A karboxilészteráz 2c bélspecifikus túlzott expressziója megvédi az egereket az étrend okozta máj steatosis és elhízás ellen

Graz Egyetem, Molekuláris Biotudományok Intézete, Graz, Ausztria

Gottfried Schatz Kutatóközpont, Molekuláris Biológia és Biokémia, Graz Orvostudományi Egyetem, Graz, Ausztria

Graz Orvosi Egyetem, Molekuláris BioMedicine Patológiai Intézet Diagnosztikai és Kutatóközpont, Graz, Ausztria

Állatorvos-tudományi Laboratóriumi Intézet, Bécs, Ausztria

Humángenetika Tanszék, Leideni Egyetem Orvosi Központ, Leiden, Hollandia

Gottfried Schatz Kutatóközpont, Molekuláris Biológia és Biokémia, Graz Orvostudományi Egyetem, Graz, Ausztria

Gasztroenterológiai és Hepatológiai Osztály, Graz Orvostudományi Egyetem, Graz, Ausztria

Graz Orvosi Egyetem, Molekuláris BioMedicine Patológiai Intézet Diagnosztikai és Kutatóközpont, Graz, Ausztria

Graz Egyetem, Molekuláris Biotudományok Intézete, Graz, Ausztria

Cím levelezési és újranyomtatási kérelmek:

Guenter Haemmerle, Ph.D., Graz Egyetem, Molekuláris Biotudományok Intézete, Heinrichstrasse 31a, A-8010 Graz, Ausztria

Graz Egyetem, Molekuláris Biotudományok Intézete, Graz, Ausztria

Gottfried Schatz Kutatóközpont, Molekuláris Biológia és Biokémia, Graz Orvostudományi Egyetem, Graz, Ausztria

Graz Orvosi Egyetem, Molekuláris BioMedicine Patológiai Intézet Diagnosztikai és Kutatóközpont, Graz, Ausztria

Állatorvos-tudományi Laboratóriumi Intézet, Bécs, Ausztria

Humángenetika Tanszék, Leideni Egyetem Orvosi Központ, Leiden, Hollandia

Gottfried Schatz Kutatóközpont, Molekuláris Biológia és Biokémia, Graz Orvostudományi Egyetem, Graz, Ausztria

Gasztroenterológiai és Hepatológiai Osztály, Graz Orvostudományi Egyetem, Graz, Ausztria

Graz Orvosi Egyetem, Molekuláris BioMedicine Patológiai Intézet Diagnosztikai és Kutatóközpont, Graz, Ausztria

Graz Egyetem, Molekuláris Biotudományok Intézete, Graz, Ausztria

Cím levelezési és újranyomtatási kérelmek:

Guenter Haemmerle, Ph.D., Graz Egyetem, Molekuláris Biotudományok Intézete, Heinrichstrasse 31a, A-8010 Graz, Ausztria

Absztrakt

Rövidítések

Mód

A klónozás és az expressziója Ces2c a COS ‐ 7 cellákban

Teljes hossz Ces2c klónoztuk a pFLAG-CMV-5.1 vektorba, és átmeneti expresszióhoz használtuk COS-7 sejtekben. A COS-7 sejtekben történő stabil expresszióhoz lentivírust állítottunk elő klónozásával Ces2c a pLVX-IRES ‐ Puro plazmidban, majd az emberi embrionális vesesejtekben virionokká történő összeszerelés. Részletes információk a Támogató információk részben találhatók.

TGH-aktivitás és diglicerid-hidroláz vizsgálatok sejt- és szövetlizátumokban

A TGH és a diglicerid-hidroláz (DGH) aktivitás vizsgálatát néhány kisebb módosítással beszámoltuk. 9 Részletes információk a támogató információkban találhatók.

FA beépítési tanulmányok és FAO a sejttenyésztésben

Megmérni ex vivo Az FA anyagcseréje stabilan Ces2c a transzdukált COS-7 sejteket radiojelzett olajsavval (OA) inkubáltuk, és 4 órán át éheztettük. A FAO méréseket COS-7 sejtekben hajtották végre, amelyek stabilan túlexpresszálták a FLAG-jelölést Ces2c radiojelzett palmitinsav (PA) alkalmazása a leírás szerint. 10 Részletes információk a Támogató információk részben találhatók.

RNS és fehérje módszerek

A szöveti RNS-t Trizol reagenssel extraháltuk, és kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakciót hajtottunk végre az Applied Biosystems StepOnePlus detektáló rendszer (Foster City, Kalifornia) alkalmazásával. Az alapozókat az S2 támogató táblázat tartalmazza.

Western Blot elemzések

Western blot elemzéseket vagy COS-7 vagy Expi293 sejtek sejtlizátumaival, vagy bél-, máj- vagy Musculus (M.) quadriceps szöveti lizátumok Ces2c int egerekből standard eljárások szerint.

Állatok és étrend

Transzgenikus egereket állítottak elő egeret expresszálva Ces2c komplementer DNS (cDNS) a bélspecifikus 12,4 kb méretű villin promoter irányítása alatt. A részleteket a támogató információk tartalmazzák. Az egerek specifikus kórokozótól mentes minőségét megerősítették a Laboratóriumi Állattudományi Egyesületek jelenlegi szövetségének ajánlásai szerint. Az állatokat Tecniplast 2-es típusú ketrecekben (Tecniplast, Hohenpeißenberg, Németország) helyeztük el normál laboratóriumi körülmények között (szobahőmérséklet, 21 ± 1 ° C [átlag ± SEM]; relatív páratartalom, 45% -65%; fényperiódus, 14L: 10D) és standard laboratóriumi chow-étrenddel (4,5% zsír) vagy magas zsírtartalmú étrenddel (HFD) (45% zsír; ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Németország) és csapvízzel együtt szállítják ad libitum. Eltérő rendelkezés hiányában a hím egereket 12-16 hetes korban vizsgálták. A vizsgálatok során hemizigóta alomtársakat használtunk, és az egereket legalább ötször kereszteztük a C57BL/6N-ről a C57BL/6JRj háttérre. A szöveteket és szerveket összegyűjtöttük és azonnal lefagyasztottuk. Az egerek genetikai módosítását, karbantartását, kezelését és szövetgyűjtését az Osztrák Szövetségi Tudományos és Kutatási Minisztérium, valamint a Grazi Egyetem és a Bécsi Állatorvostudományi Egyetem etikai bizottsága hagyta jóvá.

Plazmakémia

A plazma paraméterek elemzéséhez az állatokat rövid ideig érzéstelenítettük, és vért gyűjtöttünk az orbitális plexusból. A plazma TG-ket, a szabad zsírsavakat (FFA), az összes foszfolipideket és az összes koleszterint kereskedelmi készletekkel határoztuk meg (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; Merck, Darmstadt, Németország; Wako Chemicals, Neuss, Németország; DiaSys Diagnostics, Holzheim, Németország; Roche Diagnostics, Rotkreuz, Németország). A vércukorszintet Wellion CALLA glükométerrel (Med Trust, Marz, Ausztria) határoztuk meg, és a plazma inzulinszintet egér Insulin ELISA Kit (Hölzel Diagnostika GmbH, Köln, Németország) segítségével mértük.

A máj és a bél lipidjeinek meghatározása

A máj lipidjeit Folch és mtsai. 11. és kereskedelmi készlet (Thermo Fisher Scientific) segítségével mértük. A bélszövet-explantátumokat Matyash és munkatársai (12) szerint extraháltuk, és célzott lipidomikai elemzést végeztünk ultraperformáns folyadékkromatográfiás tömegspektrometriás elemzéssel (Bruker, Billerica, MA). Részletes információk a Támogató információk részben találhatók.

Étkezés utáni lipoprotein és chilomicron szekréció

Az étkezés utáni lipoprotein clearance-et és a chilomicron szekréció sebességét a leírásnak megfelelően határoztuk meg. 13 Részletes információk a Támogató információk részben találhatók.

Glükóz tolerancia és étrendi zsírfelvétel

A glükóz tolerancia teszteket 6 órás éhgyomri egereken végezték. A zsír felszívódását a vékonybél hosszában a leírás szerint értékeltük. 13.

Metabolikus fenotipizálás

Az akklimatizált egereket laboratóriumi állatok megfigyelő rendszerében helyezték el, lehetővé téve a mozgásszervi aktivitás, az oxigénfogyasztás és a szén-dioxid eliminációjának folyamatos mérését. Az aktivitás-alapú energiafelhasználás (AEE) és a nyugalmi anyagcsere sebesség (RMR) kiszámítását van Klinken és mtsai leírása szerint végezték. 15 Részletes információk a támogató információkban találhatók.

Az oxigénfogyasztási arányok elemzése

Az oxigénfogyasztási arányok (OCR) vizsgálatához nagy felbontású respirometriát végeztünk frissen készített bél teljes szöveti lizátumokkal. Részletes információk a Támogató információk részben találhatók.

Zsírfelszívódás, székletanalízis és székletkimenet

A zsírabszorpciót a leírt szacharóz-polibehenát-módszerrel határoztuk meg. A széklet mennyiségét 5 egymást követő napon mértük. A széklet energiatartalmának mérésére egyházban elhelyezett, HFD-vel táplált egerek ürülékét égették el egy adiabatikus oxigénbomba kaloriméterben.

Statisztikai analízis

A statisztikai szignifikanciát a pár nélküli Student határozta meg t teszt (2 farkú) vagy a kovariancia elemzése (ANCOVA). A csoportkülönbségeket jelentősnek tekintették *P

Eredmények

A Ces2c hatékonyan hidrolizálja a csoportokat és a főigazgatóságokat, és elősegíti a FAO-t

A Ces2c int egerek fokozott intesztinális lipolízist és oxidatív légzést mutatnak

A Ces2c int egereket védik a HFD okozta elhízás ellen

Bél Ces2c A túlexpresszió megvédi az egereket a HFD által kiváltott NAFLD-től és javítja a máj inzulinérzékenységét

A Ces2c int egerek normális táplálékfelvételt és enyhe változásokat mutatnak a HFD energiaköltségeiben

A HFD-n lévő Ces2c egerekben megfigyelt karcsúbb fenotípus különböző mechanizmusokkal magyarázható, ideértve az élelmiszer-bevitel és/vagy az energiafelhasználás változását (EE). A bél következményeinek kezelése Ces2c az egész test energia katabolizmusának túlexpressziója miatt az egereket metabolikus ketrecekben helyeztük el. Az oxigénfogyasztást és a széndioxid-kibocsátást folyamatosan mértük a légzési csereáram (RER) kiszámításához. Nem figyeltünk meg szignifikáns változást a teljes és a könnyű fázisú RER átlagában, körülbelül 0,85-ös értékek jelzik a zsír és szénhidrát keverékének égését. Érdekes, hogy a RER jelentősen megnőtt a Ces2c egerekben a sötét fázisban, ami azt jelzi, hogy az oxidatív üzemanyagként elmozdultak a szénhidrátok (5A. Ábra). A napi táplálékfelvétel (S5A ábra alátámasztása, bal oldali panel) vagy a teljes táplálékbevitel, amelyet 2 héten keresztül figyeltek HFD-vel (5B. Ábra, bal oldali panel), lényegében változatlan volt a Ces2c int egerek között a kontrollokkal összehasonlítva. Az aktivitási szintek összehasonlíthatók voltak a csoportok között is (5B. Ábra, középső panel). Érdekes módon a testhőmérséklet enyhén emelkedett a Ces2c int egerekben (5B. Ábra, jobb oldali panel). Az összes energiafelhasználás (TEE) alacsonyabb volt a Ces2c egerekben a kontrollokhoz képest (P = 0,07) (5C. Ábra), ami az alacsonyabb RMR (P eg egerek (P

A Ces2c int egerek normális lipid felszívódást mutatnak, de változások vannak a bél lipid homeosztázisában

Bél Ces2c A túlexpresszió növeli a chilomicron részecskeméretét és hasadékát

Vita

A legtöbb TG-t 2-MG-re emésztik és felszívják a vékonybélben 26, 27 az újraészterezés és a TG-k előállítása céljából, amelyek vagy citoszolos LD-be vannak csomagolva, vagy Mttp segítségével apoB48-on. Ezért azt javasoljuk, hogy a Ces2c megnövekedett luminális bősége növelje a TG/DG lipolízist az ER-ben, ezáltal FA-kat generálva az oxidációhoz, MG-ket/DG-ket pedig az újraészterezéshez és a TG-termeléshez, ami több lipidezett apoB48 részecske képződéséhez vezet (5. ábra). 8.), amelyeket hatékonyan törölnek a forgalomból. Alternatív megoldásként az is elképzelhető, hogy a fokozott TG/DG lipolízis az ER-ben térben csökkenti a TG szintjét az Mttp-közvetített apoB48 lipidációhoz. A nem lipidált apoB48 instabil és lebomlik a proteazomális úton. 28 Következésképpen a kevesebb ősrészecske több TG-t (és koleszterin-észtert) szerezhet, ami a részecskeméret növekedéséhez és a keringésből való hatékony felszabaduláshoz vezet.

Ez a tanulmány együttesen tisztázza a bélrendszert Ces2c/CES2 a NAFLD és az elhízás fejlődésének ellensúlyozására.

Potenciális összeférhetetlenség

Dr. Lackner támogatást kapott Galmedtől.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Astrid Steinernek és Birgit Juritsch-nak az állatok gondozását és genotipizálását, Silvia Schauernek a szövettani elemzéseket, valamint Dr. Susanne Grondnak, Anton Ibovniknak és Tina Bernthalernek a technikai segítséget. Ezenkívül köszönetet mondunk Dr. Sabrina Riedlnek és Dr. Dagmar Zweyticknek a zetasizer elemzéssel nyújtott technikai támogatásért és Werner De Ceccónak a széklet energiatartalmának méréséért nyújtott technikai támogatásért.

Kérjük, vegye figyelembe: A kiadó nem felelős a szerzők által szolgáltatott bármilyen kiegészítő információ tartalmáért vagy működéséért. Bármilyen kérdést (a hiányzó tartalom kivételével) a cikk megfelelő szerzőjéhez kell irányítani.

1 Klop B, Elte JWF, Cabezas MC. Dyslipidemia elhízásban: mechanizmusok és lehetséges célpontok . Tápanyagok 2013; 5: 1218 - 1240 .

A szerzőnevek félkövéren jelölik a megosztott első szerzőséget.