A keringő sejtmentes DNS epigénje, mint a betegség biomarkere

A sejtek testünk folyamatosan képződik és eliminálódik egy folyamatos ciklusban, amely döntő fontosságú a szövetek megfelelő szerkezetének és működésének fenntartásához. A sejtek pusztulása a normál szövetkarbantartás során intracelluláris DNS-anyag felszabadulását eredményezi a véráramban, ahol szabadon kering. Valójában az egészséges egyének legfeljebb 100 nanogramm nem kapszulázott DNS-fragmenseket lebeghetnek a vérük minden milliliterében. 1 A keringő sejtmentes DNS vagy röviden cfDNS nagyon hasznosnak bizonyult különféle klinikai alkalmazásokban, ideértve az anyai vérben lévő magzati cfDNS terhességének felmérését, a befogadó vérében lévő donor cfDNS-ből származó szervátültetések nyomon követését és a rák diagnosztizálását. tumor cfDNS az úgynevezett „folyékony biopsziákban”.

epigénje

Az olyan betegségeket, mint a diabetes mellitus és a sclerosis multiplex, bizonyos sejttípusok (β-sejtek, oligodendrocyták) krónikus pusztulása jellemzi, ami az életfenntartó biológiai folyamatokhoz (glükóz homeosztázis) szükséges kritikus funkciók (inzulin szekréció, MOG glikoprotein termelés) elvesztéséhez vezet., Központi idegrendszeri mielináció). Az ilyen célzott sejtpusztulást sokszor nem észlelik a betegség előrehaladásának korai szakaszában, amikor a terápiás beavatkozás lenne a legelőnyösebb, mielőtt a szöveti funkció jelentős és visszafordíthatatlan veszteséget okozna. Amint ezek a sejtek elpusztulnak, genetikai tartalmaik a keringésbe kerülnek, és összekeverednek a fiziológiai sejtforgalomban már jelen lévő cfDNS-sel.

Bár testünk összes sejtje lényegében ugyanazokat a géneket tartalmazza, ezeknek a géneknek a kifejezése szövetspecifikus és szorosan szabályozott olyan epigenetikus tényezőkkel, mint a DNS-metiláció és a hiszton-módosítások. A cfDNS epigenóm tehát felhasználható annak a pontos forrásnak a meghatározására, amelyből a cfDNS származik. Például a CpG-motívumok hipometilezése az inzulin-promóterben megkülönbözteti a β-sejtekből származó cfDNS-t a nem-β-sejtek véráramon keresztül áramló DNS-étől. 2 Az aktív relapszáló-remitáló sclerosis multiplexben szenvedő betegek szérumában lévő oligodendrocita cfDNS felismerhető demetilezett MOG kódoló régiója alapján. 3 A patológiás állapotok feltárásának és kezelésének képessége a betegség kialakulása előtt minden bizonnyal javítja a betegek kimenetelét, és a differenciálisan metilezett cfDNS kényelmes biomarkerként szolgálhat a betegséggel összefüggő sejthalál in vivo korai felismerésében.

A differenciálisan metilezett cfDNS feldolgozása és elemzése egy többlépcsős eljárás, amely általában magában foglalja a DNS-visszakeresést, kémiailag módosítja az érdeklődésre számot tartó genetikai régiót, hogy megkülönböztesse a metilezett és metilálatlan helyeket, és mind a módosított, mind a módosítatlan célszekvenciát mérhető szintekre erősítse. Az első lépés a cfDNS hatékony izolálása és tisztítása. A cfDNS izolálásának jelenlegi módszerei a szilikon oszlopkötéssel, fenol-kloroform szétválasztással vagy szilícium-dioxid-gyöngyökkel történő DNS-befogáson alapulnak, és időigényesek és alacsony áteresztőképességűek. Az innovatív mágneses gyöngy alapú méretű frakcionálási technológia egyszerűbb és gyorsabb módszert kínál a tiszta cfDNS nagy visszanyerésére. Különösen a metilezett DNS-fragmensek választhatók ki és dúsíthatók metilezett DNS-immunrecipitációs alapú rendszereken keresztül, kiváló minőségű és nem keresztreaktív antitesteket alkalmazva.

A következő lépés az izolált cfDNS előállítása génspecifikus metilációs elemzéshez. Ez általában biszulfit-konverziót, kémiai reakciót eredményez, amelyben a metilálatlan citozinokat dezaminálják uracillá, miközben az 5-mC érintetlen marad (a DNS-metilezés kovalensen metilcsoportokat ad a citozin-gyűrűk 5-szénatomján 5-metil-citozint vagy 5-mC-t alkotva) . Ennek eredményeként a metilezett és nem metilezett cfDNS citozin maradványok megkülönböztethetők. A hagyományos konverziós módszer hosszú protokollidőt (12-16 óra) igényel, ami súlyos DNS-lebomlást (> 80%), magas nem megfelelő 5-mC dezaminálást (> 3,5%) és alacsony citozin-konverziós arányt okoz (a biszulfit-konverzió a citozin uracil, az 5-metil-citozint (5-mC) érintetlenül hagyva. Hitel: EpiGentek

A teljes biszulfit-folyamat mindössze 0,5-1,5 órára történő kondenzálására irányuló erőfeszítések jelentősen javították a citozin konverzió hatékonyságát (> 99,9%), és hatékonyan megakadályozták a biszulfittal kezelt DNS lebomlását. A hidroxi-metilezett 5-mC vagy 5-hmC a kutatási érdeklődésre számot tartó cfDNS másik epigenetikai jegye 4, és a legújabb technológia lehetővé teszi mindkét metilezett citozin forma egyidejű azonosítását. A metilezetlen C-csoportokra irányított biszulfit és az ezt követő APOBEC-deamináz-kezelés kapcsolásával, amely szelektíven 5-mC-t timinné változtat, ennek megfelelően megkülönböztetjük az 5-hmC-t. Az átalakított cfDNS most készen áll az alaposabb vizsgálatokra, általában PCR-rel és a következő generációs szekvenálási módszerekkel, a célterületen belüli pontos metilációs helyek feloldására az egybázisos felbontási szinten.

Az orvosi eljárások meglehetősen drágák és rendkívül tolakodóak lehetnek, a páciens kellemetlenségeinek és kellemetlenségeinek ellenére. A cerebrospinalis folyadék kinyerésére szolgáló invazív ágyéki lyukasztások és a költséges MRI-k fizikailag és pénzügyileg megterhelőek például a sclerosis multiplexben szenvedők számára. A differenciálisan metilezett cfDNS noninvazív és olcsó alternatívát kínál a hagyományos diagnosztikához. Csak egy kis vérmintából nyomokban lévő DNS-ek nagyfokú érzékenységgel és specifitással képesek elkülöníteni és azonosítani egyedi epigenomjukat. A metilációra épülő technikák felhasználhatók a cfDNS eredetének pontos meghatározására és vérszintjük felmérésére a keringő nukleinsavfragmensek tengere között, segítve a releváns patológia pontos és pontos diagnosztizálását és nyomon követését. Epigenetikai analitikai megközelítéssel kombinálva a differenciálisan metilezett cfDNS új lehetőségeket kínál a sejthalál klinikailag jóváhagyott molekuláris biomarkereivel szemben.