A karnitin-metabolitok ketogén étrendjének monitorozása szubkután mikrodialízissel

Absztrakt

A magas zsírtartalmú, alacsony szénhidráttartalmú KD bizonyítottan hatékony a gyermekkori epilepsziák kezelésében (1). A KD metabolikus hatása összehasonlítható az elhúzódó koplalással. A glükóz szubsztrátumokat β-OHB, acetoacetát és szabad zsírsavak helyettesítik. A karnitin nagy szerepet játszik a zsírsavak lebontásában. Trimetilezett aminosavként megkönnyíti a zsírsavak áttelepülését a mitokondriumba, ezért nélkülözhetetlen kofaktor a zsírsav oxidációban és a ketogenezisben (2). Emlősökben kimutatták a karnitin mintázatának változását a plazmában és számos szövetben a táplálkozási állapot változásával. Embereken végzett vizsgálatok kimutatták a plazma szabad karnitin késleltetett csökkenését és a hosszú és különösen rövid láncú acilkarnitinek gyors növekedését az éhezés vagy a diabéteszes ketózis során (3-5). Gyermekeken végzett vizsgálat kimutatta, hogy az acilkarnitinek zsírterhelés (napraforgóolaj lenyelése) során bekövetkező változásai többé-kevésbé összehasonlíthatók az éhgyomri változásokkal (6 A karnitin metabolizmusának dinamikájáról, különös tekintettel a C4OH-ra, a KD megindítása során azonban eddig nem számoltak be.

Az MD technika hatékony eszköz a szöveti anyagcsere vizsgálatára. A módszer az anyagok diffúzióján alapszik egy féligáteresztő dialízis membránon keresztül, amelyet a kívánt szövetbe ültetnek be. Ez lehetővé teszi a membránon átjutott szövetmolekulák koncentrációinak ismételt mérését. A katéter kizárási méreténél kisebb molekulatömegű, vízoldható analitok keresztezik a membránt, amíg az extracelluláris folyadékban és a mikrodializátumban lévő koncentrációjuk meg nem egyezik (7,8). A klinikai gyakorlatban MD-t sikerült megállapítani, különösen a glükóz, laktát, piruvát, glicerin és karbamid ágy melletti monitorozására szolgáló neurointenzív ellátásban (9,10).

Az MD folyadékban mért karnitin a környező szövet megkötetlen karnitin metabolitjait tükrözi. A C0 és a rövid láncú acilkarnitinek, mint a C2 és C4OH, túlnyomórészt szabad formában fordulnak elő. A plazmában és az interstitiumban található acilkarnitinek részben kötődnek a plazmafehérjékhez. A fehérjéhez kötött karnitin aránya a megkötött zsírsav hosszával növekszik.

Eddig az MD-t nem alkalmazták karnitin mérésére emberi szövetekben. Vizsgálatunkban megmutattuk, hogy az MD alkalmazható a karnitin metabolitok meghatározására az s.c. szövet. Sőt, ez a technika lehetővé teszi az áramellátás változásainak részletes elemzését. karnitin mintázat KD-vel az idő múlásával.

BETEGEK ÉS MÓDSZEREK

Az alkalmazott MD eszköz (CMA/Microdialysis AB, Solna, Svédország) CE-tanúsítvánnyal rendelkezik az emberi agy és az s.c. klinikai alkalmazásához. szövet. A tanulmányt a helyi etikai bizottság jóváhagyta, és a szülők írásos beleegyezését kapták.

Betegek.

Hét gyermekbeteg kezdte meg a KD-t kezelhetetlen gyermekkori epilepszia miatt. A beteg medián életkora 2,5 év volt (0,9–10,6 éves tartomány).

A KD hosszú láncú trigliceridekből áll, 4: 1 arányban (4 g zsír/1 g fehérje + szénhidrátok), és egy szokásos protokoll szerint kezdeti koplalási periódussal vezették be (11, 12).

A koplalást az MD katéter behelyezésének napján 1900 órakor kezdték (d 0), és 24 órán át folytatták (d 1). A d 1 1900 órakor a betegek megkapják az első ketogén ételt, amely a végső kalóriaigény egyharmadából áll. A 2. napon a kalóriák mennyiségét kétharmadra növelték, és négy étkezésre osztották. D 3-tól kezdve a betegek napi négy ketogén étkezés során kapták meg a teljes kalóriamennyiséget.

Mivel a metabolikus dekompenzáció kockázata különösen magas a KD kezdetén, szorosan figyelemmel kísértük a betegeket, s.c.-vel meghatároztuk a glükózt, laktátot és piruvátot. MD. Ezenkívül minden reggel éhgyomorra, majd 4 óránként kapilláris vérvizsgálatokkal ellenőriztük a β-OHB-, glükóz- és gázellenőrzéseket.

Mikrodialízis.

Az MD alapelveit korábban (13–15) részletesen leírtam. CMA 70 MD katétert (CMA/Microdialysis AB) használtunk 20 mm-es dialízismembrán hosszúsággal. A poliamid membrán molekuláris kizárási mérete 20 kD volt. Az újszülötteknél és a gyermekeknél alkalmazott alkalmazás szerint (16, 17) az MD katétereket steril körülmények között, transzdermális helyi érzéstelenítéskor (EMLA, Wedel, Németország) helyeztük be a s.c. az oldalsó comb (fiatalabb gyermekek) vagy az alkar (idősebb gyermekek) szövete. Intravénás műanyag kanüleket (Vasofix Braunüle, 18 G; Braun Melsungen, Melsungen, Németország) használtunk útmutatóként.

A katétert folyamatosan steril izotónium-oldattal (NaCl 0,9% Braun Melsungen) perfundáltuk. Az alacsony, 0,3 μL/perc áramlási sebességet akkumulátorral működtetett szivattyú (CMA 106 MD szivattyú, CMA/Microdialysis AB) biztosította. A dializátum mintákat mikrotestekben (CMA/Microdialysis AB) gyűjtöttük össze egy injekciós üvegtartóban, amelyet a katéter kimeneti csövének végén rögzítettünk. Az MD időtartama 4 és 7 nap között volt, és komplikációk nélkül hajtották végre. A dializátumokat 2 óránként gyűjtöttük, és először a CMA 600 mikrodialízis analizátorban (CMA/Microdialysis AB) elemeztük az ágy melletti glükóz, laktát és piruvát szintjét. A maradék dializátumokat -21 ° C-on fagyasztottuk a későbbi karnitin meghatározásához.

A karnitin relatív gyógyulási arányának in vitro meghatározása.

A dializátumban érdekelt anyagok koncentrációi arányosak az extracelluláris folyadék koncentrációival, a membrán hosszától és szerkezetétől, az áramlási sebességtől és a szövetek hőmérsékletétől függően, az MD-rendszer relatív helyreállítási sebességében (RR) kifejezve: RR = koncentráció ( dializátum)/koncentráció (környező közeg).

Meghatároztuk a rendszerünk relatív gyógyulását in vitro a katétert hígított vagy karnitinnel kiegészített humán szérum tesztoldataiba merítve.

0,9% NaCl vagy karnitin törzsoldat hozzáadásával az emberi szérumhoz hat különböző koncentrációjú oldatot kaptunk. 5–174 μmol/l, C2, 7–65 μmol/l és C4OH, 0,09–0,43 μmol/l tartományban voltak.

A szérumfehérjék mátrixhatásainak elkerülése és a szöveti folyadék körülményeinek megteremtése érdekében a standard oldatokat ultracentrifugálással készítettük, ultracentrifugacsövek (Centrisart®, Sartorius AG Göttingen, Németország) felhasználásával, 20 000 D molekulatömeg-kizárási nagysággal.

Ezután egy 20 mm membránhosszúságú CMA 70 MD katétert merítettünk az ultraszűrőkbe, és szobahőmérsékleten kevertük. Az MD-t a in vivo áramlási sebessége 0,3 μL/perc, és a dializátum gyűjtése előtt legalább 4 órán át egyensúlyban volt. Az ultraszűrőkben és dializátumokban levő CO és acilkarnitint számszerűsítettük, és az ultraszűrőkben és a dializátumokban a karnitin koncentrációinak arányát használtuk az MD rendszer RR meghatározásához.

Karnitin meghatározása.

A CO és az acilkarnitint Perkin Elmer API 365 tandem tömegspektrométerrel (18) számszerűsítettük. A mikrodializátumokban és ultraszűretekben lévő karnitineket közvetlenül tömegspektrometriával határoztuk meg.

Statisztikai analízis.

A statisztikai elemzést a Statistics Package for Social Science 11.5 verzió (SPSS Inc, Chicago, IL) számítógépes programmal hajtottuk végre. A statisztikai szignifikanciát varianciaanalízissel teszteltük ismételt mérésekhez. Post hoc a teszteket egyoldalúan végeztük. Bonferroni korrekciót alkalmazva a szignifikancia szintet 1,7% -ban határozták meg. Az eredményeket mediánban (tartományban) vagy átlagban (± SD) fejezzük ki.

EREDMÉNYEK

RR in vitro.

Az RR in vitro meghatároztuk a CMA 70 MD katéterhez 0,3 μL/perc áramlási sebességgel. A karnitin-koncentrációk aránya a dializátumban és az ultraszűrőben a C0 esetén 86% (± 7%), a C2 esetében 88% (± 7%), a C4OH esetében pedig 83% (± 9%) átlagértéket mutatott ( Asztal 1).

Változások a szöveti karnitin mintázatában.

A kezdeti éhomi időszakban (24 óra) a β-OHB szintje a perifériás vérben 0,13 mmol/l-ről (± 0,14 mmol/l) 2,80 mmol/l-re (± 1,91 mmol/l) emelkedett. 2 d KD után (d3) a β-OHB szintek minden betegnél meghaladták az 5 mmol/l értéket.

A szubkután C2 szint jelentősen megnőtt (o = 0,001) az éhezési időszakban, 5,13 μmol/L-ről (2,39–6,49 μmol/L) koplalás előtt 13,13 μmol/L-re (5,35–21,1 μmol/L) 24 órás éhezés után. A C2 24 órás ketogén táplálkozás után folyamatosan emelkedett KD-vel 22,42 μmol/L (9,13–27,24 μmol/L) koncentrációig, majd stabil maradt (1. ábraA).

A ketózis hatása a C2-re (A), C4OH (B) és C0 (C) az sk. szövet. A C2 (μmol/L) és a C4OH (μmol/L) az éhezéssel és a ketogén táplálkozással szignifikánsan növekedett (pC2 = 2 × 10 −7, pC4OH = 1,4 × 10 −5). s.c. A C0 (μmol/L) lassan csökkent ketózissal (o = 0,001). Minden boxplot 28 értéken alapul (betegenként négy érték).

A szubkután C4OH-szint 3,6-szorosára nőtt 24 óra éhgyomorra 0,01 μmol/L-ről (0,01–0,02 μmol/L) 0,05 μmol/L-re (0,04–0,22 μmol/L) (o = 0,0025). A C4OH 24 óra KD után elérte a 0,33 μmol/L (0,12–0,41 μmol/L) értéket. A szint 23-szor magasabb volt, mint a normál táplálkozásnál, és stabil maradt a KD második napján (1. ábraB).

C0 az áramellátásban a szövet lassan, 33,68 μmol/L (22,48–54,47 μmol/L) értékről 28,24 μmol/L-re (20,89–33,94 μmol/L) csökkent koplalás után (nem szignifikáns), és 23,62 μmol/L (19,31–28,83 μmol/L) után 2 d KD (szignifikáns a kiindulási értékhez normál táplálkozás esetén, o = 0,0045) (1. ábraC).

Erős pozitív korrelációt találtunk a vérben a β-OHB szinttel és a s.c. szövet (r = 0,91, 2. ábra), és a β-OHB mérsékelt korrelációja a vérben és a C2 az s.c. szövet (r = 0,7).

A szérum β-OHB szorosan korrelál az s.c. C4OH. A β-OHB-t C4OH-val ábrázoljuk a dializátumban (r = 0,91, beleértve a hét beteg adatait).

A karnitin változásainak megfelelően az s.c. szövetben a szérum C0 csökkenését, valamint a C2 és C4OH növekedését figyeltük meg a ketózis növekedésével.

VITA

Sc.c-t használtunk MD gyermekeknél a KD monitorozásához a C0, C2 és C4OH szöveti karnitin mintázatának változásai által.

Az MD rendszer magas relatív helyreállítása in vitro készült s.c. A szöveti karnitin koncentrációjának monitorozására alkalmas MD (15).

A gyermekek ketózisát koplalással indukálták, és ketogén táplálékkal tartották fenn, a karnitin metabolitok jellegzetes eltolódása kísérte az s.c. szövet. Így a C0 lassan csökkent, míg a C2 és a C4OH a ketózissal gyorsan növekedett.

Eddig állatokon és embereken végzett éhomi kísérletek eredményeinkhez hasonló változásokat tártak fel a vér és a vizelet karnitin mintázatában. Böjt vagy diabéteszes ketózis esetén a plazma és a vizelet C0 késleltetett csökkenését, valamint a hosszú és különösen rövid láncú acilkarnitinek gyors növekedését találták, és jól korreláltak a plazma ketonszintjének emelkedésével (4,5,19). Számos állati szövetet is vizsgáltak ketotikus körülmények között a karnitin metabolitok, például a máj (20–23), a vázizom (20–23), a szív (22–24), a vese (20,23) és az agy (24) szempontjából.

A C0 szint főleg azért csökken, mert észterezett formában tárolódnak. Hoppel és Genuth (19) vizsgálata felfedte az acilkarnitinek vizelettel történő kiválasztásának növekedését ketózis során, ami karnitinveszteséghez vezethet.

A C2 növekedése az acetil-koenzim A (CoA), a β-oxidáció végtermékének növekedését tükrözi. A mitokondriumban lévő karnitin-acetil-transzferáz révén az acetilcsoport az enzim egyensúlyi állandójától függően karnitinbe kerül. A C2 acetil-CoA-ból történő előállításával a karnitin acilnyelőként működhet a szabad CoA megfelelő sejtszintjének fenntartása érdekében (25). Hoppel és Genuth (19) szerint a C2/karnitin arány tükrözi a megfelelő CoA arányt, és így tükrözheti az energiaszintet.

A C4OH mintázat változásait, különösen a karnitinekkel kombinálva, eddig nem vizsgálták. MD-tanulmányunk feltárta a s.c. jellemző változásait C4OH mintázat, amely korrelált a vérben a β-OHB szintjének növekedésével. 24 órás koplalás után a szint ötszörösére nőtt, és tovább nőtt a KD értékével, 23-szor nagyobb értékre az éhezés előtti szinthez képest. Az s.c. A C4OH szoros összefüggésben volt a vérben lévő ketontestek szintjével (r = 0,91). Koncentrációjától függően a β-OHB egy nem specifikus enzimatikus reakcióban kapcsolódhat a karnitinhez, amint azt az acetoacetil-CoA esetében leírják (25). Tehát a C4OH/CO az energiaszint közvetett markere is lehet. A C4OH továbbá nagyon érzékeny paraméter lehet a ketotikus állapot mértékére nézve, mivel a test karnitin tartalékának paraméterét tartalmazza a keton testek hatékony metabolizmusának előfeltételeként. Megfelelő szubsztituált karnitinszintet jelezve a C4OH lehet a pontosabb paraméter a ketózis állapotának monitorozásához, mint önmagában a keton testek.

Megállapítottuk, hogy a KD olyan terápiás táplálkozás, amely fontos változásokat okoz a betegek anyagcseréjében, és előnyös a betegek energiaállapotának szoros figyelemmel kísérése, különösen a diéta kezdetén. A szubkután MD és a spektrometrikus karnitin meghatározása együttesen lehetővé teszi a szövetek anyagcseréjének minimálisan invazív, szoros és kiterjedt monitorozását.