a neuroprotekcióban.

Anyagok és metódusok

A Naip1 -/- egerek generálása.

Limbikus rohamok kiváltása.

A KA-t (Aldrich Chemical, Milwaukee, WI) 10 mM PBS-ben oldjuk és i.p. injekció. Egy előzetes vizsgálatban 45 mg/kg dózist állapítottak meg elegendőnek a görcsroham kiváltására a sigmaplot statisztikai csomaggal rendelkező egerek 95% -ánál (Jandel Scientific, San Rafael, Kalifornia).

Eredmények és vita

A Naip1 gén célzott megszakadásának sematikus rajza egerekben. (A) Az egér Naip1 lókuszának 5'-végének, a pKO.naip1 vektort célzó vektorának és a megcélzott Naip1 allélnak a szerkezete látható. A szilárd dobozok exonokat jelölnek; a restrikciós helyeket függőleges fekete vonalak jelzik (E, EcoRI; RV, EcoRV; S, SstI). A genomi Southern blot elemzéshez használt próba helyzetét a fekete négyzet, a reverz transzkripció-PCR primerek helyzetét pedig nyílhegyek jelzik. (B) Az embrionális őssejtekből származó EcoRI által emésztett genomi DNS Southern-blot elemzése a célzott (4,8 kb) és a vad típusú (7,5 kb) allélok jelenlétét jelzi. (C) Az EcoRI által emésztett genomi DNS Southern blot elemzése homozigóta mutánsból (-/-), hetorozigóta (+/−) és vad típusú (+/+) Naip1 egérből (249. vonal). (D) Naip1-null és vad típusú egerek agyi mRNS-jének reverz transzkripciós-PCR-elemzése. A Naip1-specifikus PCR primereket (21) használtuk a Naip1 cDNS amplifikálására az 1. és 4. exon között. Az aktin 200 n-os fragmensét pozitív kontrollként amplifikáltuk.

A Naip1 -/- egerek normálisnak tűntek, és nem mutattak következetes szövettani vagy morfológiai rendellenességeket. A Naip1 -/- egerek megjelenése, nemi aránya, alommérete és súlygyarapodása hasonló volt Naip1 +/+ alomtársaikkal. Ezen túlmenően az agyméretek nem voltak megkülönböztethetők a két állatcsoport között, ami arra utal, hogy nincs bruttó idegsejtvesztés (1. táblázat). Végül a magatartás és a térbeli tanulás átfogó vizsgálata, beleértve az érzékszervi és motoros funkcióteszteket, a 24 órás aktivitást, a rottóbot teszteket, a Morris víztesztet és a fészeképítést, nem mutatott ki szignifikáns különbséget a Naip -/- állatok és vad típusaik között. alomtársak (az adatokat nem közöljük). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a Naip1 célzott megzavarása nincs káros hatással az egér központi idegrendszerének fejlődésére és megfelelő működésére. Több Naip-homológ jelenléte egerekben lehetetlenné teszi annak megismerését, hogy a megfigyelt funkcionális redundancia átterjed-e a többi ép Naip lókuszról, nem-NAIP génről vagy ezek kombinációjáról.

A Naip1 gén célzott deléciójának hatása a kiválasztott paraméterekre

Annak a hipotézisnek a tesztelésére, hogy a Naip1 szükséges az idegsejtek apoptotikus rezisztenciájához, a Naip1 -/- és a vad típusú egereket egyetlen i.p. KA injekció (45 mg/kg). A KA hasonló intenzitású limbikus rohamokat produkált, függetlenül azok Naip1 státuszától (2. táblázat), ami arra utal, hogy a rohamok létrehozásának mechanizmusa független a Naip1-től. Az ISEL-pozitív magokat csak a CA3 almező piramidális neuronjaiban figyelték meg a hippocampusban mindkét állatcsoportban, és a központi idegrendszer fennmaradó része normálisnak tűnt. A hasonló roham pontszámokkal ellentétben a neuronpusztulás szintjén jelentős különbség volt, amit a DNS-fragmentáció jelzett, a Naip1 -/- egerekben megfigyelt ISEL-pozitív sejtek számának 2,5-szeres növekedésével összehasonlítva vad vadjaikkal típusú alomtársak (2. ábra).

A Naip1 deléció hatása a roham súlyosságára kainate beadása után