A Caspase szerepe az emberi vérlemezkék aktiválására adott válaszok részhalmazában

  • Osztott képernyős
  • Megosztás ikonra Ossza meg
    • Facebook
    • Twitter
    • LinkedIn
    • Email
  • Eszközök ikonra Eszközök

    • Anna Shcherbina, Eileen Remold-O’Donnell; A Caspase szerepe az emberi vérlemezkék aktiválására adott válaszok részhalmazában. Vér 1999; 93 (12): 4222–4231. doi: https://doi.org/10.1182/blood.V93.12.4222

      kaszpáz

      Hivatkozási fájl letöltése:

      Absztrakt

      PA LETELETEK A hemosztázis és a trombózis fő szereplői. A fiziológiai agonistákra adott egyéb válaszok mellett az aktivált vérlemezkék negatív töltésű foszfotidil-szerint (PS) tesznek ki a trombocita külső oldalán, és felszabadítják a PS-pozitív mikrorészecskéket, amelyek mind hozzájárulnak a fibrin lerakódásához azáltal, hogy kompetens felületeket biztosítanak a koagulációs faktorok összeállításához és a trombus képződéséhez. A keringő mikrorészecskék száma különféle trombotikus rendellenességekkel, például aktivált koagulációval, átmeneti ischaemiával, miokardiális infarktussal és posztsebészeti beavatkozással jár együtt kardiopulmonális bypass betegeknél. vérlemezke funkció.

      A PS expozíciója és a mikrorészecskék felszabadulása csak a vérlemezkék aktiválódásának nagyobb folyamatánál fordul elő. Ezzel szemben a vérlemezkék aktiválási reakcióját számos alesemény és szabályozó mechanizmus különbözteti meg. Különösen figyelemre méltó a válasz szekvenciális jellege és az egyes lépések időbeli elrendezése. Számos párhuzam különböztethető meg a vérlemezkék programozott aktivációs válasza és a magozott sejtek programozott halála között - az apoptotikus folyamat között. A közös jellemzők magukban foglalják az összehangolt morfológiai változások kiemelkedését és nagyrészt az irreverzibilitás minőségét. A vérlemezkék aktiválásában, csakúgy, mint az apoptózisban, a foszfatidil-szerin transzkétszintes vándorlása a külső membrán szórólapjába fontos esemény, megkönnyítve a fagocita sejtekkel való kölcsönhatást, és a vérlemezkék mellett ezen felül a prokoaguláns felületet is létrehozva. Ezenkívül a vérlemezke mikrorészecskék képződésének folyamata morfológiailag hasonló az atommagsejtes sejtek apoptózisának membránfújási fázisához. Ezek a közös jellemzők arra késztettek minket, hogy vizsgáljuk meg a kaszpázok, a proteázcsalád vérlemezke-aktivációjának lehetséges szerepét, amely szorosan összefügg a magozott sejtek programozott halálával.

      A kaszpázok, amelyek az aszparaginsav után hasadó ciszteinil-proteázok, az apoptózis kulcsfontosságú hatásai. A család emberben legalább 11 enzimből áll. 7–9 Az apoptotikus jelekre reagálva egy adapter domént tartalmazó iniciátor-kaszpáz, például kaszpáz-8, -9 vagy -10 profilja kerül felszíni membránra. komplex vagy mitokondriális eredetű komplex, ahol az autoproteolitikusan a két alegység aktív formájává alakul. Az eredetileg aktivált kaszpáz más prokaszpázokat dolgoz fel/aktivál, amelyekből hiányzik az adapter domén, beleértve a kaszpáz-3-at és a -7-et, utóbbiak, az effektor-kaszpázok pedig alkalmatlanná teszik az alapvető homeosztatikus útvonalakat a specifikus célok korlátozott hasításával.

      A sejtmag sejtes apoptózisának másik jellemzője a szelektált citoszkeletális fehérjék hasítása effektor kaszpázokkal.10,11 Ebben a tanulmányban az ERM (ezrin-radixin-moesin) család egyetlen citoszkeletális fehérjére, a moezinre, az emberi vérlemezkék egyetlen tagjára koncentrálunk12,13 fehérjék, amelyek stabilizálják a felszíni vetületeket azáltal, hogy összekapcsolják az alatta lévő aktin citoszkeletont a plazmamembránnal. 14,15 Az agonistára reagálva a thrombocyta moesin gyorsan foszforilálódik, átmenetileg lokalizálódik az újonnan képződő filopodialis/lamellipodialis vetületekre, 12,16 és ezt követően proteolitikusan hasad, A 16a. Reakció várhatóan befejezi a moesin linker működését és megkönnyíti a vérlemezke késői citoszkeletális változásait, amelyek az alvadék visszahúzódásához és a mikrorészecskék felszabadulásához szükségesek. A moin-hasításhoz kalpainra (Ca 2+ -aktivált proteáz) van szükség, amely a mikrorészecskék felszabadulásához is szükséges 17,18; a tiszta kalpain önmagában azonban nem hasítja a moezint, 13 ami arra utal, hogy szükség van egy második proteázra.

      Ez a jelentés új utat nyit meg azáltal, hogy bemutatja a kaszpáz jelenlétét és új funkcióját az emberi vérlemezkékben. Meghatározzuk az effektor kaszpáz, a kaszpáz-3 zimogén formáját, mint az emberi vérlemezkék alkotórészét, és bemutatjuk, hogy a prokaszpáz-3 akkor aktiválódik, amikor az izolált vérlemezkéket fiziológiai agonisták stimulálják. Kimutatták, hogy a kaszpáz-3 specifikus sejt-permeant inhibitora gátolja az agonista által kiváltott PS expozíciót és a mikrorészecske felszabadulást. A kaszpázinhibitor megakadályozza a moesin strukturális fehérje hasítását is az aktivált vérlemezkékben. A proteázgátlókkal végzett összehasonlító kísérletek azt mutatták, hogy a kaszpáz és a kalpain egyaránt funkcionál agonista által kiváltott késői vérlemezke-aktiválási eseményekben (PS expozíció, mikrorészecske felszabadulás és moesin hasadás), és azt bizonyítják, hogy a két proteáznak külön szerepe van.

      ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

      Trombocita izoláció.

      Az írásos beleegyezést adó normális egészséges donoroktól frissen vett vért sav-citrát-dextrózban (ACD; NIH A képlet) műanyagban gyűjtötték, és szobahőmérsékleten azonnal frakcionálták. A sejteket megszámoltuk egy MAX-M vérsejt-analizátorral (Coulter Corp, Hialeah, FL). A vért 200 g-on 12 percig centrifugáltuk a vérlemezkében gazdag plazma (PRP) elválasztására. További ACD-t adunk hozzá (1 rész ACD/3 rész PRP), és a vérlemezkéket 800 g-on 15 percig pelletáljuk. A vérlemezkéket trombocita pufferben szuszpendáltuk (10 mmol/l Tris-hidroxi-metil-metil-2-amino-etán-szulfonsav [TES], pH 7,2, 136 mmol/l NaCl, 2,6 mmol/l KCl, 0,5 mmol/l NaH2PO4, 2 mmol/L MgCl2-t, 0,1% glükózt és 0,1% szarvasmarha-albumint), majd az ACD (a végső térfogat 20% -a) és a prosztaciklin (1 μg/ml; Calbiochem, San Diego, Kalifornia) hozzáadása után 800 g-on 10 percig centrifugáltuk. percek. Az izolált vérlemezkék nem tartalmaznak kimutatható eritrocitákat, és kevesebb, mint 1 000 leukocita/4 000 vérlemezke. Az aktiválási kísérletekhez a vérlemezkéket trombocita pufferben szuszpendáltuk, és 90 percig hagytuk helyreállni 37 ° C-on, hogy biztosítsák nyugalmi állapotukat.

      Peptidáz vizsgálat.

      A vérlemezkéket (5x108) 1 ml vérlemezke-pufferben, 2 mmol/l CaCl2-mal és 3 μmol/L A23187-cel inkubáljuk, keverés közben, síkfenekű (14 mm átmérőjű) polietilén ampullákban, 37 ° C-on, a megadott ideig, és 1/3 térfogat 4% Triton X-100, 8 mmol/l EGTA, 20 mmol/l ditiotreitol, 200 μg/ml aprotinin, 200 μg/ml benzamidin és 200 μg/ml leupeptin hozzáadásával lizáltuk. A Triton-lizátumokat (200 μl) 0,1 mmol/l N-acetil-Asp-Glu-Val-Asp-p-nitro-aniliddel (DEVD-pNA; Enzyme Systems Products, Livermore, Kalifornia) vagy N-acetil-Tyr-vel kombináltuk. -Val-Ala-Asp-p-nitroanilid (YVAD-pNS; Sigma, St Louis, MO). A reakciókat 2 órán át síkfenekű 96-lyukú lemezeken inkubáltuk 37 ° C-on, OD405 nm monitorozásával. A perc átlagos ΔOD-értékét a reakció lineáris tartományából számítottuk ki.

      Immunblot.
      A thrombocyta-kaszpáz aktiválása.

      A vérlemezkéket (5 × 10 8) 1 ml trombocita pufferben, 2 mmol/l CaCl2-vel, síkfenekű polietilén fiolákban, 3 μmol/L A23187, 1 U/ml humán trombin, 10 μg/ml kollagén keverés közben inkubáltuk. (ló inakból származó natív kollagénfibrillumok; Horn kollagénreagens; Nycomed Arzneimittel GmbH, München, Németország) vagy trombin és kollagén kombinációja 37 ° C-on 20 percig keverés közben. A reakciót SDS-sel történő szolubilizálással állítottuk le immunoblotta előkészítése céljából.

      Kaspáz és kalpain inhibitorokkal történő kezelés.

      Gátlási kísérletekhez karbobenzoxi-Asp (OMe) -Glu (OMe) -Val-Asp (OMe) -fluormetil-keton (DEVD-fmk), karbobenzoxi-Tyr-Val-Ala-Asp (OMe) -fluormetil-keton (YVAD-fmk) karbobenzoxi-Phe-Ala-fluor-metil-ketont (FA-fmk) vagy hígítószert adtunk a vérlemezkékhez az előinkubálás utolsó 60 percében, a kalpeptint és az E64d-t az utolsó 10 perc alatt. A moesin hasítási kísérletekhez fluor-metil-keton törzseket állítottunk elő dimetil-szulfoxidban, az ajánlott oldószerben vagy dimetil-formamidban. A PS expozíciós kísérletekhez azt találtuk, hogy a vérlemezkék dimetil-szulfoxiddal (0,01–1,0%), de dimetil-formamiddal nem végzett előzetes inkubálása szignifikánsan növelte az A23187 által kiváltott PS-expozíciót (az adatokat nem mutatjuk be). Ezért a PS-expozícióhoz szükséges fluor-metil-keton-állományokat és az összes többi kísérletet dimetil-formamidban készítettük (0,2% végkoncentráció). Ennek a hígítónak az alkalmazásával a vérlemezkék fluorometil-ketonokkal történő 1 órás inkubálása nem változtatta meg a vizsgált paraméterek nyugalmi értékét. A calpeptin és E64d törzseket etanolban vagy dimetil-formamidban állítottuk elő.

      Trombocita aktiváció és áramlási citometria.

      PS expozíciós és mikrorészecske-felszabadítási kísérletekhez 10 7 vérlemezkét 200 μl 2 mmol/l CaCl2-es trombocita pufferban helyezünk szilikonizált 7 × 45 mm-es üveg küvettákba 37 ° C-on aggregációs mérőben (DP-247E; Sienco, Morrison, CO) . A23187-et (1 μmol/L), trombint (humán; 1 U/ml; Sigma) vagy trombint (1 U/ml) plusz kollagént (20 μg/ml) hígított törzsből adunk hozzá, és az első keverés után inkubáljuk. keverés nélkül 37 ° C-on 1-20 percig folytattuk. A thrombocyta-szuszpenziókat körülbelül 22 ° C-os vízfürdőbe helyeztük, és 1 perc múlva 50 μl-t fluoreszcein-izotiocianáttal jelölt annexin V-vel (annexin V-FITC; 1 μg/ml; PharMingen, San Diego, Kalifornia) és fikoeritrinnel kombináltunk. (PE) -jelölt anti-CD41 (GPIIb) MoAb (150 ng/ml; Coulter/Immunotech, Miami, FL) és 10 percig inkubáltuk körülbelül 22 ° C-on. A mintákat ötször hígítottuk 2 mmol/l CaCl2-val ellátott trombocita pufferrel, az áramlási citometriával végzett azonnali elemzéshez.

      A mintákat FACS-Calibur áramlási citométerrel és CellQuest szoftverrel (Becton Dickinson, Mountain View, CA) használtuk. A CD41 + -ra részecskéket kaptunk, hogy megkülönböztessük a vérlemezkéket és a vérlemezkékből származó mikrorészecskéket az elektronikus zajtól. A thrombocyta-kapu alsó határát a nyugalmi vérlemezkék elülső szóródási profilján határozták meg, és az ennél kisebb CD41 + részecskék mikrorészecskéknek számítottak.

      Az a-szemcsék szekréciójának mérésére 107 trombocitát aktiváltunk a fent leírtak szerint, és a reakciót 0, 30 vagy 60 másodperc után leállítottuk azonos térfogatú 2% paraformaldehid hozzáadásával. A rögzített vérlemezkék alikvot részeit 10 percig inkubáltuk 1 μg/ml PE-vel jelölt anti-CD62P-vel (AC1.2 MoAb klón; Becton Dickinson, San Jose, CA) és áramlási citometriával vizsgáltuk.

      A trombinra vagy az A23187-re adott aggregáció mérésére 107 vérlemezkét inkubáltunk a fent leírtak szerint keverés közben, és a fényáteresztést az idő függvényében mértük a gyártó utasításai szerint.

      Moesin-degradációs vizsgálat.

      5 × 108 vérlemezke 1 ml vérlemezke-pufferben történő előinkubálása után síkfenekű polietilén fiolákban CaCl2-t (2 mmol/l) és A23187-et (3 μmol/l) adunk hozzá, és az inkubálást 10 vagy 20 percig 37 ° C-on folytatjuk. keveréssel. A reakciót SDS-sel történő oldással állítottuk le.

      Statisztikai analízis.

      A Student páros t-tesztjét használták az értékek kiszámításához.