Az étrend meghatározó hatása a mikrobiomra, valamint a helyi és szisztémás immunválaszra egerekben

Molekuláris Immunológiai és Fertőző Betegség Központ, Biokémiai és Molekuláris Biológiai Tanszék, Állatorvos- és Orvostudományi Tanszék, Pennsylvania Állami Egyetem, University Park, Pennsylvania, Amerikai Egyesült Államok

Jot Hui Ooi,
Amanda Waddell,
Yang-Ding Lin,
Albert István,
Laura T. Rust,
Victoria Holden,
Margherita T. Cantorna

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Ooi JH, Waddell A, Lin Y-D, Albert I, Rust LT, Holden V és mtsai. (2014) A diéta domináns hatásai a mikrobiómára, valamint a helyi és szisztémás immunválaszra egerekben. PLoS ONE 9 (1): e86366. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0086366

Szerkesztő: Susan Kovats, Oklahoma Medical Research Foundation, Amerikai Egyesült Államok

Fogadott: 2013. szeptember 30 .; Elfogadott: 2013. december 6 .; Közzétett: 2014. január 29

Finanszírozás: Részben az Országos Egészségügyi Intézetek/Nemzeti Neurológiai és Stroke Intézet NS067563 támogatásával, valamint az Országos Kiegészítő és Alternatív Orvostudományi Központtal és az AT005378 Étrend-kiegészítők Hivatalával, valamint az Országos Gnotobiotikus Rágcsáló Forrás Központtal, az Országos Egészségügyi Intézetek támogatásával 5-P39- DK034987 ÉS 5-P40-OD010995. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Az immunmediált betegségek, beleértve a gyulladásos bélbetegségeket (IBD), a sclerosis multiplexet (MS), az ízületi gyulladásokat és más betegségeket, az utóbbi 50 évben gyakoribbá váltak. Becslések szerint az Egyesült Államokban 1,4 millió ember és világszerte 1000 emberből 4 szenved IBD-ben [1], [2]. A genetikai és környezeti tényezők kombinációja határozza meg, hogy mely egyéneknél alakul ki immunmediált betegség. Azonos ikertanulmányok megállapították, hogy a környezet erőteljesen befolyásolja az immunmediált betegségeket, mivel az azonos ikrek esetében a konkordancia arány 14-50% volt az IBD-ben és 25% az SM-ben [3], [4]. Ezenkívül az immunmediált betegségek rövid időn belüli gyors növekedésének a környezet változásainak kell lennie.

Az epidemiológiai tanulmányok bizonyítják a környezeti tényezők szerepét mind az SM-ben, mind az IBD-ben. A diétát az IBD-re hajlamosító lehetséges környezeti tényezőként azonosították [5]. Az étrendnek a gyomor-bél traktuson kívüli immunmediált betegségekre (például SM-re) gyakorolt hatásait azonban nem tanulmányozták kellőképpen. Az IBD gyakoribb volt a nyugati országokban, mint a keleti országokban [6]. A nyugati országokba érkező japán és kínai bevándorlók megnövelték az IBD kialakulásának kockázatát, ami összefüggést sugall az IBD előfordulása és a környezet változásai között, mint például a nyugati étrendhez való alkalmazkodás [6], [7]. A magas zsír- és fehérjetartalmú étrendeket összekapcsolják a gyulladásos betegségek patogenezisével [8]. Nehéz meghatározni, hogy mely étrendi tényezők befolyásolják az olyan összetett betegségeket, mint az IBD és az SM az emberekben.

A második környezeti tényező, amely fontos az immunmediált betegségek, különösen az IBD etiológiájában, a gyomor-bél traktusban található kommenzális flóra [9] - [11]. A vizsgálatok azt sugallják, hogy a bélflóra változásai (dysbiosis) genetikailag hajlamos egyéneknél IBD-t eredményeztek [9]. Bizonyított, hogy az egyéneknél az antibiotikumos (ABX) kezelés és a probiotikumok enyhítik az IBD tüneteit [12] - [14]. Az IBD-ben szenvedő betegeknél nagyobb volt a Proteobacteria és Actinobacteria phyla tagok száma, és alacsonyabb a Bacteroidetes phylum száma a belekben az egészséges kontrollokhoz képest [15]. A mikrobiom más immunmediált betegségekben, például SM-ben szenvedő betegekre gyakorolt hatását eddig nem írták le. A mikrobiota egyértelmű szerepe kimutatható az MS (kísérleti autoimmun encephalomyelitis (EAE)) és az IBD (interleukin (IL) -10 knockout (KO) egerek) kísérleti modelljeiben, mivel a csíra nélküli egerek enyhébb betegségben szenvednek, vagy egyáltalán nem fordulnak elő betegségben [16]., [17]. Ezek a gnotobiotikus egerek felhasználásával végzett kísérletek megmutatták a mikrobiom fontosságát az immunmediált betegségeknél.

A rövid távú étrendi kezelések (2 hét) hatását a mikrobiomra, valamint a bél és a központi idegrendszer immun-közvetített betegségeire tesztelték. Három táplálkozási szempontból megfelelő laboratóriumi étrendről kiderült, hogy befolyásolja az egerek érzékenységét a dextrán-nátrium-szulfát (DSS) által kiváltott vastagbélgyulladásra és EAE-re. Ezenkívül étrend által közvetített hatások voltak a Citrobacter rodentium fertőzés kiürülésére. A laboratóriumban készített tisztított étrend (PD) védett volt a három modellben, összehasonlítva az azonos vad típusú (WT) egerek standard laboratóriumi chow-étrenddel (CD) vagy speciálisan tisztított étrenddel (Teklad-étrend, TD) történő etetésével. Az étrendi kezelések hatással voltak a széklet baktériumok mikrobiota összetételére, és a mikrobiota ABX zavarai csökkentették az étrend betegségre való hajlamát. A diéta nem befolyásolta a csíra nélküli egerek DSS-érzékenységét. A PD védőhatásai rendkívül gyorsak voltak, mióta a DSS-kolitisz indukciója előtt 1 nappal és 2d után PD-védettre váltott. A rövid távú étrendi kezelések hasznosak lehetnek a bél mikrobiotájának elmozdítására és az immunmediált betegségek enyhítésére.

Anyagok és metódusok

Egerek és diéta

DSS által kiváltott vastagbélgyulladás

Az egereknek DSS-t kaptak a vastagbélgyulladás kiváltására a korábban leírtak szerint [20]. Röviden, az egereket 2,5% DSS-sel (ICN Biomedicals, Aurora, OH) kezeltük ivóvízben 5 napig, majd visszatértük a rendszeres ivóvízbe a kísérlet hátralévő részében (6–14. Nap). 3,5% DSS-t alkalmaztunk olyan kísérletekhez, amelyek növekvő mennyiségű laktózt adtak a PD étrendhez, hogy növeljék a sérülés mértékét és felerősítsék a csoportok közötti különbségeket. A testtömeg (BW) változásokat naponta ellenőriztük. A vastagbél véreredményei 0–3 skálán voltak, ahogy azt korábban leírtuk [20]. A disztális vastagbéleket feldolgoztuk és pontoztuk a korábban leírt módon, 0–15 skálán [20].

C. rodentium fertőzés

A C. rodentium ICC169 törzs Dr. Gad Frankel (London School of Medicine and Dentistry, London, Egyesült Királyság) ajándéka volt. A C. rodentiumot egy éjszakán át tenyésztettük 50 ug/ml nalidixinsavat (EMD vegyi anyagok, Gibstown, NJ) tartalmazó LB táptalajban, majd 5x109 CFU C. rodentiumot PBS-ben orálisan adtunk egereknek [21]. A székletmintákat összegyűjtöttük és PBS-ben (0,1 g ürülék 1 ml PBS-ben) homogenizáltuk a székletürítés figyelemmel kísérésére. A sorozatos hígításokat három példányban, nalidixinsavat tartalmazó LB agarlemezekre szélesztettük, és egy éjszakán át 37 ° C-on tenyésztettük a telepek számlálásához. A másodlagos fertőzések 1 hét múlva történtek, miután az összes egér megtisztította az elsődleges fertőzést. A másodlagos fertőzésekhez 5 × 10 9 C. rágcsálót alkalmaztak PBS-ben, és szájon át adott szondával adták be. A disztális vastagbél hisztopatológiáját 0–8-as skálán pontoztuk az előzőekben ismertetett kritériumok alapján [21].

Az egereket szubkután 200 µg MOG35–55-tel (aminosavszekvencia, MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK; Anaspec, Fremont, CA) injektáltuk Freund teljes adjuvánsába (Difco, Detroit, MI) emulgeálva, 4 mg/ml Mycobacterium tubercifco MI, Detroit, D37 (D37) ). D0 és d2 immunizálás után az egereket intraperitoneálisan 200 ng pertussis toxinnal (List Biological Laboratories, Campbell, CA) injektáltuk 100 ul PBS-ben. Az EAE klinikai tüneteit naponta értékelték és a 0–5 skálán korábban leírt módon értékelték [22]. A 2 vagy annál nagyobb EAE pontszámú egereket EAE pozitívnak tekintették. A kumulatív betegségindex kiszámítása a betegség 21. napi aktivitási pontszámainak összeadásával történt. A lefolyó nyirokcsomók egysejtes szuszpenzióit összegyűjtöttük és 20 µg/ml MOG35-55 peptiddel újra stimuláltuk. 72 órás felülúszót gyűjtöttünk elemzés céljából ELISA-val.

Denaturáló gradiens gélelektroforézis (DGGE)

A székletmintákat egerek tiszta, üres ketrecekbe helyezésével gyűjtöttük össze, és a DNS-t izoláltuk, és pontosan elemeztük a leírtak szerint [21]. A Clostridium propionicum (ATCC 25522 törzs), a Lactobacillus murinus (ATCC 35020 törzs) és a Parabacteroides distasonis (ATCC 8503 törzs) tisztított tenyészeteiből izolált bakteriális DNS PCR termékeit standardként (STD) futtattuk a szalagok migrációjának összehasonlítására a lefuttatott gélek között különböző napokon.

Metagenomikus elemzés

ELISA

Az IL-17 és IFN-γ ELISA-kat készletekkel végeztük a gyártó utasításainak betartásával (BD Bioscience, San Diego, CA). 30 µg/ml ultrahanggal kezelt C. rodentium proteint vontunk be 96-lyukú lemezekre befogó antigénként a C. rodentium-specifikus IgA és IgG mennyiségének meghatározásához a mintákban, és HRP-konjugált anti-egér IgA-t és HRP-konjugált anti-egeret használtunk. IgG (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Az értékeket C. rodentium-specifikus IgG-ként vagy IgA-ként jelentik a standard görbe előállításához használt összesített szérumhoz viszonyítva.

Statisztikai analízis

Ha lehetséges, megmutattuk az összes adatpontot több kísérletből (C. rodentium kísérletek). Az EAE és a DSS vastagbélgyulladás esetében a betegség kinetikája és súlyossága jelentősen változó volt, amelyet képtelenek voltunk kontrollálni. Ezekhez a kísérletekhez két vagy három egyedi kísérlet egyik képviselőjét mutattuk meg. A nem párosított Student t tesztet, az egyirányú ANOVA-t Tukey utótesztjeivel és a kétirányú ANOVA-t a Bonferroni utótesztekkel használtuk a statisztikai szignifikancia kiszámításához a GraphPad Prism szoftveren keresztül (GraphPad, La Jolla, CA). A metagenomikus analízishez Pearson Chi-Square Goodness of Fit tesztet alkalmaztunk, P 1. ábra segítségével. A diéta okozta változásokat a DSS iránti fogékonyságban.

A WT vagy Rag KO egereket a kísérleti étrendekkel etettük 2% -os DSS kezelés céljából és az egész kísérlet során. Az (A) WT (n = 4–6 egér/csoport) és (B) Rag KO egerek eredeti BW százaléka a DSS-kezelés megkezdése után (n = 3-5 egér/csoport). Mindhárom étrendi csoport szignifikánsan különbözött egymástól (* P 2. ábra. A diéták tápanyag-összetétele.

Annak eldöntésére, hogy a CD- és a TD-étrend laktóztartalma felelős-e a DSS súlyos tüneteiért, legfeljebb 20% laktózt adtak a PD-hez. 5% laktóz hozzáadása a PD-hez kevesebb súlyvesztést eredményezett a DSS következtében, mint a 0% laktózt tartalmazó PD (P = 0,0001, S1 ábra). A 10% laktóz nem különbözött a PD-től, és 20% a laktózzal táplált egerek szignifikánsan nagyobb súlyt vesztettek a DSS következtében, mint a PD-vel táplált egerek (P = 0,0076) (S1. Ábra). A DSS vastagbélgyulladás egyéb tünetei (a vastagbél megrövidülése) azonban nem súlyosbodtak, ha a PD-hez legfeljebb 20% laktózt adtak (az adatokat nem mutatjuk be). Önmagában a laktóztartalom nem veszi figyelembe a DSS étrend által közvetített, egerekre gyakorolt hatását.

Az étrend közvetítette megváltoztatja a széklet mikrobiota összetételét

Annak megállapítása érdekében, hogy az étrend megváltoztatta-e a baktérium mikrobiota összetételét, a DSS indukció előtt a különféle étrendet tápláló egerekből DNS-izolálásra székletet gyűjtöttünk, és a DGGE segítségével elemeztük (3A. Ábra). Korábban kimutattuk, hogy az egerek átkapcsolása a standard CD-ről a PD-étrendre olyan elmozdulást eredményezett a DGGE sávozási mintáiban, hogy a váltás után csak 47% -os hasonlóság mutatkozott a kapcsolás előtti sávmintához [19], [21]. Az ugyanazon étrendben lévő egerek mutatták a legnagyobb hasonlóságot a mikrobiális DGGE sávozási mintákban [19], [21]. A különböző DGGE sávozási minták összehasonlítása azt mutatta, hogy a sávosodási mintázatok hasonlósága nagy volt az azonos étrendben táplált egerek székletében (60% -os hasonlóság a PD-vel etetett és 50% -os hasonlóság a TD-vel etetett, 3B. Ábra) és alacsonyabb a sávozás összehasonlításakor mintázat PD-vel és TD-vel táplált egerek között (hasonlóság 39%, 3B. ábra). A székletben a baktérium DNS teljes mennyisége nem különbözött a PD-vel és a TD-vel táplált egerek között (valós idejű PCR, az adatok nem láthatók). A diéták maguk is hozzájárultak a baktériumok maradék DNS-jéhez (S1. Ábra). A PD-ben és a TD-ben Lactococcus lactis DNS volt, és emellett a TD Leuconostoc fajok DNS-ét is tartalmazta (S1. Ábra). Ezek a szervezetek azonban nagyon alacsony mennyiségben voltak jelen (3. ábra. A diéta által közvetített hatások a széklet mikroflórájára.

(A) A PD-vel táplált (1–4. Sáv) és a TD-vel táplált egerek (5–8. Sáv) széklet DNS-jének DGGE-ujjlenyomatai (n = 4 egér/csoport). A bemutatott adatok három független kísérlet egyik reprezentatívja. (B) Fürtanalízis, amely az A panelen bemutatott DGGE sávképződési minták hasonlóságának mérését mutatja. (C) Metagenomikus elemzés, amely kimutatja a PD- és TD-táplált egerek székletében jelen levő baktériumos phyla mennyiségét (n = 2 egér/csoport). (D) A PD- és TD-táplált egerek székletében jelenlévő Firmicutes phylum baktériumcsaládok bősége (n = 2 egér/csoport). Jelentős különbséget találtunk a baktériumok többségében és a családokban a PD és a TD között (*** P 4. ábra. Az ABX kezelések megvédték a PD és TD táplált egereket a DSS által kiváltott vastagbélgyulladástól.

A WT egereket folyamatosan kezeltük ABX-sel, és PD vagy TD-vel tápláltuk 2% -os DSS kezelés céljából. (A) Az ABX-vel kezelt PD- vagy TD-táplált egerek eredeti BW százaléka a DSS-kezelés megkezdése után (n = 3-4 egér/csoport). Jelentős különbséget találtunk a BW változásban a PD versus TD, PD és PD ABX, TD és TD ABX, valamint PD ABX és TD ABX összehasonlításában (*** P 5. ábra. Diéta által közvetített hatások a C. rodentium primer és szekunder fertőzésére.

(A) C. rodentium leválása a székletbe elsődleges fertőzés után (n = 14 egér/csoport). (B) C. rodentium leválása a székletbe másodlagos fertőzés után (n = 14 egér/csoport). Az értékek az átlag +/− SEM. A TD szignifikánsan különbözött a PD-től (* P 6. ábra. Az étrend által közvetített hatások az EAE fejlődésére WT egerekben.