A hipoxiának való kitettség kiegészítése rézhiányos étrenddel nem súlyosbítja az egerek jobb kamrai átalakulását

Tartalom Kardiológiai Tanszék, CARIM Kardiovaszkuláris Betegségek Iskola, Egészségügyi, Orvostudományi és Élettudományi Kar, Maastrichti Egyetem, Maastricht, Hollandia

A CARIM Kardiovaszkuláris Betegségek Radiológiai Osztálya, Maastrichti Egyetem Orvosi Központja, Maastricht, Hollandia

A NUTRIM iskolai táplálkozási, toxikológiai és anyagcsere-osztályának légzőszervi osztálya, Maastrichti Egyetem Orvosi Központja, Maastricht, Hollandia

Tartalom Kardiológiai Tanszék, CARIM Kardiovaszkuláris Betegségek Iskola, Egészségügyi, Orvostudományi és Élettudományi Kar, Maastrichti Egyetem, Maastricht, Hollandia

Egyformán közreműködött ebben a munkában: Vanessa P. M. van Empel, Paula A. da Costa Martins

Fogászati Kardiológiai Osztály, Szívérközpont, Maastrichti Egyetem Orvosi Központ, Maastricht, Hollandia

Egyformán közreműködött ebben a munkában: Vanessa P. M. van Empel, Paula A. da Costa Martins

Tartalom Kardiológiai Tanszék, CARIM Kardiovaszkuláris Betegségek Iskola, Egészségügyi, Orvostudományi és Élettudományi Kar, Maastrichti Egyetem, Maastricht, Hollandia

Ella M. Poels,
Nicole Bitsch,
Jos M. Slenter,
M. Eline Kooi,
Chiel C. de Theije,
Leon J. de Windt,
Vanessa P. M. van Empel,
Paula A. da Costa Martins

Ábrák

Absztrakt

Háttér

A pulmonalis hipertónia és az azt követő jobb kamrai elégtelenség magas morbiditással és mortalitással jár. A prognózist az RV kudarc előfordulása határozza meg. Jelenleg hiányzik a lakóautó-meghibásodás megfelelő kezelése. Ezért elengedhetetlen az RV-kudarc kialakulásának molekuláris alapjaival kapcsolatos további kutatások, valamint az RV-kudarc jobb egérmodelljeinek kidolgozása. Feltételezzük, hogy alacsony réztartalmú étrend hozzáadása az egerek krónikus hipoxiájához erősíti egyéni hatásukat, és hogy az enyhe pulmonalis vaszkuláris remodeláció és a kapilláris ritkaság kombinációja RV-kudarcot indukál.

Mód

A hat hetes egereket normoxiának (N; 21% O2) vagy hipoxiának (H; 10% O2) tették ki 8 héten keresztül, és vagy normál étrendben (Cu +) vagy rézhiányos étrendben részesültek (Cu-). A szívműködést echokardiográfiával és MRI analízissel értékeltük.

Eredmények és következtetések

Itt jellemeztük a krónikus hipoxia egérmodelljét, rézhiányos étrenddel kombinálva, és bemutattuk, hogy nyolc hét krónikus hipoxia (10%) elegendő az RV hipertrófia és az azt követő RV kudarc kiváltásához. Az alacsony réztartalmú étrend hozzáadása a hipoxiához nem gyakorolt további káros hatást a jobb kamrai átalakulásra.

Idézet: Poels EM, Bitsch N, Slenter JM, Kooi ME, de Theije CC, de Windt LJ és mtsai. (2014) A hipoxiának való kitettség kiegészítése réz kimerült étrenddel nem súlyosbítja az egerek jobb kamrai átalakulását. PLoS ONE 9 (4): e92983. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0092983

Szerkesztő: James West, Vanderbilt Egyetem Orvosi Központ, Amerikai Egyesült Államok

Fogadott: 2013. november 27 .; Elfogadott: 2014. február 27 .; Közzétett: 2014. április 15

Finanszírozás: Az EP-t Stichting Sint Annadal támogatásával, a PCM-et pedig a Leducq Karrierfejlesztési Díj és a Holland Szív Alapítvány NHS2010B261 támogatásával támogatták. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, az adatgyűjtésben és -elemzésben, a kézirat publikálására vonatkozó döntésben vagy az előkészítésben.

Versenyző érdeklődési körök: Paula da Costa Martins a PLOS ONE szerkesztőségének tagja. Ez nem változtatja meg a szerzők ragaszkodását a PLOS ONE szerkesztési irányelveihez és kritériumaihoz.

Bevezetés

A pulmonalis hipertónia (PH) és az azt követő jobb kamrai (RV) elégtelenség magas morbiditással és mortalitással jár. A prognózist elsősorban az RV képessége határozza meg, hogy alkalmazkodjon a megnövekedett utóterheléshez, ami a PH egyik fő jellemzője. [1] - [5] Kevéssé ismertek az RV meghibásodásának kialakulásának és az RV hipertrófia RV kudarcra való átmenetének hátterében álló mechanizmusokról.

Számos állatmodell áll rendelkezésre a lakóautó-meghibásodás vizsgálatára. A leggyakrabban használt modellek a rágcsáló-modellek, ahol a monokrotalin vagy a hipoxia expozíciója RV átalakulást és kudarcot okoz. [6], [7] A krónikus hipoxia vazokonstrikciót és a pulmonalis vaszkuláris ágy átalakulását is kiváltja, ami megnövekedett pulmonális nyomást eredményez, ami RV kudarchoz vezet. [8], [9] Ezt a modellt túlnyomórészt patkányokon tanulmányozták, de a legutóbbi vizsgálatok kimutatták, hogy az egerek krónikus hipoxiának kitéve a patkányokhoz képest kevésbé súlyos pulmonalis vaszkuláris átalakulást mutatnak. [9] Egerekben a krónikus hipoxia RV hipertrófiát és megnövekedett jobb kamrai szisztolés nyomást (RVSP) indukált. [10] - [22] Noha a hipoxia RV funkcióra gyakorolt hatása továbbra sem tanulmányozott, az a néhány tanulmány, amely frakcionális rövidülést vagy RV szívteljesítményt vizsgált, nem mutatott csökkenést. [23], [24] Meg kell azonban jegyezni, hogy ez csak a hipoxia rövid távú kitettségét foglalta magában.

A pulmonalis hipertónia egyéb rágcsálómodelljei többnyire többszörös sértéseket tartalmaznak, ideértve a krónikus hipoxia és a VEGFR-gátlás (SuHx) kombinációját és a monokrotalin-kezelést pneumonectomiával, hogy ne csak a pulmonalis vaszkuláris átalakulást, hanem az azt követő RV-kudarcot is kiváltsák. [14], [25] - [27] Egerekben a SuHx az egyetlen kettős sértésű modell, amelyet korábban leírtak RV meghibásodás kiváltására [14].

Bogaard és mtsai. kimutatta, hogy rézhiányos étrend hozzáadása a pulmonalis artéria sávozásához (PAB) patkányokban fokozott RV fibrózishoz és RV dilatációhoz, valamint kapilláris ritkasághoz vezetett. [26] Az alacsony réztartalmú étrend megzavarja a HIF-1α fehérje stabilizálódását, amely szükséges a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) expressziójához, és ezért utólagosan befolyásolja az angiogenezist. [26], [28] Hypoxiás körülmények között a miofiber terület kétszeresére növekszik, ami a kapilláris sűrűség csökkenéséhez vezet, azonban a kapilláris: rost arány kismértékű növekedése az RV hipertrófia következtében fellépő kapillárisok szerény szaporodásának következménye. [29] Ismert, hogy a szívműködés fenntartása a hipertrófia során részben angiogenezistől függ, és hogy a VEGF-expresszió hiánya hozzájárul az adaptív kardiális hipertrófiától a szívelégtelenségig történő előrehaladáshoz [30], [31].

Ezzel szemben a rézhiányos étrend megakadályozta a súlyos kísérleti pulmonális hipertónia kialakulását a patkánymodellben, amely magában foglalta a VEGF receptor blokkolását krónikus hypoxiával (SuHx modell), csökkentve a kis pulmonalis erek obliterációját [32].

Az elmúlt években jelentősen fejlődtek az egerek géntechnológiájának lehetőségei, ami rendkívül vonzóvá tette az egerek állatmodellként való alkalmazását. Ezért előnyös lenne a jobb kamrai elégtelenség egérmodelljei. Feltételezzük, hogy az egerek krónikus hypoxiájához hozzáadott alacsony réztartalmú étrend erősíti egyéni hatásukat, és az enyhe pulmonalis vaszkuláris remodelláció és az RV kapilláris ritkaságának kombinációja RV kudarcot idéz elő. Ezért javasoljuk az alacsony réztartalmú étrend krónikus hipoxia egér modelljében a jobb kamrai működésre gyakorolt hatásának vizsgálatát.

Anyagok és metódusok

Állatok

Minden állatkezelést és eljárást a Maastrichti Egyetem állatjóléti etikai bizottsága hagyott jóvá, és összhangban voltak a kormányzati iránymutatásokkal.

Összesen 48 C57BL/6 hím egeret használtunk 6 hetes korukban a kísérlet kezdetén. Az egereket szobahőmérsékleten (20 ° C) helyeztük el, és 12 órás világos-sötét ciklusba helyeztük. Az étel és a víz ad libitum szerint elérhető volt; az élelmiszer-fogyasztást monitorozták, és mind a négy kísérleti csoportban hasonló volt, ezért a páros etetést szükségtelennek tartották a kísérlet során. Az egerek vagy rézhiányos étrendet kaptak (Harlan Teklad, TD 80388), vagy normál chow-étrendet kaptak (Harlan Teklad LM-485).

Hypoxia esetén az állatokat zárt kamrába helyeztük (kísérleti csoportonként n = 12); ventilátor keringette a levegőt a kamrában. Az O2-koncentrációt az N2 beáramlási sebességének szabályozásával 10% -on tartották. Mielőtt az egereket 10% O2-on tartották, hagyták őket 24 órán át alkalmazkodni a környezetükhöz a stressz minimalizálása érdekében, és az O2 szintet fokozatosan 10% -ra csökkentették további 72 órán keresztül. Az alomtársak kontrollként szolgáltak a normoxia csoportban, és szobai levegőben tartották őket (21% O2); ventilátor biztosította a kamrában a megfelelő légkeringést. A kamrákat napi kevesebb, mint 15 percig nem zárták le az élelmiszerek feltöltése, a ketrecek tisztítása és a ventilátorok ellenőrzése céljából.

Echokardiográfia

Az egereket izofluránnal (átlagosan 1,5% oxigénnel) altattuk, leborotváltuk és hagytuk, hogy az orrkúpon keresztül spontán lélegezzenek. A nem invazív, echokardiográfiai paramétereket digitális szív ultrahangos platform (Vevo 2100, VisualSonics) segítségével mértük; a szívparaméterek esetében a jelátalakítót paraszterálisan a borotvált mellkasfalra helyeztük, és a méréseket a korábban leírtak szerint végeztük [33].

Az egereket izofluránnal altattuk. A testhőmérsékletet rektális hőmérsékleti szondával követtük, és az egereket melegvizes takaró alá helyeztük. Ezenkívül a légzésszámot folyamatosan monitorozták. Az MRI-t 7 Tesla Bruker Biospec 70/30 USR alkalmazásával végeztük (Bruker Biospin, Ettlingen, Németország).

A jobb kamrát Intragate szekvencia alkalmazásával mértük, 25,6 × 25,6 mm látómezővel, a mátrix 256 × 256, TE 3 ms, TR, 60 ms, 7 szelet volt. Az Intragate szekvenciából kiszámított film 15 képkockából áll. Az összes képet elemeztük az OsiriX-ben (Dicom viewer, 3.5-ös verzió, Pixmeo, Genf, Svájc). Az RV végdiasztolés és az RV vég-szisztolés térfogatait a teljes jobb kamra többszeletes rövid tengelyű cine-képeinek felhasználásával elemeztük. Az RV kilökődési frakciót (RVEDV-RVESV)/RVEDV * 100 értékkel számoltuk.

A lakóautó hipertrófiájának értékelése

A szívet feldarabolták, és mindkét pitvart, az aortát és a tüdő törzsét eltávolították. A jobb kamrát elválasztották a bal kamrától és a kamrai septumtól. A jobb kamrai hipertrófiát a Fulton-index segítségével fejeztük ki; a jobb kamrai fal súlyának a bal kamrai falhoz és a kamrai septumhoz viszonyított aránya (RV/LV + S).

Szövettan, immunhisztokémia és immunfluoreszcencia

A szív- és tüdőmintákat 3,8% paraformaldehiddel végzett perfúzióval rögzítettük és megtisztítottuk a vértől, majd ezt követően paraffinba ágyazottuk. A szöveti metszeteket (4 um) hematoxilinnal és eozinnal (H&E) festettük a rutin hisztológiai anaylishez, vagy picro-Sirius vörösrel a kollagén lerakódás vizualizálására. Ezenkívül FITC-jelölt búzacsíra-agglutinint (WGA) alkalmaztunk a keresztmetszeti sejtek területének vizualizálására és számszerűsítésére; a kapilláris sűrűséget Griffonia simplicifolia agglutin-I (GS-I) lektin festéssel vizualizáltuk és kvantifikáltuk.

A tárgylemezeket Zeiss Axioskop 2Plus és AxioCamHRc alkalmazásával képi megjelenítéssel és képalkotással láttuk el.

A Fulton-indexet használták indexként az RV hipertrófiájához, és az RV szabad fal tömegének a septumhoz viszonyított hányadának és a bal kamrai szabad fal tömegének arányaként számolták.

Valós idejű PCR

A primereket az nppa (NM_008725, 5′-TCTTCCTCGTCTTGGCCTTT, 5′-CCAGGTGGTCTAGCAGGTTC), nppb (NM_008726, 5′-TGGGGGGACTACTCCTATCCT, 5′-GGCCTGGTGGTGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGGTGGTGGTGGTGGTGGGTGTGGTGTGGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGT GGAAGCATA), myh7 (NM_080728, 5′-CGGACCTTGGAAGACCAGAT, 5′-GACAGC TCCCCATTCTCTGT) és rcan1,4 (NM_019466, 5′-GCTTGACTGAGAGAGGGTC, 5′-CCACACAAGCAATCAG).

Az RNS-t izoláltuk a szövetekből TRIzol-reagens (Invitrogen) alkalmazásával. A jobb kamrai egér szívszövet RNS-jét (1 ug) reverz transzkripcióval írtuk le Superscript II reverz transzkriptáz (Invitrogen) alkalmazásával. A valós idejű PCR-t BioRad iCycler-en (Biorad) végeztük SYBR Green alkalmazásával. Az átírási mennyiségeket a relatív Ct módszerrel hasonlítottuk össze, amely normalizálja a cél mennyiségét az endogén kontroll mennyiségéhez (L7) a kontroll mintához viszonyítva, és 2-ΔΔCt adja meg.

Statisztikai analízis

Az eredményeket átlag ± ± átlaghibának adjuk meg (azaz.m.). A statisztikai elemzéseket a Prism szoftver (GraphPad Software) segítségével végeztük, és az ANOVA-ból állt, amelyet Tukey utólagos tesztje követett, amikor 5% -os szignifikancia szinten észleltek csoportkülönbségeket, vagy két csoport összehasonlításakor a Student t-tesztjét. A különbségeket akkor tekintettük szignifikánsnak, amikor P 1. ábra. A krónikus hipoxia a Fulton-index növekedéséhez vezet.

a) Kísérleti csoportok. b) Tanulmányterv. c) Egész szív (felső panelek), haematoxilin és eozin (H&E) festett 4 kamrás paraffin szakaszok (második panelek), nagy nagyítású H&E festett szabad kamrai fal szövettani metszetei (harmadik panelek), nagy nagyítású vörös színű szirius képek szabad jobb kamrai falszakaszok (alsó panelek. A következő csoportokat hasonlítjuk össze: normoxia normál chow étrenden (N/Cu +), normoxia réz kimerült étrenden (N/Cu-), hypoxia normál chow étrenden (H/Cu +) és hypoxia réz kimerült étrenden (H/Cu-). (d) A testtömegre korrigált szívsúly gramm/grammban (n = 9) * P 2. ábra. A krónikus hipoxia a jobb kamrai ejekciós frakció csökkenését váltja ki.