A kitozán oligoszacharid öregedésgátló hatása a d-galaktóz által kiváltott szubakut öregedésre egerekben

Absztrakt

1. Bemutatkozás

A COS kémiai szerkezete.

A COS biológiai aktivitására vonatkozó korábbi tanulmányok alapján ésszerű feltételezni, hogy ez az oligoszacharid jelentős potenciállal rendelkezik az öregedésgátlás területén. Ennek a kis molekulatömegű természetes poliszacharidnak a d-galaktóz (d-gal) által kiváltott szubakut öregedés elleni in vivo védőhatásairól azonban korlátozott ismeretek állnak rendelkezésre. Ezért a jelen tanulmány célja a C-sejtek öregedésgátló aktivitásának vizsgálata volt intragasztrikus szondával d-gal által kiváltott szubakut öregedő egerekben, főleg az oxidatív stressz paraméterek mérésével, valamint az egerek és/vagy azok makroszkopikus és hisztopatológiai állapotainak értékelésével. fő szervek, amelyek úttörő farmakológiai alapot nyújtanak a COS öregedésgátló hatásához.

2. Eredmények

2.1. Napi viselkedésmegfigyelés

Az egerek testtömege a kezelési időszak alatt.

2.2. A COS hatása az immunfunkcióra

Mivel a lép és a csecsemőmirigy kiemelkedő immunszervek, ezek indexei tükrözhetik az immunállapot erősségét vagy az immunfunkció javulását [10]. Amint az 1. táblázat mutatja, a d-gal nyolc hetes kezelése után a modellcsoport egereinek lép- és csecsemőmirigy-indexei észrevehetően alacsonyabbak voltak, mint a normál csoportban, ami azt jelzi, hogy az egér immunrendszerét gátolta d -gal 56 egymást követő napon. Ezenkívül a d-gal kezelés hatására az egerek csökkent lép- és csecsemőmirigy-indexei fokozatosan bizonyos fokig felfelé szabályozódtak a COS beadása után. Továbbá eredményeink (amint az 1. táblázatból kiderül) azt is feltárta, hogy az immunglobulin G (IgG) és az IgM szérumszintje láthatóan csökkent a modellcsoport egereiben, a normál csoportéhoz képest. Mindazonáltal, miután COS-szal kezelték, az IgG és az IgM szintje egyértelműen emelkedett dózisfüggő módon.

Asztal 1

A COS hatása a szervindexekre és az immunfunkcióra d-gal-tal kezelt egerekben.

CsoportokSzervi index (mg/g) immunfunkcióThymusSpleenIgG (g/L) IgM (g/L)

Normál	0,22 ± 0,05	0,58 ± 0,28	0,80 ± 0,03	0,16 ± 0,03
Modell	0,14 ± 0,05 #	0,34 ± 0,09 #	0,57 ± 0,04 #	0,07 ± 0,02 #
VE	0,19 ± 0,04	0,43 ± 0,16	0,61 ± 0,05	0,10 ± 0,03
COS-L	0,14 ± 0,04	0,42 ± 0,07	0,70 ± 0,04 *	0,08 ± 0,02
COS-M	0,16 ± 0,06	0,49 ± 0,23 *	0,72 ± 0,07 *	0,11 ± 0,02 *
KÉNYELMES	0,19 ± 0,05	0,53 ± 0,14 *	0,77 ± 0,08 *	0,12 ± 0,02 *

Az adatok átlag ± ± szórást (SD) jelentenek (n = 8). # A p d-gal kezelt egereket az alanin-aminotranszferáz (ALT), az aszpartát-transzamináz (AST) és az alkalikus foszfatáz (ALP) szérumszintjének mérésével értékeltük. A 2. táblázatban látható, hogy nyolc hétig d-gal kezelés után a modellcsoport egerei szignifikánsan megnövelték az ALT, az AST és az ALP szérumszintjét a normál egerekhez képest (az összes pd-gal által kiváltott szokatlanul magas szint Az ALT, az AST és az ALP szintje az egerek szérumában fokozatosan csökkent bizonyos mértékben a VE és COS kezelt csoportokban, összehasonlítva a modellcsoportos egerekkel, különösen a COS-H csoportban, és ezek a szintek markánsan alacsonyabbak voltak, mint a modellben csoport (minden pd-gal kezelt egér.

GroupsMájfunkcióVesefunkcióALP (U/L) ALP (U/L) AST (U/L) CREA (μmol/L) UA (μmol/L)

Normál	50,08 ± 5,46	20,88 ± 3,17	53,79 ± 4,40	51,46 ± 3,08	125,24 ± 9,52
Modell	82,26 ± 3,09 #	28,20 ± 4,39 #	78,51 ± 3,77 #	61,49 ± 5,53 #	162,55 ± 8,93 #
VE	69,26 ± 6,05 *	22,05 ± 4,02 *	68,61 ± 5,24 *	58,36 ± 6,28	142,83 ± 7,76 *
COS-L	68,28 ± 4,57 *	25,59 ± 3,63	65,15 ± 4,21 *	55,51 ± 3,36	160,33 ± 5,55
COS-M	64,07 ± 3,29 *	20,45 ± 2,05 *	60,08 ± 2,26 *	53,14 ± 3,70 *	139,13 ± 11,03 *
KÉNYELMES	58,85 ± 4,83 *	19,10 ± 1,52 *	57,01 ± 3,67 *	51,99 ± 1,09 *	130,39 ± 8,65 *

Az adatok átlag ± SD (n = 8). # A pd-gal injekciózott egereket a kreatinin (CREA) és a húgysav (UA) szintjének mérésével értékelték a szérumban, és az eredményeket a 2. táblázat is bemutatja, amelyből kiderül, hogy a modell CREA és UA szintje csoportos egerek szignifikánsan magasabbak, mint a normál csoportos egerek (a máj és a vese összes pd-Gal által kiváltott hisztokémiai károsodása)

Amint a 3. ábrán látható, a májszövet normál szövettani szerkezete jól látható a normál csoportos egerekben, ideértve a mindenütt jelenlévő sokszögű hepatocitákat, a központi véna körül radiálisán elterjedt májzsinórt és a hepatociták enyhe binukleációját. Nyolc hetes folyamatos d-gal-injekció után a májszövet megnövekedett számú hepatociták binukleációját, kagylós elrendezésű májzsinórt, széles körben elterjedt hepatocelluláris ballonozást és számos gyulladásos sejtinfiltrációt mutatott ki. Mindazonáltal a COS-H-val kezelt csoportban szépen elrendezett májzsinór, kevesebb gyulladásos beszivárgás és a hepatocyták binukleációja volt megfigyelhető az egerek májszövetében, míg a ballonos hepatociták dózisfüggő módon csökkentek, jelezve, hogy a COS javíthatja a d - gal által kiváltott májkárosodás bizonyos mértékig.

A máj hisztopatológiai megjelenése (haematoxilin-eozin (HE) festés 400 ×). A májsejtek (fekete nyíl), a májzsinór kémiai elrendezése (sárga nyíl) és a ballonáló májsejtek (piros nyíl) binukleációja.

Ezenkívül a d-gal-val kezelt egerek veseszövetének hisztopatológiai elemzéseiből kiderült, hogy a glomerulus nyilvánvaló sorvadást mutatott, vagy akár eltűnt, míg a ballonnal kiszélesedett üreg és a hámsejtek cseppje a vese proximális tekercselt tubulusaiban, valamint kiterjedt vesedema, előfordulhat a normál csoporthoz képest (amint azt a 4. ábra mutatja). Nevezetesen, a COS és a VE kezelés szignifikánsan csillapította a vesesejt ezen egészségtelen kóros elváltozásait, melyeket a d-gal okozott, ami a vesét védő aktivitást mutatott, míg a veseödéma és a ballonnal kiszélesedett üreg nagyrészt a COS-H csoport kontrollált volt. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a COS sikeresen enyhítette ezeket a d-gal által kiváltott kóros károsodásokat Kunming egerek (KM egerek) máj- és veseszövetében.

A vese hisztopatológiai megjelenése (HE festés 400 ×). Atrófia (sárga nyíl), a hámsejtek cseppje a vese proximális tekercselt tubulusaiban (fekete nyíl) és a ballonnal kiszélesedett üreg (piros nyíl).

2.5. A COS hatása a máj és a vese antioxidációs indexeire

Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az antioxidáns enzimek a ROS eltávolításával megvédhetik a májat és a vesét a d-gal által kiváltott szubakut öregedéstől. Ennélfogva SOD, CAT és GSH-Px aktivitását, valamint a malondialdehid (MDA) tartalmát vizsgáltuk jelen tanulmányunkban [5,6,7]. Amint azt az 5. ábra szemlélteti, a d-gal nyolc héten át történő szubkután injektálása után ennek a három kulcsfontosságú antioxidáns enzimnek az aktivitása élesen csökkent, összehasonlítva a normál csoportos egerek máj- és veseszövetében kifejtett aktivitásával, míg az MDA-val ellentétes volt a helyzet szintje (az összes pd-gal fokozatosan magasabbra emelkedett, mint a modellcsoportos egereké, és az MDA-szintet a COS csökkentette dózisfüggő módon (különösen a COS-H csoportban, pd-gal kezelt egerekben).

A COS hatása a SOD, a GSH-Px és a CAT aktivitására, valamint az egerek májának MDA szintjére (A) és a vese (B) okozta d -gal. Az adatok átlag ± SD (n = 8). # pd-gal-kezelt csoport; VE: d-gal plusz VE kezelési csoport; COS-L: d-gal plusz COS (300 mg/kg/nap) kezelõcsoport; COS-M: d-gal plusz COS (600 mg/kg) kezelõcsoport; COS-H: d-gal plusz COS (1200 mg/kg) kezelési csoport.

3. Megbeszélés

Összefoglalva: a VE, amelynek monomerjét gyakran használják pozitív kontrollként a d-gal által kiváltott szubakut öregedés vizsgálatához egerekben, jól ismert zsíroldékony vitamin, kiváló antioxidáns aktivitással [37,39,40 ]. Tekintettel arra, hogy a VE nem mutatott kiemelkedő promóciós hatást az egerek immunfunkciós mutatóinak d-gal által termelt csökkentésére, ésszerű volt arra következtetni, hogy a VE bizonyos védő hatása a d-gal által kiváltott öregedő egerek májára és veséjére főleg antioxidációs minősége miatt. Viszonylag a garnélák és a rákhéjak óceánján levő COS sokféle biológiai hatással bír, például az egerek immunfunkciós mutatóinak d-gal által indukált csökkenésére és a d-gal által okozott fokozott hatásra. a legfontosabb antioxidáns enzimek aktivitásának csökkenése az egerek májában és veséjében [12,15,16,17]. Eredményeink átfogó megkötése érdekében úgy tekinthető, hogy a COS hepatoprotektív és renoprotektív hatással volt a d-gal által kiváltott szubakut öregedő egerekre, hogy megvalósítsa öregedésgátló aktivitását, amely összefüggésben lehet a COS antioxidáns képességével, valamint jó szabályozó szerepe az egerek immunfunkciójában nagyobb mértékben.

4. Anyagok és módszerek

4.1. Anyagok és vegyszerek

A COS-t (garnélarák-chitozantól enzimatikus hidrolízissel, átlagos molekulatömeg ≤1000 Da, dezacetilezési fok ≥90%, 3–7 polimerizáció mértékét, vízoldható), majdnem fehér port vásároltak a Beijing Zhong Tai He Technology-tól (ZTH) Tech, Peking, Kína). Bizonyos mennyiségű COS-t pontosan lemértünk, és szobahőmérsékleten ultratiszta vízben oldottunk, így három különböző koncentrációt kaptunk: 15, 30 és 60 mg/ml. A d-gal-t (tisztaság ≥99%) és az E-vitamint (VE, tisztaság 95%) a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, USA) szereztük be. A d-gal-ot 0,9% fiziológiás sóoldatban oldottuk fel, hogy szubkután injektáljuk az egerek nyakát 250 mg/testtömeg-kg dózisban, míg a VE-t 1% Tween 80-oldatot tartalmazó desztillált vízben oldottuk fel. A kereskedelemben kapható készleteket az IgM, IgG, GSH-Px, SOD, CAT és fehérje koncentrációhoz, valamint az MDA-hoz a Nanjin Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kína) biztosította. A vizsgálatban használt összes egyéb vegyszer és reagens analitikai minőségű volt.

4.2. Állatok

Körülbelül 30 g tömegű, egészséges, hét hetes hím KM egereket a Guangdong tartományi Laboratóriumi Állattudományi Központtól vásároltak (tanúsító szám: SCXK (Yue) -2013-0002). Az egereket a Guangdong-i Óceán Egyetem állat-laboratóriumában helyezték el, a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutatások szerint. Az egereket ketrecekben 23 ± 2 ° C környezeti hőmérsékleten, 55 ± 10% relatív páratartalommal tartottuk 12 órás világos/sötét automatikus megvilágítási ciklusban, a nyolc hetes kísérleti időszak alatt. Hozzáférhettek a szokásos pellet-étrendhez, és ad libitum inni vizet az egész vizsgálati időszak alatt.

4.3. Szubakut öregedő egér modell és COS kezelés elkészítése

Egy hétig tartó adaptáció után az egereket véletlenszerűen felosztottuk hat, egyenként nyolc egérből álló csoportba a 3. táblázat szerint. A természetes öregedő modellegér megállapításához d-gal-t (250 mg/kg/nap) injektáltunk szubkután az egerek nyakának hátsó részébe naponta egyszer, 56 egymást követő napon. Míg a normál csoportba tartozó egerek napi egyszeri mennyiségben fiziológiás sóoldatot kaptak a d-gal helyett. A d-gal szubkután injektálása után egerekben egy órán át a normál és a modell csoportba tartozó egereket desztillált vízzel kezeltük szondával (20 ml/kg/nap); közben a VE csoportba tartozó egereket szondával (50 mg/kg/nap) VE-vel kezelték pozitív kontrollként a legújabb jelentések szerint [37,39,40]. A COS-L, COS-M és COS-H csoportba tartozó egereket napi mintamegoldásokkal (három különböző COS-dózis) kezeltük szondával, amelyeket naponta adtunk be a 3. táblázatban bemutatott kezelési ütemtervként. .