A kecsketej fogyasztása megvédi az egereket a szén-tetraklorid által kiváltott akut májkárosodástól és javítja a kapcsolódó bélmikrobiota egyensúlyhiányt

Jiachao Zhang

1 Élelmiszeripari és táplálkozástudományi főiskola, Shaanxi Normal University, Hszian, Kína

2 Élelmiszertudományi és Technológiai Főiskola, Hainan Egyetem, Haikou, Kína

Zhaoxia Wang

1 Élelmiszeripari és táplálkozástudományi főiskola, Shaanxi Normal University, Hszian, Kína

Dongxue Huo

2 Élelmiszertudományi és Technológiai Főiskola, Hainan Egyetem, Haikou, Kína

Yuyu Shao

1 Élelmiszeripari és táplálkozástudományi főiskola, Shaanxi Normal University, Hszian, Kína

Társított adatok

Absztrakt

Bevezetés

A májbetegségek kezelésére használt egyes gyógyszereknek mellékhatásai vannak (7). Ezért elengedhetetlen olyan funkcionális élelmiszerek felkutatása, amelyek megelőzik/megvédik a májkárosodást, de nincsenek (vagy csak kevés) mellékhatásuk van. A tej gazdag tápanyagokban, különösen a kecsketejben, amelyet kisebb kazein micellák és zsírgömbök, valamint magas közepes és rövid láncú zsírsavak (SCFA) miatt könnyebben emészthető és felszívódó, mint a tehéntejet (8). ). A kecsketej fogyasztása megvédheti a sejteket a sérüléstől, és a gyermekek májzsír-beszivárgásának kezelésére használták (9). Ez azt jelzi, hogy a kecsketej potenciális hepatoprotektív tulajdonságokkal bírhat, amelyeket tovább kell vizsgálni.

Anyagok és metódusok

Egerek és kísérleti protokoll

A C57BL/6 hím egereknek (12 hetesek) a kísérlet megkezdése előtt 1 hétig hagyták a testet hozzáállni az állathoz. Az egereket klímaberendezéssel szabályozott helyiségekben (12 órás világos/sötét ciklus; 20–24 ° C; 45–55% relatív páratartalom; egyedi szűréssel sterilizált levegő) egyedi szellőztetett ketrecekben tartották, táplálékhoz és vízhez ad libitum hozzáféréssel. Minden felhasznált ételt, vizet és kísérleti felszerelést sterilizáltak vagy fertőtlenítettek. Az állatok emberséges ellátást kaptak képzett személyzet részéről, és az összes kísérletet a Shaanxi Normal University tudományos etikai bizottságának irányelveivel összhangban hajtották végre.

Kísérleti terv (A) és az egerek nyolc különböző kezelési csoportjából származó máj szövettani elemzése (lásd az 1A ábrát) 1 A) (B) (1) Májminták 1 nappal a CCl4 beadása után (a tejfogyasztás indukált májkárosodásra gyakorolt megelőző hatásainak meghatározása céljából) kezelt UPrev (a) egerekből, MPrev (b) modellegerekből, GPrev (c) kecsketejben részesülő egerekből és egerekből tehéntej CPrev (d) és 8 nappal a CCl4 beadása után (a folyamatos tejfogyasztás indukált májkárosodásra gyakorolt védőhatásainak meghatározása érdekében) kezeletlen kontroll egerekből UProt (i), MProt egér modellből (j), kecsketejet kapó egerekből GProt (k) és tehéntejet kapó egerek CProt (l) (2). Májszövettan [hematoxilin és eozin (H&E)] UPrev (e), MPrev (f), GPrev (g), CPrev (h), UProt (m), MProt (n), GProt (o) és CProt (p) ) egerek. Méretarány: 100 µm e – h és m – p esetén.

A tej megelőző szerepének értékelése a CCl4 okozta májkárosodáson

Az 1–7. Naptól kezdve az UPrev és MPrev kezelési csoportba tartozó egerek napi kétszer 10 ml/testtömeg-kilogramm sterilizált desztillált vizet kaptak gyomor belsejében; egerek a GPrev és a CPrev kezelési csoportokban 10 ml/testtömeg-kg kereskedelmi UHT-kecsketejet és 10 ml/testtömeg-kg kereskedelmi UHT-tehéntejet kaptak, naponta kétszer, gyomor belsejében.

A 8. napon az UPrev csoportba tartozó egerek intraperitoneális injekciót kaptak 1 ml/testtömeg-kg olívaolajjal; az MPrev, GPrev és CPrev csoportba tartozó egerek 1 ml/testtömeg-kg CCl4 (1: 4, v/v, olívaolajban) intraperitoneális injekcióban részesültek. 24 óra elteltével (9. nap) az összes egeret izoflurángázzal altattuk, és aszeptikus körülmények között laparotomiákat végeztünk egy középvonalú bemetszéssel, és a vastagbélből vett mintákat a bél mikrobiota értékelésére. Vérmintákat vettünk, a májokat összegyűjtöttük, folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, és további elemzés céljából -80 ° C-on tároltuk.

A tej védőhatásainak értékelése a CCl4 okozta májkárosodásra

A másik négy csoportba tartozó egereket használtuk fel a folytonos tejfogyasztás védőhatásainak értékelésére, és ugyanúgy kezeltük őket, mint a megelőző kísérletben részt vevő egereket, a 9. napig, de aztán ahelyett, hogy feláldoztuk volna, UProt, MProt, GProt és CProt egereket további 7 napig tovább kapta a sterilizált desztillált vizet, kecsketejet vagy tehéntejet. A 16. napon az összes megmaradt egeret feláldoztuk, és mintákat gyűjtöttünk a korábban leírtak szerint.

Szövettani elemzés

A máj bal lebenyéből származó mintákat 4% paraformaldehidben (4 ° C) rögzítettük, fokozott alkoholban dehidratáltuk és paraffin viaszba ágyazottuk. A beágyazott szöveteket 4 µm vastag metszetekre vágtuk, és morfológiai elemzés céljából hematoxilinnel és eozinnal festettük.

Alanin-transzamináz (ALT) és aszpartát-transzamináz (AST) elemzések

Az ALT és az AST főleg a májsejtekben oszlik el, és amikor a májsejtek membránjai károsodnak vagy nekrózison mennek keresztül, ezek az enzimek nagy mennyiségben jutnak be a szérumba. A szérum vagy plazma enzimaktivitás meghatározása érzékenyen tükrözheti a májkárosodás mértékét (18). A szérumot centrifugálással gyűjtöttük össze (2000 x g 15 percig, 4 ° C-on). Az ALT és az AST szintjét a kereskedelmi forgalomban lévő ALT Activity Assay Kit (MAK052) és az AST Activity Assay Kit (MAK055) segítségével határoztuk meg a gyártó utasításainak megfelelően (Sigma-Aldrich, Inc.). Minden mintát háromszor vizsgáltunk.

Malondialdehid (MDA), szuperoxid-diszmutáz (SOD) és glutation (GSH) elemzések

A májmintákat megmértük és 1 percig homogenizáltuk foszfátpufferben (pH 7,4). A homogenizátumokat 2000 x g és 4 ° C hőmérsékleten 20 percig centrifugáltuk, és a felülúszót óvatosan összegyűjtöttük. A felülúszók MDA, SOD és GSH koncentrációját egér MDA, SOD és GSH ELISA készletek alkalmazásával határoztuk meg a gyártó utasításainak megfelelően (MDA, ml931407; SOD, ml643059; GSH, ml643115; Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd). . Minden mintát háromszor vizsgáltunk.

Kvantitatív RT-PCR assay

Megmértük a gének mRNS-expressziójának szintjét a legfontosabb CYP2E1 enzimekre, amelyek befolyásolják a CCl4 in vivo aktiválódását, és a TNF-α-ra, amely egy gyulladáscsökkentő citokin. A teljes RNS-t 50 mg májszövet-mintából TRIzol® alkalmazásával extraháltuk a gyártó protokollja szerint. A minta RNS-t a SuperScript III RT-PCR kit segítségével cDNS-be írtuk át, majd kvantitatív PCR-t hajtottunk végre fluoreszcens hőmérséklet-ciklusban, SYBR Green-tel és specifikus primerekkel az egyes génekhez. Mindegyik reakciót legalább háromszor megismételtük egymástól. A gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenázt (GAPDH) belső kontrollként amplifikáltuk. Az egyes géneknél alkalmazott primer szekvenciákat az 1. táblázat tartalmazza. 1. A pcr tömb adatait a 2 - (ΔΔCt) módszerrel számoltuk.

Asztal 1

A kutatásban használt PCR primerek.

GeneForwardReverse

CYP2E1	TTTCCCTAAGTATCCTCCGTGAC	CGTAATCGAAGCGTTTGTTGA
TNF-a	TGAGGTCAATCTGCCCAAGT	CTGAGCCATAATCCCCTTTCTA
GAPDH	GGTTGTCTCCTGCGACTTCA	TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC
16S rRNS gén (V3 – V4 régiók)	ACTCCTACGGGAGGCAGCA	GGACTACHVGGGTWTCTAAT

A 16S rRNS gén V3 – V4 régióinak metagenomikus DNS-extrakciója és nagy áteresztőképességű szekvenálása

A vastagbélmintákban lévő mikrobiómából a metagenomikus DNS kivonását és elemzését korábban leírt módszereinkkel hajtottuk végre (19). A 16S rRNS gén V3 – V4 régióit specifikus láncindítókkal (előremutató 338F primer és reverz 806R primer; 1. táblázat táblázat) amplifikáltuk 1) (20). A PCR-termékeket Qiagen Gel Extraction Kit segítségével tisztítottuk. TruSeq ® DNS PCR-mentes minta előkészítő készletet használtunk a DNS könyvtár összeállításához. A DNS-könyvtárat Qubit fluorométer és Agilent Bioanalyzer 2100 alkalmazásával számszerűsítettük; a szekvenálást Illumina HiSeq 2500 rendszerrel végeztük.

A szekvenciaadatok bioinformatikai elemzése

A 250 bp páros végű leolvasásokat szekvenálás útján állítottuk elő; a bioinformatikai elemzést, amelyet ezekhez a szekvencia adatokhoz használtunk, korábban teljes körűen leírtak (8, 19, 20). Röviden: a Qiime pipeline-t (v1.7.0) használtuk az alacsony minőségű címkék kiszűrésére. Az Uparse szoftvert (v7.0.1001) használták a hatékony címkék klaszterezésére az operatív taxonómiai egységhez (OTU) a szekvenciák 97% -os szekvencia-hasonlósága alapján. A magas előfordulási gyakorisággal rendelkező reprezentatív OTU-kat a taxonómiai információkra a Mothur módszer és az SSUrRNA adatbázis segítségével SILVA-ban 0,8–1 küszöbértékkel jegyeztük fel, hogy különböző taxonómiai szinteken (törzs és nemzetség) kapjunk közösségi összetételeket. Több szekvencia összehangolást hajtottunk végre MUSCLE szoftver segítségével a különböző OTU-k és a bél mikrobiotájában uralkodó baktériumok filogenetikai kapcsolatainak tanulmányozására.

Statisztikai analízis

Két vagy több csoport közötti különbségek elemzését a nem-parametrikus Wilcoxon rang-összeg teszt és a Kruskal – Wallis H teszt segítségével végeztük. Az adatok és a hibasávok átlagként ± az átlag standard hibájaként vannak feltüntetve. Statisztikai szignifikanciát akkor feltételeztünk, amikor a P érték 0,05 alatt volt. Az összes statisztikai elemzést R szoftverben végeztük.

Nukleotid-szekvencia hozzáférési szám

Az ebben a tanulmányban jelentett nagy áteresztőképességű szekvenálási adatokat az NCBI adatbázisban rakták le, és a csatlakozási szám: PRJNA437795.

Eredmények

Szövettani elemzés

A tej megelőző szerepe a CCl4 okozta májkárosodásban

A tej védő szerepe a CCl4 okozta májkárosodásban

Nyolc nappal a CCl4 injekció után MProt egerek májszövete és máj lebeny szerkezete (ábra (1B-j, n ábra, 1 Bj, n), GProt egerek (1B-k, o ábra, 1 Bk, o ábra) ) és a CProt egerek (ábra (1B-l, p) 1 Bl, p) hasonlóak voltak az UProt egerekétől (ábra (1B-i, m ábra). 1 Bi, m). A májszövet nekrotikus területe eltűnt, a máj lebeny szerkezete normalizálódott, ami azt jelzi, hogy a szövet megjavult.

ALT és AST elemzések

A tej megelőző szerepe a CCl4 okozta májkárosodásban

Huszonnégy órával a CCl4 beadása után az MPrev és GPrev egerek ALT-szintje a szérumban 72 és 35-ször magasabb volt, mint az UPrev egereké (2.A ábra). 2A). Az MPrev és GPrev egerek szérumában az AST szintje 17 és 9-szer magasabb volt, mint az UPrev egereké (ábra (2B ábra). 2 B). A fent bemutatott csoportok között minden különbség statisztikailag szignifikáns volt (P1A ábra). 1 A). A CCl4 beadása után egy nappal (a tejfogyasztás indukált májkárosodásra gyakorolt megelőző hatásainak meghatározása céljából) mintákat vettünk: kezeletlen kontrollegerekből (UPrev), modellegerekből (MPrev), kecsketejet kapó egerekből (GPrev) és tehenekből álló egerekből. tej (CPrev) és 8 nappal a CCl4 beadása után (a folyamatos tejfogyasztás indukált májkárosodásra gyakorolt védőhatásainak meghatározására) kezeletlen kontroll egerekből (UProt), modellegerekből (MProt), kecsketejet kapó egerekből (GProt) és tehéntejet kapó egerek (CProt). Az indexek a következők voltak: alanin-transzamináz (ALT) (A), aszpartát-transzamináz (AST) (B), malondialdehid (MDA) (C), szuperoxid-diszmutáz (SOD) (D), és glutation (GSH) (E). Az adatok és a hibasávok átlag ± SEM-ként vannak feltüntetve. * P 0,05). Ez azt mutatja, hogy a csúcs májkárosodás 24 órával a CCl4 injekció beadása után következett be, és hogy a májkárosodás mértéke a kecsketejcsoport egerekben szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a modellcsoportban és a tehenek tejcsoportjában, ami párhuzamos volt a hisztopatológiai leletekkel. Ez azt jelzi, hogy a kecsketej megvédi az akut CCl4 okozta májkárosodást és felgyorsíthatja a sérült szövet helyreállítását.

MDA, SOD és GSH elemzések

A tej megelőző szerepe a CCl4 okozta májkárosodásban

Huszonnégy órával a CCl4 injekciója után az MPrev egerek májszövetében az MDA szintje szignifikánsan magasabb volt, mint az UPrev és GPrev egerek májszöveteiben (P2C ábra); 2C); Az MDA szint szignifikánsan magasabb volt a GPrev egerek májszöveteiben, mint az UPrev egerekben (P ábra 2C). 2 C). Az MPrev egerek májszöveteiben a SOD és a GSH szintje szignifikánsan alacsonyabb volt, mint az UPrev egerekben (P2D, E ábra, 2D, E), de a GPrev egerekben nem volt szignifikáns különbség a GSH szintekben az UPrev egerekhez képest (P > 0,05).

A tej védő szerepe a CCl4 okozta májkárosodásban

Az MProt egerek májszövetében az MDA szint szignifikánsan magasabb volt, mint az UProt és a GProt egerek májszövetében (P ábra 2C). 2 C). A GProt és az UProt egerekben nem volt szignifikáns különbség az MDA-szintek között (P> 0,05). A SOD és a GSH szintje szignifikánsan alacsonyabb volt az MProt egereknél, mint az UProt egereknél (P2D, E ábra, 2D, E), de a GProt egerek és az UProt egerek között nem volt szignifikáns különbség az SOD és a GSH szintekben (P> 0,05).