A kitozán-kiegészítés alacsony adagolása javítja a bél áteresztőképességét és rontja az akadályfunkciót egerekben

1 Biológiai és Biotechnológiai Főiskola, Hunan Mezőgazdasági Egyetem, Changsha, Hunan 410128, Kína

2 Hunan Állat- és Állatorvos-tudományi Intézet, Changsha, Changsha 410131, Kína

Absztrakt

Ennek a vizsgálatnak a célja az volt, hogy összefüggéseket tárja fel az alacsony dózisú kitozánnal (COS) kiegészített étrend-kiegészítők és a testtömeg, a takarmányfelvétel, a bélsorompó funkció és az egerek permeabilitása között. Húsz egeret véletlenszerűen kiosztottak, hogy hamisítatlan kontroll étrendet (kontrollcsoport) vagy étrend-kiegészítőt kapjanak 30 mg/kg dózis kitozánnal (COS csoport) két héten keresztül. Míg nem találtunk szignifikáns különbséget a testtömeg, illetve a táplálék- és a vízbevitel körülményei között, a COS csoportban az egereknél megnőtt a szérum D-laktát tartalma (

) és csökkent jejunal diamin-oxidáz (DAO) aktivitás (). Továbbá a COS csoportba tartozó egereknél csökkent az occludin és a ZO-1 () expressziója, és csökkent az occludin expressziója az ileumban (). Az ezekből a megállapításokból levont következtetés azt mutatta, hogy bár a 30 mg/kg COS-tal kiegészített étrendnek nincs hatása az egerek testtömegére vagy takarmányfelvételére, ez a dózis veszélyeztetheti a bélsorompó funkcióját és a permeabilitását. Ez a kutatás hozzájárul a COS-kiegészítőkkel kapcsolatos útmutatáshoz.

1. Bemutatkozás

A kitozán (COS) egy lúgos glükózamin-polimer, amely hidrolizált kitozánból származik [1]. A kitozánmolekulák, hasonlóan más növényi poliszacharidokhoz, számos biológiai aktivitással rendelkeznek, például antibakteriális tulajdonságokkal, immunhatással és betegségmegelőzéssel [2].

A peptidek és fehérjék általában nem szívódnak fel jól a bélrendszeren keresztül; kimutatták, hogy a kitozán jelentősen elősegíti a makromolekulák bélben történő felszívódását. Úgy gondolják, hogy a fokozott abszorpció mögött álló mechanizmusok a mukoadhesióhoz és a relaxáló sejtek közötti feszes csomópontokhoz kapcsolódnak [3]. A mukoadhézió két anyag közötti tapadást ír le, ahol az egyik egy nyálkahártya-felület. A nyálkahártya negatív töltésű sziálsavcsoportokat hordoz, kölcsönhatásba lépve a kitozán pozitív töltésű aminocsoportjaival [4].

A kitozán vonzó adalék az állati takarmányokhoz [5], a benne rejlő antimikrobiális tulajdonságok miatt [5], de a magas viszkozitás és oldhatóság miatt korlátozottan alkalmazzák [6]. A kitozán malacnövekedésre gyakorolt hatásának vizsgálata az immunképességre, a bél morfológiájára és a mikroflóra működésére gyakorolt hatást tulajdonította [7, 8]. Az eredmények változóak voltak, és a vizsgálatokban alkalmazott dózisok nagyok voltak (100 mg/kg – 5 g/kg). Korábbi tanulmányunk alacsony dózisú kitozant (30 mg/kg) használt az étrendi malacok kiegészítésére, ami vékonybél oxidatív és immunstressz-válaszokat és a bélsorompó hatékonyságának csökkenését eredményezte [9]. Ehhez a tanulmányhoz azt jósoltuk, hogy az alacsony dózisú kitozán-kiegészítés megzavarja a bél áteresztőképességét és működését azáltal, hogy meghatározza az egerekben a gátfunkció és a fehérjék expresszióját.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Kísérlettervezés

Ezt a vizsgálatot a Kínai Tudományos Akadémia laboratóriumi állatetikai bizottságának irányelveivel összhangban végezték. A hathetes ICR egereket az SLAC Laboratory Animal Central (Changsha, Hunan, Kína) cégtől vásárolták. Az egereket tiszta állatkolóniákban tartottuk (hőmérséklet, 25 ° C, relatív páratartalom, 53%; 12 óra sötét/12 óra világos); az egereknek megvolt ad lib vízhez való hozzáférés és egy tipikus rágcsáló-étrend [10]. Három nap elteltével az egereket véletlenszerűen osztották be a COS csoportba (

) vagy kontrollcsoport (). Két hétig a kontrollcsoport egerei alaptáplálékot kaptak [10], míg a kísérleti csoport étrendjét 30 mg/kg kitozánnal egészítették ki. Kitozánt a Dalian Kémiai és Fizikai Intézetből (Kínai Tudományos Akadémia, Dalian, Kína) nyertek; a molekulák 5 oligomerből álltak, átlagos molekulatömegük 1000-2000 Da, minimális cukortartalom 85% és 99% vízoldható. Két hét múlva az egereket feláldoztuk, és a jejunum helyreállt. A mintákat lefagyasztották, és –80 ° C-on tartották, amíg szükséges volt.

2.2. A béláteresztő képesség elemzése

A D-laktát szérumszintjét egy kínai-német pekingi Leadman Biotech Ltd. (Kína) kereskedelmi készlet és egy Beckman CX4 kémiai analizátor (Beckman Coulter, CA, USA) segítségével határoztuk meg. A szérum-diamin-oxidáz aktivitás kísérletét vizsgálati készletek segítségével hozták létre, amelyeket a gyártó utasításainak megfelelően használtak (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Jiangsu, Kína).

2.3. Tight Junction Genes RT-PCR

A teljes RNS-t az őrölt jejunumból nyertük ki TRIzol-reagenssel (Invitrogen, USA), és DNase I-vel (Invitrogen, USA) kezeltük a gyártó utasításainak megfelelően. A cDNS szintézist oligo (dT) 20 és Superscript II reverz transzkriptáz (Invitrogen, USA) alkalmazásával hajtottuk végre. A primereket a korábbi kutatások alapján választották ki [10]. β-az aktint választották referencia génnek.

2.4. Szűk kereszteződésű fehérjék immunblottozása

A teljes fehérje-extrakciós készlethez mellékelt utasításokat követve (KGP200, Keygen Biotech, Nanjing, Jiangsu, Kína) a teljes fehérjét izoláltuk. Egyenlő mennyiségű bélnyálkahártya-fehérjét izoláltunk egy poliakrilamid-gél segítségével, mielőtt egy polivinilidén-difluorid (PVDF) membránra helyeztük (Millipore, Bedford, MA, USA). Ezeket inkubáltuk elsődleges antitestekkel (kecske poliklonális claudin-1 antitest, nyúl poliklonális ZO-1 antitest és β-aktin nyúl antitest) (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) 12 órán át 4 ° C-on. A PVDF membránokat ezt követően a szekunder antitestekkel (kecske nyúl elleni IgG-HRP és nyúl anti-kecske IgG-HRP) inkubáltuk (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) 120 percig 25 ° C-on. A Western blotokat továbbfejlesztett kemilumineszcencia detektáló készlettel (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) vizualizáltuk, és az Alpha Imager 2200 szoftverrel (Alpha Innotech Corporation, CA, USA) fényképeztük. β-az aktin referencia fehérjék egyenlően oszlottak meg a csoportok között. A fehérje expresszió értékét a szoros junction fehérjék denzitometriai arányaként és β-aktin.

2.5. Statisztikai elemzések

A statisztikai adatok elemzését az SPSS 22.0 (Chicago, IL, USA) alkalmazásával végeztük. Hallgatói

-tesztet alkalmaztunk a csoportok közötti különbségek meghatározására, és a szignifikanciát a. Az adatokat átlagként ± az átlag standard hibájaként (SEM) adtuk meg.

3. Eredmények

3.1. Az alacsony dózisú kitozán nincs hatással a testsúlyra és az élelmiszer-bevitelre

Meghatároztuk a COS-tal kiegészített étrend hatását az egerek testtömegére, táplálékára és vízfogyasztására. Két hét elteltével nem észleltek különbséget a táplálék és a víz bevitelében (1. ábra) és a testtömegében (2. ábra) a csoportok között.

3.2. Az alacsony dózisú kitozán növeli a bél áteresztőképességét

A bél integritásának felmérése érdekében a szérum D-tejsavszint és a jejunal diamin-oxidáz biomarkereit mértük. A 3. ábra azt mutatja, hogy a szérum D-laktát a COS csoportban nagyobb volt, mint a kontroll csoportban (), és a jejunal diamin-oxidáz aktivitása a COS csoportban alacsonyabb volt, mint a kontroll csoportban ().

3.3. Az alacsony dózisú kitozán csökkenti a feszes kötésű gének és fehérjék expresszióját

A ZO-1, a claudin-1 és az occludin a bél szűk kereszteződésű fehérjéi, amelyek elengedhetetlenek a szoros összeköttetési stabilitás és a gátfunkció fenntartásához. Ebben a vizsgálatban a jejunális nyálkahártya ZO-1, claudin-1 és occludin mRNS szintjét értékelték. Az összes bélszegmens mRNS-expressziós szintjét a 4. ábra mutatja. A kontroll csoporthoz képest a ZO-1 és az occludin jejunális expressziója a COS csoportban szignifikánsan alacsonyabb volt a kísérleti csoportban (). Ugyanezt a tendenciát figyeltük meg a Western blotokban a releváns fehérje szintek becslésével (5. ábra). A kontroll étrenddel etetett egerekhez képest a ZO-1 és az occludin üregében a fehérje szintje szignifikánsan csökkent a COS csoportban ().

4. Megbeszélés

A kitozán a természetben a második leggyakoribb polimer [11] (az első a cellulóz), amely egyben a kevés pozitív töltésű alkáli poliszacharid egyike. A kitozánt mint étrend-kiegészítőt antimikrobiális növekedésserkentőként vizsgálták, és kimutatták, hogy elősegíti a brojlercsirkék [12, 13] és a sertések [14] növekedését. Ez a magasabb takarmánybevitelnek, a szérum növekedési hormonnak és az IGF-1 koncentrációnak tulajdonítható [15]. Ebben a tanulmányban azt tapasztaltuk, hogy az alacsony dózisú COS-kiegészítő étrendnek nincs hatása az egerek táplálék- és vízbevitelére vagy testtömegére. Ez megismétli korábbi vizsgálatunk azon megállapítását, miszerint nem találtak hatást az átlagos takarmányra és testtömegre azáltal, hogy ugyanazon 30 mg/kg kitozán adagot alkalmazták a malacok étrendjének kiegészítésére [9]. Huang és mtsai. arról is beszámolt, hogy nem találtak különbséget a növekedési teljesítményben egy brojlercsirkés vizsgálatban, amely magas kitozán adagot (150 mg/kg) használt [12]. Az ebben a kísérletben alkalmazott kitozán dózisa, molekulatömege, tisztasága vagy oldhatósága közötti különbségek ellentétes eredményekkel járhatnak [16].

A kitozán bél integritására gyakorolt hatásának meghatározásához értékeltük a szérum D-laktát és a jejunal diamin-oxidáz koncentrációját ezeknek a biomarkereknek megfelelően, amelyeket hasznosnak találtak a bél integritásának meghatározásához [17]. A csökkent bél-diamin-oxidáz aktivitás és a megnövekedett szérum D-laktát szint megfelel a sejtek és szövetek sérülésének [18]. Ugyanazokat a biomarkereket használtuk a bél permeabilitásának értékelésére. Eredményeink a D-laktát szérumszintjének és a diamin-oxidáz aktivitásának növekedését jelezték a 30 mg/kg kitozán dózisra adott válaszként; ez arra utal, hogy a bél integritása sérül.

A bél hámja szelektíven áteresztő gátat képez, amely kulcsfontosságú a patogén invázió megakadályozásában. A szoros csomópontok központi szerepet játszanak az akadály működésében, és felelősek a sértetlenségéért [19]. A szűk kereszteződésű fehérjék számos integrált membránfehérjét ölelnek fel, amelyek kötődnek a citoplazmatikus plakkfehérjékhez.

Az occludin, a claudin-1 és a ZO-1 szűk kereszteződésű fehérjék, amelyek molekuláris struktúrájukban és működésükben eltérőek; együttesen fontosak a szűk kereszteződés szerkezetének és működésének fenntartása érdekében. Az occludin és a claudin-1 transzmembrán fehérjék, amelyek szabályozzák a szűk kereszteződés működését és integritását [20]. Shen és mtsai. hogy a citoszkeleton az occludint és a ZO-1-t tartalmazó mechanizmus révén szabályozza a szivárgási út permeabilitását [19]. Másrészt Rosenthal és mtsai. kimutatta, hogy a paracelluláris permeabilitást a kitozán módosíthatja, függetlenül a szűk kereszteződésű fehérjék változásától [21]. Ebben a tanulmányban a ZO-1 és az occludin mRNS-expressziójának változását észleltük azon egerek csoportjában, akiket COS-kiegészített étrenddel tápláltak. A COS csoportban az okludlin jejunális mRNS-expressziója alacsonyabb volt, és a ZO-1 expressziója csökkent. Ez a megfigyelés összhangban van a megnövekedett szérum D-laktát koncentrációval és a jejunal diamin-oxidáz szintjének csökkenésével. A claudin-1 mRNS expressziója azonban nem változott. Ezek a megállapítások azt sugallják, hogy egerekben a bélgát integritását veszélyezteti az alacsony diétás kitozán-kiegészítés.

Következtetésként elmondható, hogy az egérmodellben a kitozán-kiegészítők 30 mg/kg-os dózisa nem befolyásolta a növekedési teljesítményt, de rontotta a bélgát integritását. A kutatás eredményei hozzájárulnak az alacsony dózisú kitozán-kiegészítőkkel kapcsolatos útmutatáshoz.

Versenyző érdekek

A szerzők kijelentik, hogy nincsenek versengő érdekek a cikk megjelenésével kapcsolatban.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a projektet a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (31402092), a Szubtrópusi Régió Agroökológiai Folyamatok Laboratóriumának Nyitott Alapítványa, a Kínai Tudományos Akadémia Szubtrópusi Mezőgazdasági Intézete (ISA2015303), a Hunani Tartományi Tudomány és Technológia finanszírozta. Tanszék (2013FJ3011, 2014NK3048, 2014NK4134 és 2014WK2032), valamint a Nanchangi Egyetem Élelmiszertudományi és Technológiai Állami Fő laboratóriumának nyílt projektprogramja (SKLF-KF-201416).