A magas zsírtartalmú étrend elnyomja a kreatin kiegészítés pozitív hatását a vázizom működésére, csökkentve az IGF-PI3K-AKT-mTOR út fehérje expresszióját

Egyformán járult hozzá ehhez a munkához: Renato Ferretti, Matias Mosqueira

Szerepek konceptualizálás, adatkezelés, hivatalos elemzés, vizsgálat, módszertan, projekt adminisztráció, felügyelet, validálás, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

A São Paulo Állami Egyetem Botucatu Biotudományi Intézetének anatómiai tanszéke - UNESP, Botucatu, São Paulo, Brazília

Szerepek Formális elemzés, vizsgálat, módszertan

¶ ‡ Ezek a szerzők is egyformán járultak hozzá ehhez a munkához.

A testmozgás, az anyagcsere és az egészség laboratóriuma, Centro Universitario Adventista de Sao Paulo, Hortolandia, São Paulo, Brazília

Szerepek Formális elemzés, vizsgálat, módszertan

¶ ‡ Ezek a szerzők is egyformán járultak hozzá ehhez a munkához.

A São Paulo Állami Egyetem Botucatu Biotudományi Intézetének anatómiai tanszéke - UNESP, Botucatu, São Paulo, Brazília

Szerepek konceptualizálás, felügyelet

Jundiai Orvostudományi Kar morfológiai és alapvető patológiai tagozata - FMJ, Jundiai, São Paulo, Brazília

Szerepek konceptualizálás, felügyelet

Társulás Escola Superior de Educação Física - ESEF, Jundiai, São Paulo, Brazília

Szerepek Formális elemzés, módszertan, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

A São Paulo Állami Egyetem Botucatu Biotudományi Intézetének Anatómiai Tanszéke - UNESP, Botucatu, São Paulo, Brazília

Szerepek Formális elemzés, Projekt adminisztráció, Felügyelet, Írás - eredeti vázlat, Írás - áttekintés és szerkesztés

A neuromuszkuláris plaszticitás laboratóriuma, az emberi mozgás tudományának posztgraduális programja, Universidade Metodista de Piracicaba, Piracicaba, São Paulo, Brazília

Egyformán járult hozzá ehhez a munkához: Renato Ferretti, Matias Mosqueira

Szerepek konceptualizálás, adatkezelés, formális elemzés, módszertan, projekt adminisztráció, felügyelet, validálás, vizualizáció, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Hovatartozás Kardioventilációs izomfiziológiai laboratórium, Élettani és Kórélettani Intézet, Heidelbergi Egyetemi Kórház, Heidelberg, Németország

Renato Ferretti,
Eliezer Guimarães Moura,
Veridiana Carvalho dos Santos,
Eduardo José Caldeira,
Marcelo Conte,
Cintia Jurij Matsumura,
Adriana Pertille,
Matias Mosqueira

Megjelent: 2018. október 4
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199728
>> Lásd az előnyomást

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Ferretti R, Moura EG, dos Santos VC, Caldeira EJ, Conte M, Matsumura CY és mtsai. (2018) A magas zsírtartalmú étrend az IGF-PI3K-AKT-mTOR út fehérje expressziójának csökkentésével elnyomja a kreatin kiegészítés pozitív hatását a vázizom működésére. PLoS ONE 13 (10): e0199728. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199728

Szerkesztő: Guillermo López Lluch, Universidad Pablo de Olavide, SPANYOLORSZÁG

Fogadott: 2018. június 4 .; Elfogadott: 2018. szeptember 23 .; Közzétett: 2018. október 4

Adatok elérhetősége: Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és annak kiegészítő információs fájljában (S1 táblázat).

Finanszírozás: A szerző (k) nem kaptak támogatást ehhez a munkához.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Az elhízás elleni fizikai rehabilitáció egyik stratégiai kezelési módja az ellenállóképzés növeli az erőtermelő képességet, javítja az izomtömeget és pozitív hatással van a vázizom elhízással összefüggő változásaira [8]. Ez a technika növeli az IGF-1 expresszióját, amely az egérben csökkenti a miozin 2B expressziót és növeli a miozin 2X expressziót, míg az embereknél a gyors köztitermékű 2X miozin és a gyors közbenső miozin 2A felfelé történő szabályozása van [2 ].

Anyagok és metódusok

Az állatok gondozása és használata

Negyven hím Wistar patkányt (HanUnib; Rattus novergucis) nyertünk a campinasi Állami Egyetem (CEMIB-UNICAMP) tenyésztő telepéből, és intézményi állattartó intézményünk tartotta fenn. A patkányokat kollektív ketrecekben (2-3 állat ketrecben) állandó hőmérsékleten (21 ± 2 ° C), 12 órás fény/12 órás sötétség ciklusokban, szabad táplálékhoz és vízhez való hozzáféréssel tartottuk. Minden állatkísérletet a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutató szerint hajtottak végre. A kísérleti protokollokat az FMJ Állattenyésztési és Felhasználási Bizottság hagyta jóvá (folyamat száma 490/2012).

Kísérleti csoportok

A kísérletek időpontjában minden állat 24 hetes volt, és az étrend, az edzés és a kreatin-kiegészítés szerint a következő nyolc kísérleti csoportba sorolták: i) edzetlen (UT) standard étrend (SD; n = 5), ii ) képzetlen kreatin-kiegészítés (SD-CrM; n = 5), iii) rezisztencia edzés (SD-T; n = 5), iv) rezisztencia-képzés kreatin-kiegészítéssel (SD-T-CrM; n = 5), v) képzetlen magas zsírtartalmú étrend (HF; n = 5), vi) képzetlen HF kreatin-kiegészítéssel (HF-CrM; n = 5), vii) HF és rezisztencia edzés (HF-T; n = 5) és viii) HF és rezisztencia edzés kreatin kiegészítéssel (HF-T-CrM; n = 5).

Az SD, SD-CrM, SD-T és SD-T-CrM állatok normál étrendben részesültek (Nuvital, Nuvilab, Brazília), amelyek 71 g szénhidrátot, 23 g fehérjét, 6 g teljes zsírt és 5 g rostot tartalmaztak, összesen 3,8 kcal/g. Nyolc héttel a kísérletek megkezdése előtt és a kísérleti eljárások nyolc hetében az elhízás patkánycsoportjai (HF, HF-CrM, HF-T és HF-T-CrM) magas zsírtartalmú étrendet kaptak (Nuvital, Nuvilab, Brazília) ) 38 g szénhidrátot, 15 g fehérjét, 46 g teljes zsírt és 5 g rostot tartalmaz, összesen 5,4 kcal/g. Az állatok a kísérleti időszak alatt szabadon hozzáférhettek a vízhez és a chow-hoz. A CrM-kiegészítést (300 mg/kg/nap) naponta adtuk szondával az 1. naptól a kísérleti eljárás utolsó napjáig.

Ellenállás-edzés protokoll

A képzés mennyiségi elemzése

A maximális teherbírást a létra tetejére szállított terhelés teljes mennyisége határozta meg. A grammban mért teljes izotóniás összehúzódást a testtömeg és a létra tetejére emelt súly és az ismétlések számának (a patkány sikeres felmászásának száma a létra tetejére) összegzésével számoltuk. A kiló Joule-ban (KJ) mért munkát kiszámítva a létra tetejére emelt teljes tömeg, a létra hossza (1,1 m), a gravitációs erő (9,8 06 ms -2) és a létra szöge (sen80 ° = 0,9848) szorzata.

Mintagyűjtés és szövet előkészítés

Miután a patkányok az utolsó hegymászás után 48 órán át pihentek, ketamin (80 mg/testtömeg-kg) és xilazin (12 mg/testtömeg-kg) keverékével, valamint a bal és a jobb gasztrocnemius keverékével gyorsan altattak és egy gyorsfagyasztott folyékony nitrogénben lehűtött N-hexánban és -80 ° C-on tároltuk. A megdermedt izmokat keresztirányú keresztmetszettel (8 μm vastagságú kriosztátszelvények), majd szövettani elemzés céljából heamtoxilin-eozinnal (HE) festettük, ahol a Feret minimális rostátmérőjét az Image J 1.51f szoftver segítségével számítottuk ki (Országos Egészségügyi Intézet) (USA). A Feret minimális átmérőjét használtuk, mivel a szakaszok többnyire merőlegesek voltak az izom hosszú tengelyére, és így a merőleges hosszú tengelytől való minimális eltérés műtermékeket vezethet be a mérésekbe. Az egyes kísérleti állapotok rostméretét 5–7 véletlenszerűen készített kép alapján határoztuk meg.

A fehérje szintjének meghatározása

Az egyes patkányok második gastrocnemiusából származó izommintákat frissen hozzáadott proteáz és foszfatáz inhibitorokat (1% Triton X-100, 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM nátrium-pirofoszfát, 100 mM NaF, 10 mM) tartalmazó lízispufferben lizáltuk. nátrium-orto-vanádium, 10 mM EDTA, 2 mM PMSF és 10 μg/ml aprotinin). A mintákat 20 percig 11 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk, és az oldható frakciót 50 μl Laemmli töltőpufferben (2% SDS, 20% glicerin, 0,04 mg/ml bróm-fenol kék, 0,12 M Tris-HCl, pH 6,8 és 0,28) szuszpendáltuk. M-merkaptoetanol). A mintákat az elemzésig -80 ° C-on tároltuk. A fehérjéket 8% -12% SDS-poliakrilamid géleken oldottuk fel, és nitrocellulóz membránra vittük át. Az elsődleges antitesteket 0,05% Tween-t (TBS-T) tartalmazó TBS-ben hígítottuk. A membránokat egy éjszakán át inkubáltuk primer antitestekkel 4 ° C-on (S1 táblázat). A másodlagos antitest inkubáláshoz anti-nyúl vagy anti-egér HRP-t (Promega) hígítottunk 5% sovány tejet tartalmazó TBS-T-ben (S1 táblázat). Az eredményeket fokozott kemilumineszcencia (ECL) SuperSignal West Pico kemilumineszcens szubsztrátkészlettel (Pierce Biotechnology) tettük láthatóvá. A fehérjetöltet-szabályozás érdekében a blotokat sztrippeltük, és újra megvizsgáltuk a glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) szempontjából. A sáv intenzitását az ImageJ 1.38X (National Institute of Health, USA) segítségével számszerűsítettük.

Statisztikai analízis

Az összes statisztikai elemzést a GraphPad Prism Windows 6-os verziójával, a GraphPad Software, a La Jolla California USA, www.graphpad.com segítségével végeztük. Egyirányú varianciaanalízist (ANOVA) alkalmaztunk post hoc többszörös összehasonlítással. Sidak többszörös összehasonlító tesztjét alkalmazták a testtömeg, az epididymális zsírtömeg, a relatív zsírtömeg és a fehérjeszint tekintetében. Több párosítatlan kétfarkú Student-féle t teszt páros összehasonlításhoz Benjamin & Hochberg módszerével, és az FDR (Q) = 5% -ot a maximális teherbírás, a teljes izotóniás összehúzódás, a munka és a relatív teherterhelésnél alkalmaztuk. Nem parametrikus egyirányú ANOVA Kruskal – Wallis tesztet alkalmaztunk Feret minimális átmérőjén. A szignifikanciát p-nek tekintettük. 1. ábra. A magas zsírtartalmú étrend hatása a patkányok testtömegére.

(A) A standard étrend (SD, (kék) és a magas zsírtartalmú étrend (HF; piros) összehasonlítása patkány testtömegén (g) képzetlen (UT) patkányokon, kiképzett (T) patkányokon, kreatin-monohidráttal kiegészítés (CrM) és képzett patkányokban CrM kiegészítéssel (T-CrM). (B) A HF étrend hatása a patkány epididymális zsírtömegére (g) az SD-hez viszonyítva UT, T, CrM és T-CrM kezelések után. (C) Az epididymális zsírtömeg reakciója a teljes testtömeghez viszonyítva a HF-étrenden, összehasonlítva az SD-vel UT, T, CrM és T-CrM kezelések során. N = öt patkány mindegyik csoportban; * p a 8. hétig, a munka hasonló volt az SD-hez (2C. ábra, S7. táblázat). A CrM-mel kiegészített képzett patkányokban megfigyelt izomfiziológiai változás korrelációja érdekében a 8. kísérleti hét végén boncoltuk a gasztrocnemust anatómiai elemzésekhez. Először azt tapasztaltuk, hogy az izomrostméret (Feret minimális átmérője, μm) nőtt a CrM-mel kiegészített képzett patkányokban (2D ábra). a gastrocnemiuson a CrM hipertrófiás hatása képzett patkányokra, az izomrost átmérőjének eloszlását mérve a minimális Feret-átmérő módszerrel (2E ábra).

(A) Maximális teherbírás (g). (B) A terhelés testtömegre normalizálva (g/g). (C) Teljes izotóniás összehúzódás (g). (D) A teljes izotóniás kontrakció testtömegre normalizálva (g/g). (E) Munka (KJ). (F) Testtömegre normalizált munka (KJ/g). n = 5. * Az edzés 8. hetéig az SD-T-CrM patkányok izomteljesítménye szignifikánsan javult, miután a maximális teherbírást a testtömeg normalizálta (5B. ábra). Bár a teljes izotóniás erő (5C. Ábra), a testtömeg által normalizált teljes izotóniás erő (5D ábra), a munka (5E ábra) és a testtömeg által normalizált munka (5F ábra) elemzése azt mutatta, hogy az SD-T CrM patkányok teljesítmény, de ez nem volt szignifikáns a HF-T-CrM patkányokhoz képest.

(A) Maximális teherbírás (g). (B) A terhelés testtömegre normalizálva (g/g). (C) Teljes izotóniás összehúzódás (g). (D) A teljes izotóniás kontrakció testtömegre normalizálva (g/g). (E) Munka (KJ). (F), Testtömegre normalizált munka (KJ/g). n = 5. * p 6. ábra. A gastrocnemius izom IGF-1-PI3K-AKT-mTOR útjának fehérje expressziójának immunblott elemzése.

Az egyes immunblotok alján feltüntetett GAPDH fehérje szinteket normalizáltuk az egyes immunblotok tetején látható fehérje szintekkel. Három független kísérletet mutatunk be és különítünk el a kezelésnek megfelelően, színkódolt sávval jelölve; a zöld az SD-T csoportot, a kék az SD-T-CrM csoportot, a szürke a HF-T csoportot és a piros a HF-T-CrM csoportot jelenti. (A) IGF-1. (B) IGF-1 receptor β alegység. (C) IRS1 β alegység. (D) PI3K. (E) Foszforilezett AKT. (F) Teljes mTOR. (G) Foszforilezett mTOR. (H) A foszforilált mTOR és a teljes mTOR aránya. (I) S6K. n = 3. * p 7. ábra: Az IGF-1-PI3K-AKT-mTOR útvonal gastrocnemius izomzatának fehérjeszintre gyakorolt hatásának összefoglalása 8 hetes ellenállóképzés után, CrM, HF vagy HF-CrM vétele után.

A kreatin-monohidrát-kiegészítés (CrM) növelte az IGF1, az IGF1-receptor és a foszforilezett AKT fehérje szintjét. A CrM-kiegészítés által elősegített fehérjeszint emelés ez az izomteljesítmény növekedését magyarázza. A magas zsírtartalmú étrend (HF) és a magas zsírtartalmú étrend, amelyet CrM-mel (HF-CrM) egészítettek ki, csökkentette az IGF1, IRS1, PI3K, foszforilezett mTOR fehérje szintjét, és a HF-CrM csökkentette a foszforilezett SKT és S6K fehérje szintjét is. Az IGF-1-PI3K-AKT-mTOR út ezen kulcsfontosságú célpontjainak fehérjeszintjének csökkenése megmagyarázná a csökkent izomteljesítményt.

Következtetés

Bemutattuk azt a mechanizmust, amellyel a CrM a rezisztencia edzés során növeli az izom méretét és az izom teljesítményét, ami arra utal, hogy az izomfehérje szintézis nagyobb mértékben aktiválódik az IGF1-IRS1-PI3K-AKT-mTOR útvonalon keresztül. Ezzel szemben a HF-étrend csökkenti az izom méretét és teljesítményét azáltal, hogy gátolja ugyanazon IGF1-IRS1-PI3K-AKT-mTOR útvonal expresszióját, és ezt a hatást nem vetette el a CrM kiegészítése. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az étrendet előzetesen meg kell változtatni annak érdekében, hogy érzékelhető legyen az ellenállóképzés és a CrM-kiegészítés előnye.

Segítő információ

S1 ábra. A foszforilezett AKT (p-Akt-Ser473) fehérje expressziójának immunoblotting elemzése a gastrocnemius izomból.

Az immunblot alján látható GAPDH fehérje szintjét használtuk a normalizálásra a tetején látható pAKT fehérje szintjeivel. Három független kísérletet mutatunk be és különítünk el a kezelésnek megfelelően, színkódolt sávval jelölve; a zöld az SD-T csoportot, a kék az SD-T-CrM csoportot, a szürke a HF-T csoportot és a piros a HF-T-CrM csoportot jelenti. n = 3. A szignifikanciát a kísérlet második hetében vettük figyelembe.