A ketogén étrend javítja a hipobár hypoxia által okozott területi memória károsodását patkányokban a hisztonok fokozott acetilezésével

Pekingi Kognitív Tudományi Tanszék, Peking, Általános Orvostudományi Intézet, Peking, Kína

Pekingi Kognitív Tudományok Tanszéke, Peking, Általános Orvostudományi Intézet, Peking, Kína

Pekingi Kognitív Tudományi Tanszék, Peking, Általános Orvostudományi Intézet, Peking, Kína

Pekingi Kognitív Tudományok Tanszék, Pekingi Általános Orvostudományi Intézet, Peking, Kína, Neuroregenerációs Társ-Innovációs Központ, Nantong Egyetem, Nantong, JS, Kína, Pekingi Agybetegség Intézet, 10 Xitoutiao, You Anmen, Fengtai körzet, Peking, PR Kína

Pekingi Kognitív Tudományok Tanszék, Pekingi Általános Orvostudományi Intézet, Peking, P.R. Kína, Neuroregeneráció társinnovációs központja, Nantong Egyetem, Nantong, JS, Kína

Ming Zhao,
Xin Huang,
Xiang Cheng,
Xiao Lin,
Tong Zhao,
Liying Wu,
Xiaodan Yu,
Kuiwu Wu,
Ming Fan,
Lingling Zhu

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Zhao M, Huang X, Cheng X, Lin X, Zhao T, Wu L és mtsai. (2017) A ketogén diéta javítja a hipobár hypoxia hatásának okozta térbeli memóriazavarokat patkányokban a hisztonok fokozott acetilezésével. PLoS ONE 12 (3): e0174477. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0174477

Szerkesztő: Michelle M. Adams, Bilkent Egyetem, Törökország

Fogadott: 2016. december 12 .; Elfogadott: 2017. március 9 .; Közzétett: 2017. március 29

Adatok elérhetősége: Minden lényeges adat a cikkben található.

Finanszírozás: Ezt a munkát a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány támogatta, Grant # 81430044, 31271205, 31271211 (http://www.nsfc.gov.cn/); a pekingi önkormányzati tudományos és technológiai bizottság, Grant # Z161100000216134 (http://www.bjkw.gov.cn/n8785584/index.html) és Kína Nemzeti Alapkutatási Programja, Grant # 2012CB518200 (http: //program.most .gov.cn /). A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A hypoxia a Hypoxia-indukálható faktor-1 (HIF-1) útvonal aktiválása mellett a génexpresszióban szerepet játszó különböző epigenetikai mechanizmusokat is kiváltja [12]. Egy friss jelentés megállapította, hogy a hipobár hypoxiának differenciált hatása van a patkány agy neokortexében és hippocampusában lévő fehérjék acetilezésére, és hogy az acetilezés túlsúlyos célpontjai hisztonok [13]. A hiszton-acetiláció csökkenésének visszafordítása hatékony módszer lehet a hipobáros hipoxia okozta sérülések enyhítésére. Javasoltuk, hogy a KD javíthatja a hipobáros hipoxia által okozott kognitív diszfunkciókat a hiszton-acetilezés módosításával. Jelen tanulmányban azt tapasztaltuk, hogy a KD beadása nem csak fokozza a felnőttek patkányainak térbeli tanulását, hanem megfordítja a hipobáros hipoxia okozta térbeli memóriazavarokat is. Ezenkívül a hipoxia által kiváltott hiszton-acetiláció csökkenését KD-kezelés megfordította. Ezek a megállapítások azt jelzik, hogy a KD képes megvédeni a memória romlását a hipobár hypoxia hatásának kitéve.

Anyagok és metódusok

Etikai nyilatkozat

Az összes kísérleti eljárást a Pekingi Általános Orvostudományi Intézet Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá, és az irányelveknek megfelelően hajtották végre. A kezelés során viselkedési teszteket és szövetgyűjtési eljárásokat dolgoztak ki az ebben a vizsgálatban használt állatok lehetséges fájdalmának és szorongásának minimalizálása érdekében. Valamennyi patkányt gyakran, heti legalább háromszor monitorozták egészségi állapotuk szempontjából.

Állatok és kezelés

Nyolc hetes Sprague Dawley hím patkányokat, amelyeket a Vital River Laboratory Animal Technology Co.-tól (Peking, Kína) vásároltak, hőmérséklet és páratartalom szabályozott helyiségben helyezték el. A patkányokat 12 órás világos-sötét ciklus alatt tartottuk, és ad libitum táplálékot és vizet kaptunk. A kísérletek előtt a patkányokat három napig hagyták akklimatizálódni. A patkányokat egy éjszakán át éheztettük, majd két csoportba soroltuk őket, vagy standard tenyésztési/fenntartó étrenddel (STD) vagy KD-vel etetve (a Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. cégtől vásárolták és gyártották). A KD összetételét egy korábbi jelentésben használtuk fel [14], és ezt az 1. táblázat mutatja. A testtömegeket a kísérlet végéig háromnaponta mértük. A hipobár hypoxia kezelésére a patkányokat hipobár hypoxia kamrában (Guizhou Fenglei Aeronautics Ordnance Co. Ltd., Kína, modell: DYC-DWI) 24 órán át állandó szimulált 6000 m magasságban tartottuk. A kamrában a páratartalmat 40-50% -on, a hőmérsékletet 22-24 ° C-on tartották. A patkányok szabadon hozzáférhettek az élelemhez és a vízhez, és 12 órás világos-sötét ciklusban tartották fenn őket. A patkányokat pentobarbitál-nátrium (2%, 1 ml/patkány) intraperitoneális injekciójával altattuk és lefejezéssel leöltük.

Biokémiai elemzés és szövet előkészítés

A vér biokémiai elemzéséhez a mintákat a farokvénából gyűjtöttük és EDTA-tartalmú csövekbe helyeztük. 15 percig szobahőmérsékleten 1500xg-vel végzett centrifugálás után a plazmát új csőbe helyeztük, és felhasználásig -80 ° C-on tároltuk. Az összkoleszterin és a triglicerid plazmaszintjét ELISA kit (E1005 és E1003) alkalmazásával mértük az Applygen Technologies Inc. (Peking, Kína) cégtől. A BHB és az acetoacetát (AcAc) plazmaszintjét egy ELISA Kit (ab83390 és ab180875) segítségével mértük, amelyet Abcam-tól (Cambridge, MA) vásároltunk. A vizsgálatokat a gyártó által megadott protokollok szerint végeztük. Viselkedési tesztek után a patkányokat elaltattuk és lefejezéssel felöltük. Az agyakat gyorsan eltávolítottuk, a hippocampust feldaraboltuk és -80 ° C-on lefagyasztottuk a jövőbeni Western blot elemzés céljából. Az immunhisztokémiai elemzéshez használt agyakat közvetlenül izolálás után 4% -os formaldehidben rögzítettük.

Nyílt terepi teszt

A patkányokat négyzet alakú nyílt terű kamrába (100 × 100 × 40 cm, hosszúság × szélesség × magasság) helyezték el, sima fekete padlóval és fekete falakkal. A padlót 25 négyzetre osztották 20 × 20 cm-re. A patkányokat a kamra közepébe helyezték, és öt percig szabadon felfedezhették őket. Viselkedésüket a kamra felett elhelyezett digitális kamera rögzítette. Az ANY-labirintus videoképző szoftver (Stoelting Co., IL) segítségével meghatározták a középterületen töltött időt, valamint a középterületre történő belépések számát (25 négyzet belső 9-e). A mozdony viselkedését a teszt során megtett távolságként számoltuk. A területet minden teszt között 70% -os etanollal törölgettük.

Morris vízlabirintus teszt

A vízlabirintus készülék egy kör alakú medence volt (átmérő = 160 cm, magasság = 50 cm), amely vízzel volt töltve (hőmérséklet kb. 22–24 ° C). Egy láthatatlan hungarocell platformot helyeztek el 1 cm-rel a víz felszíne alatt. Négy vizuális jelzést helyeztek el a labirintust körülvevő függönyön (a medence szélén). A medencét négy negyedre osztották. A viselkedést az ANY-labirintus képalkotó szoftverrel (Stoelting Co., IL) telepített számítógéphez csatlakoztatott digitális kamera követte és rögzítette. Az összegyűjtési edzés öt napja alatt a patkányokat a kvadránsok középpontja felé néző vízbe helyezték. A patkányok szabadon úszhattak, amíg meg nem találták és fel nem másztak az emelvényre. Ha egy patkánynak 90 másodpercen belül nem sikerült megtalálni az emelvényt, 10 másodpercig a platformra helyezték. Minden patkányt naponta 4 kísérletnek vetettek alá, és a kiindulási helyzetet minden nap megváltoztatták. A térbeli szondateszthez az emelvényt eltávolították, és a patkányt egy kvadránsban a vízbe helyezték. A patkány hányszor haladta meg az emelvény előző helyét, a célnegyedben eltöltött időt, valamint azt a késleltetési időt, amelyet a peron 90 másodpercen belüli első átjutása jelentett.

Western blot elemzés

Immunhisztokémiai (IHC) festés

Az immunhisztokémiai elemzéshez a fix agyakat standard szövettani protokoll szerint paraffinba ágyazottuk és metszettük. Az agy koronaszelvényeit (5 μm) egy éjszakán át inkubáltuk az acetil-hiszton H3 (hígítás 1: 100) és a hiszton H4 (hígítás 1:50) ellen antitestekkel. Biotinilezett kecske anti-egér antitesttel végzett inkubálás után a jeleket az ABC kit (Vector Lab, Burlingame, CA) segítségével tettük láthatóvá.

Kvantitatív valós idejű PCR (qRT-PCR)

A teljes RNS-t az egér agyának hippocampusából extraháltuk Trizol reagenssel (Invitrogen, USA). Minden minta első állványú cDNS-ét szintetizáltuk MLV reverz transzkripciós készlet (TAKARA, Japán) felhasználásával a gyártó utasításainak megfelelően. A kvantitatív, valós idejű PCR-hez cDNS-t használtunk SYBR green master mix (Applied Biosystems, USA) alkalmazásával. Az alkalmazott primerek a következők: BDNF-F: 5ˊ-TGGCTGACACTTTTGAGCAC-3ˊ, BDNF-R: 5ˊ-GAAGTGTACAAGTCCGCGTC-3ˊ; β-aktin-F: 5ˊ-TTGCCCTAGACTTCGAGCAA-3ˊ, β-aktin-R: 5ˊ-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGA-3ˊ. A génexpressziót a β-aktin mRNS-szintjére normalizáltuk.

Chromatin immunprecipitáció (ChIP)

Az érdekes szekvenciákat qRT-PCR módszerrel amplifikáltuk a BDNF I promoter (pl) specifikus primerek alkalmazásával (pI-F: 5ˊ-GCAGTTGGACAGTCATTGGTAACC-3ˊ; pI-R: 5ˊ- ACGCAAACGCCCTCATTCTG-3ˊ) [15]. A PCR reakciókat három példányban hajtottuk végre. Küszöb-amplifikációs ciklusszámokat (Ct) használtunk az IP DNS-mennyiségek kiszámításához a bemeneti kontrollok százalékában.

Statisztikai analízis

A statisztikai elemzést a GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., San Diego, Kalifornia) segítségével végeztük, és az adatokat átlag ± SEM-ben fejeztük ki. Egyenlő varianciákkal rendelkező adatok esetében egyirányú varianciaanalízist (ANOVA), majd Dunnett-tesztet hajtottak végre.

Eredmények

A KD növeli a lipidek és keton testek plazmaszintjét

A kísérleteket az 1A. Ábra szerint terveztük. Három napos akklimatizálás után a patkányokat két hétig STD-vel vagy KD-vel etették, majd biokémiai elemzésnek és viselkedési teszteknek vetették alá őket. Először a két étrend testtömegre gyakorolt hatását háromnaponta rögzítettük, és azt tapasztaltuk, hogy a KD-vel táplált patkányok súlygyarapodása lassabb volt, mint az STD csoportba tartozó patkányokban (1B. Ábra). Ezután kimutattuk a KD beadásának a lipid anyagcserére gyakorolt hatását. Amint az az 1C. És 1D. Ábrán látható, az összes koleszterinszint a KD patkányokban kissé magasabb volt, mint az STD patkányokban, de a két csoport között nem volt szignifikáns különbség. Ezzel szemben a KD patkányok triglicerid szintje sokkal magasabb volt, mint az STD patkányokban (p 1. ábra. A KD kezelés hatása a lipidek és ketonok plazmaszintjére.

A. A kísérleti terv vázlata. A patkányokat 3 napig akklimatizáltuk, majd véletlenszerűen két csoportra osztottuk (mindegyik n = 20), amelyeket vagy a szokásos étrenddel (STD) vagy a ketogén étrenddel (KD) tápláltunk. 14 napos kezelés után a patkányoknak nyílt terepen végzett tesztet és biokémiai elemzést végeztek. Ezután a patkányokat Morris víz labirintus tesztnek vetettük alá 6 napig, és hipobár hypoxiás kezelést (minden kezelt csoportban 10 patkány) az akvizíció 5. napja és a próba teszt között a 6. napon. B. A patkányok testsúlyát az egész kísérleti periódus alatt feljegyeztük. Az adatok átlag ± S.E. C-F. Az összkoleszterin (C), a trigliceridek (D), a BHB (E) és az AcAc (F) plazmaszintjét ELISA-vizsgálattal detektáltuk. Minden csoportban öt patkány. Az értékeket átlagként ± S.E. (** p 2. ábra. A KD-kezelés fokozza a térbeli tanulást és a memóriát felnőtt patkányokban.

A. Kiértékelték a teljes megtett távolságot és a nyílt terepi teszten a központi területre történő belépések számát. Az értékeket átlagként ± S.E. (n = 10). B A négy kísérlet során a rejtett platform megtalálásához szükséges menekülési várakozások átlagát mutatjuk be az elsajátítási képzési időszak öt napja alatt. Minden csoportban tíz patkány.

A KD javítja a hipobáriás hipoxia okozta memóriazavarokat

Annak megvizsgálására, hogy a KD-kezelés javíthatja-e a hipobár hypoxia okozta memóriazavarokat, a patkányokat egy hipoxiakamrába (szimulált 6000 m magas magasságba) helyeztük át a térbeli szondateszt előtt. 24 órás expozíció után a patkányokat próbatesztnek vetjük alá. Az eredmények azt mutatták, hogy a hipoxiának való kitettség nyilvánvaló memóriazavart eredményezett, amelyet kevesebb keresztezés, valamint kevesebb idő és távolság töltött a célnegyedben, mint a kontrollcsoporté. Mindazonáltal ezeket a paramétereket megfordították KD kezeléssel (3A. Ábra). A hipobár hypoxia csoportba tartozó patkányokkal összehasonlítva a KD-hypoxia csoportban lévő patkányok fokozottan előnyben részesítették a célkvadránt a többi kvadránssal szemben (3B. Ábra). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a KD nyilvánvalóan jótékony hatást fejt ki a hipobáriás hipoxia okozta memóriazavarra.

A. Kiértékelték a peron kereszteződések átlagos számát, a célnégyzetben eltöltött átlagos időt és a szondateszt során az eredeti peron helyének első áthaladásának késését. Az értékeket átlagként ± S.E. (n = 10). B. Reprezentatív mozgáskövetési ábrák, amelyek a próba teszt során a teljes úthosszt mutatják. A piros kör a peron helyét jelzi.

Az exogén BHB megakadályozza a hipobár hypoxia által kiváltott térbeli memória károsodását

Annak ellenőrzésére, hogy a keton testnek, a KD termékének közvetlen javító hatása van-e, a következő kísérlethez a legstabilabb fiziológiás ketontestet, a BHB-t választottuk. A KD fentiekben leírt hatásának utánzása érdekében a patkányokat 2 hétig előkezeltük BHB-vel (200 mg/kg/nap dózisban), majd Morris-vízlabirintusnak vetették alá őket. Mivel az intraperitoneális injekció lehetővé teszi az anyagok lassabb felszívódását, az intraperitonealis injekció pedig marginális hatást vált ki a viselkedési tesztek során [16], ezért a BHB intraperitonealis injekcióját használtuk, amelyet publikált jelentésekben alkalmaztak [17, 18]. Bár a kontroll és a BHB csoport patkányai 5 napos megszerzési tréning során megtanulták azonos platformmal megtalálni a platformot (4B. Ábra), a BHB jelentősen javíthatja a hypobarikus hypoxia okozta memóriazavarokat, amelyeket nagyobb keresztezési szám, több idő jelent a megcélzott kvadráns, és csökkent a látencia a platformra való első belépésig, csak a hipobáros hipoxiás kezeléshez (4C – 4F. ábra). Ezek az eredmények bebizonyították, hogy a BHB-nek közvetlen memóriajavító hatása van, és a KD jótékony hatásainak fő végrehajtójaként szolgált.

A. A BHB plazmaszintjét ELISA assay-vel detektáltuk. Minden csoportban öt patkány. Az értékeket átlagként ± S.E. (** p 5. ábra. A KD kezelés fokozza a hiszton acetilációját a hippocampusban.

Az acetil-hiszton H3 (K9/K14), az acetil-hiszton H3 (K14) és az acetil-hiszton H4 (K12) fehérje szintjét a hippokampuszban Western-blot segítségével detektáltuk. A β-aktin szintje belső kontrollként szolgál. Minden csoportban három patkány. A jobb oszlopdiagram mutatja az egyes fehérjék relatív sávsűrűségét az egyes csoportokban, és az adatokat átlagként ± S.E. (** p 6. ábra. A KD kezelés növeli a hiszton acetilációját a hippocampus CA1 régiójában.

Az acetil-hiszton H3 (K9/K14) és az acetil-hiszton H4 (K12) immunhisztokémiai elemzésének reprezentatív képei a hippocampus CA1 régiójában. A betétek a pontozott mezőben elhelyezkedő reprezentatív területek nagyobb nagyítását mutatják.