A Foxa3 szárnyas spirál transzkripciós faktor szabályozza az adipocita differenciálódást és a depó-szelektív zsírszövet-bővítést

ABSZTRAKT

A mesenchymális őssejtek átalakulása terminálisan differenciált adipocitákká válik a szabályozott transzkripciós lépéseken keresztül. Noha egyértelmű, hogy az adipocita érés késői fázisait a nukleáris receptor peroxiszóma proliferátorral aktivált gamma receptor (PPARy) szabályozza, a differenciálódás kezdeti szakaszainak transzkripciós szabályozásáról kevésbé lehet tudni. A korai szabályozók azonosítása érdekében egy kis interferáló RNS (siRNS) szűrést végeztünk a Forkhead-box gének adipocitákban, és itt mutattuk be először, hogy a Foxa3 szárnyas hélix faktor elősegíti az adipocita differenciálódást a C/EBPβ-val és -δ-vel együttműködve a transzkripciós indukció érdekében PPARγ expresszió. Továbbá bebizonyítjuk, hogy a Foxa3 genetikai ablációjával rendelkező egerek szelektíven csökkentek az epididymális zsírraktárban és egy sejt autonóm hibával rendelkeznek, hogy a viscerális adipocitáikban specifikusan indukálják a PPARy-t. Elhízott egyéneknél a FOXA3 a zsigeri és a szubkután zsírraktárakban differenciáltan expresszálódik. Vizsgálatunk összességében a Foxa3-ot vonja be az adipocita differenciálódás és a depó-szelektív zsírszövet-terjeszkedés szabályozásába.

BEVEZETÉS

A zsírszövet kritikus szerv az energia homeosztázis fenntartásában. Az emlősöknek többféle zsírszövetük van, amelyek elsősorban abban különböznek, hogy képesek a lipideket tüzelőanyagként tárolni és felhasználni (1). Noha a fehér zsír általában az energiatárolásra és a szignálmolekulák szekréciójára specializálódott sejteket tartalmaz (2), a különféle anatómiai depókból származó adipociták jelentősen eltérnek génexpressziós profiljuk és adipokin-repertoárjuk tekintetében (3). Ezeket a lényegi különbségeket kritikusnak tartják abban, hogy a zsírraktárak hogyan járulnak hozzá különböző módon a metabolikus szindróma és a cukorbetegség etiológiájához (4).

A zsírsejtek molekuláris események egymás utáni sorozatán keresztül fejlődnek, válaszul a fejlődési jelekre vagy a kiválasztott táplálkozási és hormonális ingerekre. A preadipocita jóhiszemű adipocitává történő differenciálódását transzkripciós szinten szabályozza a nukleáris receptor peroxiszóma proliferátorral aktivált gamma receptor (PPARγ), amely központi szabályozó csomópontként működik a zsírsejtek differenciálódásának és működésének indukciója és fenntartása érdekében ). Számos transzkripció-szabályozót vontak be a korai differenciálódás szabályozásába a PPARy-expresszió indukciójához vagy szuppressziójához vezető upstream események modulálásával (2, 6). Kevéssé ismert azonban ezeknek a tényezőknek a depó-specifikus lipidfelhalmozódáshoz való specifikus hozzájárulása.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

siRNS-reagensek és plazmidok. Az egyes Forkhead faktorokat vagy PPARγ, C/EBPα, -β vagy -δ-t megcélzó kis interferáló RNS-eket (siRNS-eket), valamint a Dharmacontól vásároltunk egy siRNS-kontrollt (siGENOMEsiRNA reagensek, SMARTpool és siCONTROL nem célzó siRNS). A Foxa3 cDNS-t Kozak és Flag szekvenciát tartalmazó primerekkel, nevezetesen F (5'-AACAGAATTCGCCACCATGGACTACAAAGACGATGACGATAAACT GGGCTC AGTGAAGAT-3 ') és R (5'-CCCGCTCTCTGATT3CTATCTATCATGATT3CTATCATGATT3CTATCATGATT3CTATCTATCATGATT3CTGTTCTATCATGATT3CTATT3CTATT3CTGTTCCTATCATGATT3CTTA 1 (Invitrogen) az EcoRI és az EcoRV helyeken, majd az EcoRI helyén pMSCV retrovírus vektorba (Clontech) szubklónozzuk. A Foxa3-DBD R162P/N165I/M202R/R210P mutánst hely-irányított mutagenezissel (Stratagene) állítottuk elő az S1 táblázatban felsorolt primerekkel a kiegészítő anyagban. A C/EBPβ-t vagy a C/EBPδ-t expresszáló plazmidokat az Addgene-től szereztük be. A C/EBPα plazmid Kai Ge ajándéka volt. Az egér PPARγ promóterét (-2200 - +1) genomi DNS-ből NheI és HindIII helyeket tartalmazó primerekkel, nevezetesen F (5′-AACAGCTAGCCCCCCACTTTCACCATAGTC-3 ') és R (5'-TTGTAAGCTTAACAG CATAAAACAGAGATT-3') amplifikáltuk, és pGL3-bázis vektorba (Promega).

Fehérje elemzés. Az immunprecipitációkat a korábban leírt protokollok szerint hajtottuk végre (15). A fehérjéket SDS-PAGE-val elválasztottuk és polivinilidén-difluorid (PVDF) membránokra (Pierce) vittük át. A blotokat primer antitestekkel inkubáltuk egy éjszakán át 4 ° C-on és szobahőmérsékleten 1 órán át szekunder antitestekkel. Az immunkomplexeket az ECL Plus (Pierce) alkalmazásával tettük láthatóvá, a gyártó utasításainak betartásával.

EMSA. Az elektromobilitás eltolódási vizsgálatokhoz (EMSA) a Foxa3-WT vagy Foxa3-DBD mutáns expressziós plazmidokkal transzfektált U2OS sejtekből nyert nukleáris extraktumokat biotinnal jelölt oligonukleotiddal (5′-AACTATTCCTTTTTATAGAATTTGGATAGCAGTAACA-3 ′a kötődve) inkubáltuk. a PPARy promóterben azonosítják. A szuperszintet 0,4 μg Foxa3 antitest hozzáadásával kaptuk, és egy versenyvizsgálatot végeztünk 200-szoros, jelöletlen próbával. Inkubálás után a DNS-fehérje komplexeket 4% -os nem denaturáló poliakrilamid gélen választottuk el, majd egy pozitív töltésű nejlonmembránra (Pierce) vittük át. Az UV keresztkötés után a detektálást a gyártó protokolljának (Pierce) alapján végeztük.

ChIP vizsgálatok. A kromatin immunprecipitációs (ChIP) vizsgálatokat ChIP assay kit (Upstate) segítségével végeztük, a gyártó utasításainak megfelelően. A PCR-t primerek amplifikálására a C/EBP-kötő helyet (5'-GGCCAAATACGTTTATCTGGTG-3 'és 5'-TCACTGTTCTGTGAGGGGC-3'), a Foxa3 kötőhely (5'-TCACTTAAACATCAACCATTGGA-3 'és 5'-GGTCCAAAATGTTACTGCTATCC-3' ), vagy a TATA doboz helye (5′-GCCCCTCACAGAACAGTGAA-3 ′ és 5′-AACAGCATAAAACAGAGATTT-3 ′). A PCR termékeket agaróz gélen futtattuk, és etidium-bromid festéssel tettük láthatóvá. A relatív dúsulást valós idejű PCR-rel számszerűsítettük.

Gén expressziós elemzés. Az RNS-t TRIzol (Invitrogen) alkalmazásával extraháltuk, a cDNS-t a gyártó utasításai szerint állítottuk elő (ABI), és valós idejű PCR-t hajtottunk végre SYBR green (Roche) alkalmazásával. A normalizáláshoz 18S-t használtunk. Az egér Foxa3 mRNS-szintjét a következő primerekkel detektáltuk: F (5′-TGAATCCTGTGCCCACCAT) és R (3′-AGCTGAGTGGGTTCAAGGTCAT). A humán FOXA3-ot TaqMan primer készletekkel (ABI) detektáltuk.

Transzfekciók és luciferáz vizsgálatok. A 10T1/2 és 3T3-L1 sejteket Nucleofector 96 üreges rendszerrel (Amaxa) és U2OS sejtekkel (ATCC) transzfektáltuk FuGENE 6-tal (Roche), a gyártó utasításainak megfelelően. A Luciferase aktivitást 48 órával a transzfekció után a gyártó protokollja szerint (Promega Corporation) vizsgáltuk Victor 3 V (PerkinElmer) alkalmazásával.

Antitestek. Anti-Flag M2 gyöngyöket és anti-Flag antitesteket a Sigma-tól vásároltunk, az anti-C/EBPa, anti-C/EBPβ, anti-C/EBPδ és anti-HNF3γ (Foxa3) antitesteket a Santa Cruz-tól. A másodlagos antitesteket az Amersham és a Vector Labs cégtől szereztük be.

Egerek. Valamennyi állatkísérletet az Országos Cukorbetegség és Emésztőrendszeri és Vesebetegség Állatgondozási és Felhasználási Bizottságának (ACUC) irányelvei szerint hajtották végre. Az egereket 12 órás világos/sötét ciklusokban helyeztük el (fény 6-kor világított), és ad libitum hozzáférést biztosítottak az ételhez és a vízhez. Az egereket PCR-rel genotipizáljuk a következő primerekkel: Foxa3-F (előre) (5′-TCCCAAGCTTGGGCACTGGTG GCCA-3 ′), Foxa3-R (fordított) (5′-GTGGCAGCTGTAGTGGTGGCAG-3 ′) és lacZAT (5'-TCCCAAGCTGTAGTGGCAG-3G) -3 ′). Az egereket ketamin (90 mg/testtömeg-kg) és xilazin (10 mg/kg) intraperitoneális (i.p.) injekcióval feláldoztuk az NIH ACUC állatkísérletben jóváhagyott eljárásainak megfelelően. Az összegyűjtött szöveteket folyékony nitrogénben gyorsfagyasztottuk, vagy 4% paraformaldehid (EMS) alkalmazásával rögzítettük, és paraffinba ágyazva hematoxilin és eozin festés céljából. A felnőtt WT és Foxa3-null egereket magas zsírtartalmú étrenddel (HFD) táplálták 22 hétig (Research Diets, D12492). A normál étrenddel vagy HFD-vel táplált C57BL/6J egereket a The Jackson Laboratory-tól szereztük be.

Immunhisztokémia. A szöveteket 10% formalinban boncoltuk és rögzítettük, és standard eljárások szerint paraffinba ágyazottuk. A parafinba ágyazott szöveteket 5 μm vastagságú szakaszokra vágtuk, és morfológiai elemzés céljából hematoxilinnal és eozinnal (Histoserv) festettük, a gyártó utasításait követve (Vector Labs). A festett tárgylemezeket mikroszkóppal analizáltuk 200-szoros nagyítással (Olympus). Az adipocita méreteket ImageJ szoftverrel (1.45s verzió) mértük. Minden állatcsoportból legalább 200 sejtet mértünk.

Emberi zsírszövet minták. A kövér biopsziás mintákat a középső hasi régió szubkután zsírszövetéből (SAT) és az omentális régió zsigeri zsírszövetéből (VAT) 14 elhízott nőtől kaptuk, testtömeg-indexük (BMI) 45,6 kg/m 2 (tartomány, A Stanford's Bariatric Surgery Programba toboroztak, átlagéletkoruk 40 év volt (23 és 59 év között), a korábban leírtak szerint (16). A tanulmányt a Stanfordi Egyetem Humán Tárgyak Bizottsága hagyta jóvá. Minden alany írásbeli tájékozott beleegyezést adott.

ITT, GTT és szérum tesztek. Az inzulin tolerancia tesztekhez (ITT) az egerek intraperitoneális inzulin injekciót kaptak (1 mU/kg). A glükóz tolerancia tesztek (GTT) elvégzéséhez az egereket egy éjszakán át éheztettük, és intraperitoneálisan injekcióztuk sóoldatban lévő glükóz oldattal (2 g/kg). A plazma glükózszintjét a farokvérből mértük az inzulin vagy glükóz injekció beadása előtt vagy 15, 30, 60, 90 és 120 perccel. A szérum adiponektin, inzulin és koleszterinszint mérésére vérmintákat gyűjtöttünk egy hátsó szem tű segítségével. A szérumparamétereket a Linco Research és a Thermo cégtől kapott készletekkel mértük.

Statisztikai analízis. Valamennyi kísérletet legalább háromszor megismételtük. Az eredményeket átlagként ± az átlag standard hibájaként (SEM) mutatjuk be. A Student t tesztet és az egy- vagy kétirányú varianciaanalízist (ANOVA), majd a megfelelő utóvizsgálatokat GraphPad szoftverrel (GraphPad) végeztük. A 0,05 alatti P értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

EREDMÉNYEK

A Foxa3 mRNS szintjét HFD szabályozza. (A) Relatív Foxa3 mRNS-szintek WT egerek zsírraktáraiban normál étrendet (n = 4) vagy HFD-t (n = 4) tápláló 14 héten át. eWAT, epididymális WAT; iWAT, inguinalis WAT; mWAT, mesenterialis WAT; rWAT, retroperitoneális WAT; BAT, barna zsírszövet. (B) Foxa3 mRNS szintje a sejtek és az adipociták SVF-jében, amelyeket 14 hétig normál étrenddel (n = 4) vagy HFD-vel (n = 4) táplált egerek epididimális zsírraktárából nyertek. (C) Humán FOXA3 mRNS-szintek a zsigeri (VAT) és a szubkután (SAT) zsírszövetekben elhízott nőknél (n = 14). Az adatok azt jelentik, hogy ± SEM (**, P Foxa3-null egereknél fokozott az inzulinérzékenység. Az étrend okozta elhízás állatmodellekben általában glükóz intoleranciával és inzulinrezisztenciával jár. A magas zsírbevitel glükóz homeosztázisra és inzulinérzékenységre gyakorolt hatásainak meghatározása HFD-nek kitett WT és Foxa3-null egerekben glükóz- és inzulin tolerancia teszteket (GTT és ITT) végeztünk. (A 6A – D ábrák azt mutatják, hogy a Foxa3-null egerek inzulinérzékenyebbek voltak, mint a WT egerek, megnövekedett szérum adiponektinszinttel és csökkent inzulin- és koleszterinszint, összhangban a javított anyagcsere-profillal (6. ábra E).

A Foxa3-null egerek inzulinérzékenyebbek, mint a WT egerek. (A-tól D) GTT (A) és ITT (C) vizsgálatok felnőtt WT (n = 5) és Foxa3-null (KO) egerekben (n = 5) HFD-vel tápláltak és a görbe alatti terület kvantifikálása (AUC) ( B és D). (E) Szérumparaméterek WT (n = 5) és Foxa3-null (KO) egerekben (n = 5) a HFD-kezelés után. Az adatok ± SEM átlagot jelentenek (**, P 2013. március 5.

Visszaadva módosításra 2013. március 29-én.

Elfogadva 2013. május 31.

Elfogadott kézirat, amelyet 2013. június 24-én tettek közzé online.

A cikk kiegészítő anyaga megtalálható a http://dx.doi.org/10.1128/MCB.00244-13 címen.

A szerzők díjat fizettek azért, hogy azonnal hozzáférhessenek a cikkhez.