A keringő exosomális miR-20b-5p megemelkedik a 2-es típusú cukorbetegségben, és károsíthatja az inzulin működését az emberi csontváz izomzatában

Absztrakt

Bevezetés

A miRNS-ek a kis, nem kódoló RNS-ek egy osztálya, amelyek transzlációs represszorként funkcionálnak a cél mRNS-vel való közvetlen kölcsönhatás révén (1,2). A miRNS-ek negatívan szabályozzák a specifikus fehérjék bőségét, és ily módon számos sejtes és biológiai folyamatot irányítanak, ideértve az anyagcserét is (3,4). Míg a miRNS-ek átíródnak, és sok hatást gyakorolnak közvetlenül a származási sejtben, a miRNS-ek is szekretálódnak, és stabil miRNS-ek detektálhatók a plazmában (5). A keringő miRNS-eket a legtöbb biofolyadékban kimutatták, beleértve a vért (szérum/plazma), a vizeletet, az anyatejet és a cerebrospinalis folyadékokat, és különféle mechanizmusok védik őket a lebomlástól. A keringő miRNS-ek egy része extracelluláris vezikulákba van csomagolva, például „exoszómákba” (50–200 nm-es membránnal bevont vezikulák) (6–9), amelyek megvédik az RNS-rakományt az endogén RNáz-aktivitástól (10). A miRNS-ek különféle fehérjékhez is kötődhetnek, ideértve a lipoproteineket, nevezetesen a HDL-t vagy az argonaute (AGO) fehérjéket, amelyek az RNS-indukált csendesítő komplexum kulcsfontosságú elemei, miRNS-fehérje-komplexek képződéséhez a szállításhoz (10–12). A plazmában/szérumban levő exoszómák szerepet játszanak a miRNS átjutásában a célsejtekbe, és így szerepet játszanak a sejt-sejt kommunikációban (11–15).

A keringő miRNS-ek jelenléte erőfeszítéseket tett a különböző patológiák, köztük a rák, valamint a szív- és érrendszeri, neurológiai, metabolikus és immunfunkciókat érintő betegségek biomarkereinek azonosítására (16–22). A specifikus keringő miRNS-ek hasznos biomarkerek lehetnek a progresszív betegségek, például a 2-es típusú cukorbetegség (23–25) diagnózisában és kezelésében. Annak ellenére, hogy a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő betegeket hiperglikémia és megemelkedett HbA1c-szint jellemzi, ezeket a változásokat a klinikai kémia csak akkor észleli, ha a metabolikus egyensúlyhiány bekövetkezett. A glükóz homeosztázist és az inzulinérzékenységet szabályozó több szövet hibái gyakran évekkel a diagnózis előtt jelentkeznek (26). Tekintettel a 2-es típusú cukorbetegség összetett patofiziológiájára és betegségterheire, az erőfeszítéseket arra összpontosították, hogy a keringő miRNS-eket új prognosztikus biomarkerekként azonosítsák (27–29).

A mai napig kevés a konszenzus a keringő miRNS biomarkerek pontos természetéről a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő betegek különböző kohorszaiban, és kevéssé ismert az azonosított miRNS-ek funkcionális szerepe (i) a metabolikus folyamatokban, amelyek szerepet játszanak a 2-es típusú cukorbetegség patogenezisében. Itt meghatároztuk a teljes szérum- és exoszomális miRNS expressziós profilt normál glükóz toleranciában vagy 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő férfiaknál, és validáltuk a differenciálisan bőséges miRNS-ek hatását a vázizomzat anyagcseréjére.

Kutatási tervezés és módszerek

A vizsgálat résztvevői és a szérumminták

A tanulmányt a Karolinska Intézet etikai bizottsága hagyta jóvá. Minden önkéntestől tájékozott írásbeli beleegyezést kaptak. Húsz normális glükóztoleranciával rendelkező férfit, 16 csökkent glükóz toleranciájú férfit és 21 2 típusú cukorbetegségű férfit toboroztak újsághirdetések vagy egy egészségügyi alapellátó rendelőből. A 2-es típusú cukorbetegségben szenvedők, a csökkent glükóz tolerancia és a normál glükóz tolerancia résztvevők életkor és BMI alapján megegyeztek. A vizsgálatban résztvevők klinikai jellemzőit az 1. kiegészítő táblázat mutatja be. A vérmintákat szérum és perifériás vér mononukleáris sejtekben választottuk el.

Exoszómával dúsított extracelluláris vezikulák izolálása és nanorészecskék követési elemzése

Az extracelluláris vezikulákat miRCURY Exosome Isolation Kit - Serum and Plasma (Exiqon, Vedbaek, Dánia) szérumból nyertük a gyártó utasításai szerint. Az izolált extracelluláris vezikulum mintákat nanorészecske nyomon követési analízissel (NTA) elemeztük. A mintákat egy NS500 egység mintakamrájába töltöttük (NanoSight, Amesbury, Egyesült Királyság), és mindegyik mintából öt 1 perces videót rögzítettünk (küszöb, 6 - több; elmosódás, automatikus; és a legkisebb várható részecskeméret, automatikus). Az adatok elemzését az NTA 2.3 szoftverrel (NanoSight) végeztük, és kiszámítottuk az extracelluláris vezikulum mintákban lévő részecskék méretét és koncentrációját. A szérumból izolált exoszómával dúsított extracelluláris vezikulák alikvot részét használtuk az NTA-hoz, a fennmaradó izolált extracelluláris vezikulákat pedig exosoma RNS (exoRNS) extrakcióhoz.

RNS extrakció és a miRNS expresszió értékelése

Elsődleges emberi csontvázizom-kultúra és miRNS-transzfekciós protokoll

Műholdsejteket izoláltunk a vastus lateralis vázizomból a korábban leírtak szerint (30). A sejttenyészeteket 37 ° C-on tartottuk 7,5% CO2-tartalom mellett, mint mioblaszt sejteket. A génexpresszió mérésére a myoblast sejteket miotubusokká differenciáltuk, amint azt korábban leírtuk (31). Azokat a myotube sejteket használtuk a teljes RNS extrakcióhoz, a fehérje detektáláshoz és a sejtvizsgálatokhoz, ahol a differenciálódás megkezdése után a 10. napon fúziót és multinukleációt figyeltek meg. A sejteket kettős transzfekciós protokoll alkalmazásával transzfektáltuk 48 órával a differenciálás után (6. nap) és 48 órával később (8. napon) 10 nmol/L Ambion miRNS-20b-5p-vel (Thermo Fisher Scientific). A kontrollsejteket rántott miRNS utánzattal (10 nmol/l) transzfektáltuk. Mindegyik transzfekciót 5 órán át végeztük redukált szérum táptalajban képzett transzfekciós komplexekkel (OptiMEM; Thermo Fisher Scientific), Lipofectamine RNAiMAX transzfekciós reagens alkalmazásával, a gyártó protokollja szerint. Az RNS-t miRNeasy Kit (QIAGEN) segítségével izoláltuk a 10. napon.

Az emberi embrionális vese (HEK293) és az emberi hepatocelluláris carcinoma (HepG2) sejtjeinek kultúrája és miRNS transzfekciós protokoll

A HEK293 és HepG2 sejteket az ATCC-től nyertük, és magas glükózszintű (4,5 g/l) DMEM-ben tenyésztettük 10% (térfogat/térfogat) FBS-sel kiegészítve. A miRNS-20b-5p vagy miRNS utánzatot ezekbe a sejtekbe transzfektáltuk lipofektamin RNAiMAX transzfekciós reagenssel a gyártás protokollja szerint, és az RNS-t a miRNeasy Kit (QIAGEN) segítségével izoláltuk.

Microarray elemzés

A miR-20b-transzfektált sejtek mRNS-tartalmát úgy analizáltuk, hogy biotinilezett szensz cDNS-t hibridizáltunk a GeneChip Human Gene 2.0 ST tömbökhöz (Thermo Fisher Scientific). Érzékelő szálú cDNS-t szintetizáltunk a teljes RNS-ből és a GeneChip WT PLUS Reagent Kit (Thermo Fisher Scientific) jelzéssel ellátott biotinból, mielőtt hibridizálnánk tömbökkel. A géntömböket mostuk, festettük és szkenneltük Affymetrix (Santa Clara, Kalifornia) utasítása szerint. Az adatok előfeldolgozását robusztus multiarray átlaggal, vázlatkvantilis normalizálással végeztük Expression Console szoftverrel (Affymetrix). A transzkriptumok differenciális expresszióját páros osztály összehasonlítással határoztuk meg egyváltozós teszttel, véletlenszerű variancia modell alkalmazásával, összehasonlítva a kontroll gén expresszióját (miRNS utánzó transzfektált sejtek) a miR-20b-5p transzfektált sejtekkel. Olyan gének, amelyek hamis felfedezési aránya −ΔΔCt .

Immunblot elemzés

Western-blot analízist a korábban leírtak szerint végeztünk (32). A felülúszók fehérjetartalmát BCA Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) segítségével határoztuk meg. A membránokat Ponceau S-vel festettük, hogy ellenőrizzük a minták egyenlő betöltését és az átviteli eljárás minőség-ellenőrzését. A membránokat inkubáltuk a glikogén-szintáz (3893-as számú; Cell Signaling Technology), foszforilezett (foszfo) -glikogén-szintáz (3891; Cell Signaling Technology), AKT (9272; Cell Signaling Technology), foszfo-AKT (Thr 308) irányába. (4056; Cell Signaling Technology), a jelátalakító és a transzkripció aktivátora (STAT) 3 (9139; Cell Signaling Technology) és a GAPDH (sc-25778; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX). A membránokat fajnak megfelelő torma-peroxidáz-konjugált másodlagos antitesttel inkubáltuk, mielőtt a fehérjéket fokozott kemilumineszcenciával szemléltettük volna (Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent, GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Egyesült Királyság). Adott esetben a fehérjetartalmat denzitometriával határoztuk meg (1. mennyiség; Bio-Rad). Valamennyi kvantifikációt pozitív kontroll alkalmazásával hajtottuk végre az intergélek variabilitásának ellenőrzésére.

Luciferáz aktivitás mérése

Glükóz beépülése glikogénbe

Az inzulinnal stimulált glükóz beépülését a glikogénbe a korábban leírtak szerint határoztuk meg (30).

Statisztika

Az izolált exoszómával dúsított szérumfrakciók mennyiségi meghatározása NTA-val. Az exoszómák részecskeátmérőjének nagysága (A) és részecskekoncentrációja (B) az NTA által meghatározott. Az értékek átlag = SEM értéket képviselnek n = 20 normál glükóz toleranciával (NGT) és n = 21 2 típusú cukorbetegségben (T2DM) szenvedő férfival szemben. Minden dobozban a középvonalak a mediánokat mutatják; a dobozhatárok az R szoftver által meghatározott 25. és 75. percentiliseket jelzik; a bajuszok az interkvartilis tartomány 1,5-szeresét nyújtják a 25. és 75. percentilis között, a szélső pontokat pontok jelölik. n = 20, illetve 21 mintapont a kontroll alanyok, illetve a 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő alanyok esetében.

Differenciálisan expresszált miRNS-ek az ExoRNS-ben és a teljes szérum RNS-ben normál glükóz toleranciával vagy 2-es típusú cukorbetegséggel rendelkező férfiaktól

Az exoszómákról ismert, hogy nem kódoló RNS-eket hordoznak (6), például miRNS-t. Meghatároztuk a normál glükóztoleranciában vagy 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő férfiak szérumából származó exoRNS miRNS expressziós profilját. A kezdeti szűréshez négy normális glükóztoleranciával rendelkező férfit és négy 2-es típusú cukorbetegségű férfit extraháltunk exoRNS-sel, és a miRNS expresszióját qPCR panel segítségével profilizáltuk. Minden csoportból négy férfit választottak ki véletlenszerűen, még mindig megfelelnek az életkornak és a BMI-nek. Ezen az első képernyőn hat exosomális miRNS-t (miR-20b-5p, miR-532-3p, miR-150-5p, miR-502-3p, miR-363-3p és miR-30d-3p) azonosítottak. a qPCR panelen található 179 miRNS között fel- vagy lefelé szabályozva (P Tekintse meg ezt a táblázatot:

Soron belüli megtekintése
Felugró ablak megtekintése

Az exoRNS miRNS-bőségének differenciális expressziós elemzése

A klinikai paraméterek korrelációja az exosome miRNS tartalommal

A miRNS-eket különböző betegségek progressziós biomarkereként javasolták (19,33). Így meghatároztuk, hogy az exoszóma miRNS expressziója korrelál-e a klinikai paraméterekkel a vizsgálati kohorszokban (2. táblázat). A miR-150-5p exoszómával dúsított extracelluláris vezikulum tartalma nem volt összefüggésben a vizsgálati kohorszok klinikai jellemzőivel (az adatokat nem közöltük), míg a miR-20b-5p tartalma korrelált a 2-órás glükózzal, valamint a zsír százalékával normál glükóztoleranciájú férfiaknál (P Tekintse meg ezt a táblázatot:

Soron belüli megtekintése
Felugró ablak megtekintése

Összefüggés az exosomális miR-20b-5p tartalom és a klinikai jellemzők között

Az miR-20b-5p csökkenti az STAT3 szintjét az emberi sejtekben

A két miRNS közül, amelyeket a 2. típusú cukorbetegségben szenvedő férfiak szérumában exoszómával dúsított extracelluláris vezikulákban jobban expresszáltak, a miR-20b-5p mutatta a qPCR panel adatainak nagyobb mértékű változását (1. táblázat), és a miR-20b- A normál glükóztoleranciával rendelkező férfiak szérumában exoszómával dúsított extracelluláris vezikulák 5p-tartalma korrelált a 2-órás glükózértékekkel (2. táblázat). Így a miR-20b-5p-t három különböző emberi sejttípusba transzfektáltuk, hogy értékeljük a miR-20b-5p gén expresszióra gyakorolt hatását. A miR-20b-5p-t túlzott mértékben expresszáltuk HEK293-ban (vese eredetű sejtvonal), HepG2-ben (májból származó sejtvonal) és primer emberi vázizomsejtekben. A miR-20b-5p expresszió mind a három sejttípusban szignifikánsan növekedett (az adatokat nem mutatjuk be). A STAT3 a miR-20b-5p közvetlen célpontja az MCF-7 emlőrákos sejtekben (34) (kiegészítő 2A. Ábra); így meghatároztuk a miR-20b-5p expresszió hatását az mRNS-re és a STAT3 fehérjetartalmára a transzfektált sejtekben. Míg a STAT3 mRNS-t a miR-20b-5p transzfekció csökkentette mind a HepG2, mind az emberi vázizomsejtekben, a HEK293-ban lévő STAT3 mRNS nem változott (2A. Ábra). Ezenkívül a STAT3 fehérjét miR-20b-5p transzfekcióval csökkentették csak az emberi vázizomsejtek (2B. Ábra).

A miR-20b-5p túlzott expressziójának hatása a STAT3 mRNS-re és a fehérje-bőségre az emberi sejtekben. Az oszlopdiagram a gén vagy a fehérje expresszióját mutatja a negatív kontroll (NC) transzfektált sejt bazálishoz viszonyítva. A stat3 (A) gén expressziója és a STAT3 (B) fehérje expressziója miR-20b-5p (miR-20b) -túl expresszált sejtekben, amelyek különböző emberi szövetekből származnak. * P Tekintse meg ezt a táblázatot:

Soron belüli megtekintése
Felugró ablak megtekintése

A GSEA összefoglalása

Ezután a miR-20b-5p transzfekció után visszaszorított gének validálására összpontosítottunk. Hat feltételezett miR-20b-5p célhely célpásztázási azonosítása alapján hat gént azonosítottunk (expressziós hajtásváltozás> 2,5, P értékek> 0,005), mint lehetséges közvetlen miR-20b-5p céljelölteket (4. táblázat). Ez a hat gén a citokróm b reduktáz 1 (CYBRD1), a TBC1 domén családtag 2 (TBC1D2), az AKT (más néven PKB) kölcsönhatásba lépő fehérje (AKTIP), az RNáz/angiogenin inhibitor 1 (RNH1), a glikoprotein integrál membrán 1 (GINM1) és az izom-cofilin 2 (CFL2). Ennek a hat génnek a mikroszkópos adatai megerősítésére egyedi qRT-PCR elemzést végeztek, és az összes célpont csökkent expresszióját validálták, az RNH1 kivételével (4. táblázat).

miR-20b-5p –indukált gátlást csökkentett gének az emberi vázizomsejtekben