Határok a mikrobiológiában

Fertőző betegségek

Ez a cikk a kutatási téma része

Bakteriális kolonizáció: Bystander Microbiota vagy a krónikus betegség kezdeti lépése? Az összes 15 cikk megtekintése

Szerkesztette

Bernd Kreikemeyer

Rostocki Egyetem, Németország

Felülvizsgálta

Christian U. Riedel

Ulmi Egyetem, Németország

Jan Buer

Duisburg-Essen Egyetem, Németország

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

Cikk letöltése
- PDF letöltése
- ReadCube
- EPUB
- XML (NLM)
- Kiegészítő
  Anyag
Exportálás
- EndNote
- Referencia menedzser
- Egyszerű TEXT fájl
- BibTex

OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

Mikrobiológiai Intézet, Charité - Universitätsmedizin Berlin, a berlini Freie Universität, a Humboldt-Universität zu Berlin és a Berlini Egészségügyi Intézet, Mikrobiológiai és Higiéniai Tanszék vállalati tagja, Berlin, Németország

Bevezetés

A mai napig azonban nem állnak rendelkezésre adatok a gazdaszervezet immunválaszairól az egyébként egészségesekben P. aeruginosa intakt bél mikrobiota összetételű hordozók. A jelen tanulmányban tehát azt vizsgáltuk, hogy az emberi és az egér mikrobiotáját hordozó egereket stabilan kolonizálhatjuk-e egy klinikai MDR-rel P. aeruginosa törzs, és hogy a baktériumok hordozása társult-e bélrendszeri vagy akár szisztémás gyulladásos gazdaszervezetekkel.

Anyagok és metódusok

Etikai nyilatkozat

Valamennyi állatkísérletet az állatjólétre vonatkozó európai irányelvek (2010/63/EU) szerint hajtották végre, a „Landesamt für Gesundheit und Soziales” (LaGeSo, Berlin; nyilvántartási szám G0039/15) vezetésével az állatkísérletek bizottságának jóváhagyásával. Az állatok jólétét naponta kétszer ellenőriztük az egerek klinikai állapotának és súlycsökkenésének értékelésével.

Szekunder abbiotikus egerek generálása

A nőstény C57BL/6j egereket SPF körülmények között tenyésztettük és tartottuk fenn a Forschungsinstitute für Experimentelle Medizinben (Charité - University Medicine, Berlin, Németország). Gyakorlatilag kimerült mikrobiotával rendelkező másodlagos abiotikus egereket állítottunk elő az előzőekben leírtak szerint (Heimesaat et al., 2006). Röviden, a 8 hetes egereket steril ketrecekbe helyeztük, és 8 héten át széles spektrumú antibiotikum-kezelésnek vetettük alá ampicillin és szulbaktám (1 g/l; Ratiopharm, Németország), vankomicin (500 mg/l; Cell Pharm; Ciprofloxacin (200 mg/l; Bayer Vital, Németország), imipenem (250 mg/l; MSD, Németország) és metronidazol (1 g/l; Fresenius, Németország) az ivóvízhez (ad libitum). Kulturális és kultúrától független (azaz 16S rRNS-alapú molekuláris) minőség-ellenőrzési intézkedések a baktériumok virtuális hiányát tárták fel a székletmintákban, a korábban leírtak szerint (Ekmekciu et al., 2017).

Emberi és rágcsáló széklet mikrobiota transzplantáció

Az emberi és rágcsáló donor szuszpenziók és a széklet mikrobiota molekuláris elemzése

A székletmintákból a DNS-t extraháltuk a korábban leírtak szerint (Heimesaat et al., 2006). Röviden, a DNS-t Quant-iT PicoGreen reagenssel (Invitrogen, Egyesült Királyság) számszerűsítettük és 1 ng/μl-re állítottuk be. Ezután a TL-ket, valamint az egér és az emberi bél mikrobiotájában bőségesen előforduló fő baktériumcsoportokat, beleértve az EB, EC, LB, Bif, B/P, Clocc, Clept és MIB, qRT-PCR-rel értékeltük faj-, genera- vagy csoportcsoportonként. -specifikus 16S rRNS gén primerek (Tib MolBiol, Németország) a korábban leírtak szerint (Heimesaat és mtsai., 2010), és az egyes minták ng DNS-ére meghatározott 16S rRNS gén kópiák száma.

MDR P. aeruginosa A széklet terhelésének fertőzése és mennyiségi értékelése

Az MDR P. aeruginosa Az izolátumot kezdetben kórházi tüdőgyulladásban szenvedő beteg légzőanyagából tenyésztették, és Dr. Bastian Opitz professzor (Charité - Egyetemi Orvostudomány, Berlin, Németország) szívesen szolgáltatta. A klinikai baktériumtörzset rezisztensnek tesztelték piperacillin/tazobactam, ceftazidim, cefepim ± cefoxitin, imipenem, ciprofloxacin, gentamicin, tobramicin, amikacin, trimetoprim/szulfametoxazol és aztreonam ellen (az EUCASTf értelmezése szerint) csak kolisztin (von Klitzing et al., 2017a). Korábbi fertőzés, a P. aeruginosa törzset cetrimid-agaron (Oxoid) 48 órán át növesztettük aerob atmoszférában, 37 ° C-on.

A 0. és 1. napon az egereket perorálisan fertőztük 109 CFU MDR-rel P. aeruginosa törzs szondázással 0,3 ml PBS össztérfogatban, amint arról korábban beszámoltunk (von Klitzing et al., 2017a).

A széklet mennyiségi értékeléséhez P. aeruginosa terheléseket pi idővel, a székletmintákat steril PBS-ben homogenizáltuk, majd soros hígításokat csíkoztunk a Columbia agarra 5% juhvérrel (Oxoid, Németország) és cetrimid agarral kiegészítve, majd aerob atmoszférában 37 ° C-on 48 órán keresztül inkubáltuk. (von Klitzing et al., 2017a). A széklet tömegét a minta súlyának különbségével határoztuk meg a konzerválás előtt és után. Az életképes baktériumok kimutatási határa 100 CFU/g volt.

Klinikai állapotok

Az ürülék vérének makroszkopikus és/vagy mikroszkópos bőségét napi rendszerességgel értékeltük az egerekben Guajac módszerrel Haemoccult (Beckman Coulter/PCD, Németország) alkalmazásával, a korábban leírtak szerint (Haag et al., 2012a).

Mintavételi eljárások

Az egereket 28 napig feláldoztuk p.i. izoflurán-kezeléssel (Abott, Németország). A szívvért (szérumhoz) és a lépből, az MLN-ből, az ileumból és a vastagbélből származó szövetmintákat steril körülmények között eltávolítottuk. Bélmintákat vettünk minden egérből párhuzamosan a mikrobiológiai, immunológiai és immunhisztokémiai elemzésekhez.

Immunhisztokémia

Öt μm vastag vastagbél és ileal parafin szakasz ex vivo biopsziát alkalmaztak in situ immunohisztokémiai analízis, amiről korábban beszámoltunk (Heimesaat et al., 2010; Alutis et al., 2015a, b). Röviden, a hasított kaszpáz-3 (Asp175, Cell Signaling, Beverly, MA, Egyesült Államok, 1: 200), Ki67 (TEC3, Dako, Glostrup, Dánia, 1: 100), F4/80 (# 14- 4801, BM8 klón, eBioscience, 1:50) és B220 (eBioscience, 1: 200) értékeket alkalmaztunk apoptotikus sejtek, szaporodó sejtek, makrofágok/monociták és B limfociták értékelésére. Legalább hat HPF-en belüli pozitívan festett sejtek átlagos számát (0,287 mm 2; 400-szoros nagyítás) egy független vak vizsgáló.

Citokin detektálás

Ex vivo a vastagbélből és az ileumból származó (kb. 1 cm 2) biopsziákat (mind hosszanti irányban vágva, mind PBS-ben mosva), valamint az MLN-t és a lépet 24-lapos fenekű kút tenyésztő lemezekre (Falcon, Németország) helyeztük, amelyek 500 ml szérumot nem tartalmaznak. RPMI 1640 táptalaj (Gibco, Life Technologies) penicillinnel (100 E/ml, Biochrom, Németország) és sztreptomicinnel (100 μg/ml; Biochrom) kiegészítve. 18 óra elteltével 37 ° C-on tenyészet felülúszókat és szérummintákat teszteltünk TNF, IFN-y és IL-10 szempontjából egérgyulladásos citometrikus gyöngyvizsgálattal (CBA; BD Bioscience) BD FACSCanto II áramlási citométeren (BD Bioscience) mint korábban leírtuk (Haag et al., 2012b).

Statisztikai analízis

A mediánokat és a szignifikancia szintjét megfelelő tesztek segítségével határoztuk meg (Mann – Whitney U teszt, egyirányú ANOVA és Kruskal – Wallis teszt). Kétoldali valószínűség (o) ≤ 0,05 értékeket tekintettünk szignifikánsnak. A kísérleteket legalább kétszer reprodukáltuk.

Eredmények

Bél P. aeruginosa Gyarmatosítás komplex humán és egérbél-mikrobiotával rendelkező egerekben

Feltűnő, hogy immunválaszok vannak P. aeruginosa a szállítás nem korlátozódott a bélrendszerre, hanem szisztémásan is megfigyelhető volt, tekintve, hogy a lépben a TNF és az IFN-γ koncentráció már 7 nap pi-ben megemelkedett, míg a lép IL-10 szintje az átültetett humán széklet mikrobiotában csillapodott egerek később. Legjobb tudásunk szerint itt mutatjuk be először az MDR puszta bélhordozását P. aeruginosa klinikailag nem befolyásolt gazda kifejezett bél- és szisztémás következményeket eredményez. Ez még meglepőbb, tekintve, hogy nem minden vizsgált egér volt stabil P. aeruginosa hordozók tovább hangsúlyozzák az MDR patogén potenciálját P. aeruginosa.

Annak ellenére, hogy számos beszámolt a hasmenés okozta P. aeruginosa előzőleg antibiotikum-kezelésben részesült betegeknél, P. aeruginosa nem tekinthető általános bél kórokozónak az egészséges gazdaszervezetben (Adlard et al., 1998; Kim et al., 2001). Már 1918-ban azonban a „sanghaji láz”, egy közösség szerzett szindróma, amelyet hasmenés, láz és P. aeruginosa Magas mortalitású szepszisről beszámoltak elsősorban újszülöttek és a már nem járó társbetegségek nélküli gyermekeknél, elsősorban az ázsiai populációkban (Dold, 1918; Chusid és Hillmann, 1987; Martin-Ancel és mtsai, 1993; Viola és mtsai, 2006; Chuang és mtsai., 2014).

Tekintettel az (opportunista) kórokozók és a kommenzális bélbaktériumok közötti potenciális keresztbeszélgetésre, kitértünk arra, hogy a bél mikrobiota összetétele változhat-e P. aeruginosa gyarmatosítás. Érdekes módon korán (azaz 1 héten belül) nem volt megfigyelhető nyilvánvaló bélmikrobiota-eltolódás P. aeruginosa kolonizáció, és ezt követően csak kicsi volt a humán széklet mikrobiotával átültetett egerekben. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy mind az akut, mind a krónikus kicsi, valamint a vastagbélgyulladás egerekben a kommenzális EB megnövekedett luminalis terhelésével járul hozzá a gyulladásos szcenárió további fenntartásához a lipopoliszacharid (LPS), mint Gram-negatív baktériumsejt-alkotóelem TLR-4 függő szignálozásával (Heimesaat és mtsai, 2006, 2007a, b, 2010; Erridge és mtsai, 2010; Haag és mtsai, 2012a, b; Otto és mtsai, 2012). Annak ellenére, hogy a megfigyelt gyulladáscsökkentő immunválaszok kifejezett bélhám apoptózissal járnak, a bél MDR következményei P. aeruginosa a hordozás nem volt elegendő ahhoz, hogy a bél mikrobiota elmozdulását potenciálisan gyulladáscsökkentő komenzációkkal a túlnövekedés felé irányítsa.

Következtetés

Vizsgálatunk azt mutatja, hogy egy komplex mikrobiotával rekonstituált másodlagos abiotikus egereknél a kialakult bélmikrobiota (függetlenül attól, hogy emberi vagy egér eredetű) nem akadályozza meg kellőképpen a gazdaszervezet bél-kolonizációját MDR-rel P. aeruginosa törzs. Ezenkívül pusztán az MDR bélhordozása P. aeruginosa amúgy egészséges gazdaszervezeteknek nemcsak a bélrendszer, hanem a szisztémás gyulladásgátló következmények kialakulásának a veszélye is fennáll. A jövőbeli vizsgálatoknak tovább kell fejteniük a kölcsönhatások alapját képező molekuláris mechanizmusokat P. aeruginosa, a kommenzális mikrobiota és a gazdaszervezet immunitása az egészség és a betegségek vonatkozásában, az MDR Gram-negatív törzsekkel való kolonizációt megakadályozó stratégiák kidolgozása érdekében, P. aeruginosa.

Szerző közreműködései

EvK: tervezett és végrehajtott kísérletek, elemzett adatok, társszerkesztett cikk. IE: kísérleteket végzett, elemezte az adatokat, társszerkesztett dolgozat. SB: tanácsokat adott a kísérletek tervezésével és végrehajtásával kapcsolatban, társszerkesztett cikk. MH: kísérleteket tervezett és hajtott végre, elemezte az adatokat, dolgozatokat írt.

Finanszírozás

Ezt a munkát a Német Kutatási Alapítvány (DFG) támogatta az SB (SFB633, TP A7), az MH (SFB633, TP B6), az EvK és IE (SFB633, Immuco), valamint a német szövetségi oktatási és kutatási miniszterek támogatásával. (BMBF) - SB és MH (PAC-Campy 01KI1725D).

Összeférhetetlenségi nyilatkozat

A szerzők kijelentik, hogy a kutatást bármilyen kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolat hiányában végezték, amely potenciális összeférhetetlenségként értelmezhető.

Köszönetnyilvánítás

A szerzők köszönetet mondanak Michaela Wattrodtnak, Ursula Rüschendorfnak, Alexandra Bittroff-Lebennek, Ines Puschendorfnak, Ulrike Fiebigernek, Gernot Reifenbergernek és a Charité - Berlini Egyetem Orvostudományi Kutatóintézetének munkatársainak a kiváló technikai segítségért és az állattenyésztésért.

Rövidítések

Bif, bifidobaktériumok; B/P, Bacteroides/Prevotella spp .; CFU, kolóniaképző egységek; C. jejuni, Campylobacter jejuni; Clept, Clostridium leptum csoport; Clocc, Clostridium coccoides csoport; EB, enterobaktériumok; EC, enterococcusok; FMT, széklet mikrobiota transzplantáció; HPF, nagy teljesítményű mezők; ICU, intenzív osztály; LB, tejsavbaktériumok; MDR, több gyógyszerrel szemben rezisztens; MIB, Egér bél Bacteroides; MLN, mesenterialis nyirokcsomók; P, kétoldali valószínűségi értékek; PBS, foszfáttal pufferolt sóoldat; p.i., fertőzés utáni; qRT-PCR, kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció; SPF, specifikus kórokozóktól mentes; TL, a teljes eubakteriális terhelés; TLR, Toll-szerű receptor; WHO, Egészségügyi Világszervezet.

Kiegészítő anyag

S1. ÁBRA Széklet MDR P. aeruginosa terhelés az egerekben, amelyek emberi és egér mikrobiotát hordoznak. Egerek a (A) egér vagy (B) az emberi bél mikrobiotáját perorálisan fertőztük MDR-rel P. aeruginosa a 0. és az 1. napon. A bél kolonizációs sűrűségét székletmintákban határoztuk meg meghatározott időpontokban, pl. kultúra által. Mediánok (fekete sávok) és szignifikancia szintek (o-értékeket mutatjuk be. A zárójelben megadjuk a vizsgált minták összes számából az adott baktériumcsoportot tartalmazó minták számát. Az adatokat négy független kísérletből gyűjtöttük össze.

Idézet: von Klitzing E, Ekmekciu I, Bereswill S és Heimesaat MM (2017) Bél- és szisztémás immunválaszok több gyógyszerrel szemben rezisztens Pseudomonas aeruginosa Emberi bél mikrobiotát hordozó egerek kolonizálása. Elülső. Microbiol. 8: 2590. doi: 10.3389/fmicb.2017.02590

Beérkezett: 2017. augusztus 29 .; Elfogadva: 2017. december 12 .;
Publikálva: 2017. december 22.

Bernd Kreikemeyer, Rostocki Egyetem, Németország

Jan Buer, Duisburg-Essen Egyetem, Németország
Christian U. Riedel, Ulmi Egyetem, Németország