A Lactobacillus plantarum probiotikus potenciálja és biztonsági tulajdonságai szlovák Bryndza sajtból Tanulmányi tanulmány az "Állatorvos-tudomány"

Hasonló témák az állatorvos-tudományban, tudományos cikk szerzője - Anna Belicová, Mária Mikulášová, Roman Dušinský

Akadémiai tanulmány a "Szlovák bryndza sajtból származó Lactobacillus plantarum probiotikus potenciálja és biztonsági tulajdonságai" témában

Hindawi Publishing Corporation BioMed Research International

2013. évfolyam, 760298. cikkazonosító, 8 oldal ^ W M

A Lactobacillus plantarum probiotikus potenciálja és biztonsági tulajdonságai szlovák Bryndza sajtból

Anna Belicova, 1 Maria Mikulasova, 1 és Roman Dusinsky2

1 Molekuláris Biológiai Tanszék, Természettudományi Kar, Comenius Egyetem, Mlynska Dolina, 84215 Pozsony, Szlovákia

2 Genetikai Tanszék, Természettudományi Kar, Comenius Egyetem, Mlynska Dolina, 84215 Pozsony, Szlovákia

A levelezést Roman Dusinsky-nak kell címezni; [email protected] 2013. április 29-én érkezett; Felülvizsgált 2013. július 12 .; Elfogadva 2013. augusztus 4. Akadémiai szerkesztő: Ali Gholamrezanezhad

Százhuszonöt savas rezisztens feltételezett laktobacillust izoláltak a szlovák Bryndza sajtból, és spot agar vizsgálattal nyolc bakteriális kórokozóval szemben ellenőrizték antimikrobiális aktivitásukat. Huszonhat Lactobacillus erős gátló aktivitású törzsből húszat azonosítottak Lactobacillus plantarum néven. hat mint Lactobacillus fermentum. A legaktívabb tizenegy L. plantarum izolátumot tovább jellemeztük in vitro bizonyos probiotikus és biztonsági tulajdonságokkal. Csak három K10, K21 és ZS07 izolátum mutatta azt a képességet, hogy 50% fölött növekedjen 0,3% epe jelenlétében. Az erős dekonjugációs hatékonyságot meghatároztuk a CK06 és a K21 esetében. A legnagyobb ^ -galaktozidáz aktivitást a ZS11, B01, CK06 és ZS07 izolátumok mutatták. A törzsek közül csak három volt képes a tiramin előállítására: CK06, LM1 és ZS11. A K09, K21, ZS11 és ZS15 törzsek érzékenyek voltak minden tesztelt antibiotikumra. Az eredmények elemzése megerősítette, hogy az L. plantarum ZS07 és K21 izolátumok a probiotikus és biztonsági jellemzőik miatt a legalkalmasabbak probiotikus alkalmazásra.

A probiotikumok élő mikroorganizmusok, amelyek megfelelő mennyiségben fogyasztva egészségügyi hasznot jelentenek a gazdaszervezet számára [1]. A Lactobacillus és a Bifidobacterium nemzetség fajai a tejsavbaktériumok közé tartoznak, amelyeket leggyakrabban probiotikumként alkalmaznak az állati takarmányokban és az emberi táplálékokban. Az Amerikai Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hivatal szerint "általában biztonságosnak tekintik" (GRAS státusz), mivel a fermentált élelmiszerekben való biztonságos felhasználásuk régóta fennáll, valamint az emberek normális bél- és urogenitális mikrobiotájában vannak. Számos faj, köztük a L. plantarum és a L. fermentum, az Európai Élelmiszerbiztonsági Hatóság (EFSA) által megkapta a minősített biztonsági vélelem (QPS) minősítést. A probiotikumok értékelésére vonatkozó ajánlások szerint a feltételezett probiotikus törzseket át kell szűrni alapvető funkcionális tulajdonságaik (a gyomorsavval és az epesókkal szembeni ellenálló képesség, az antimikrobiális vegyületek termelése, az immunválasz modulálásának képessége és a bélszövetekhez való tapadás) és a biztonsági tulajdonságok, például mint antibiotikum-rezisztencia és biogén aminok termelése in vitro tesztekben. További ajánlások közé tartozik a hemolitikus hiánya

a törzsek aktivitása és átvihető antibiotikum-rezisztenciája, ahol a biztonságot állatmodellekben kell bizonyítani [1].

A szlovák Bryndza sajt természetes, kenhető, jellegzetes illatú és ízű sajt, amelyet hagyományos módszerrel állítanak elő: érett anyajuh sajt vagy egy darab tehén csomós sajt keverékének őrlésével. A Bryndza sajt számos domináns tejsavbaktériumot (LAB) tartalmaz, amelyek a Lactobacillus spp., Enterococcus spp., Lactococcus spp. És Streptococcus spp. [2, 3]. A L. plantarum mindenütt jelenlévő tejsavbaktérium, amelyet olyan környezetben detektálnak, mint az élelmiszer (tejtermékek, erjesztett hús, zöldségek, gyümölcsök és italok), az emberek és az állatok légzőszervi, gyomor-bélrendszeri és nemi szervei, valamint a szennyvíz és a növényi anyagok.

Számos L. plantarum izolátum bizonyította, hogy képes túlélni a gyomor transzportját, és gyarmatosítani az emberek és más emlősök bélrendszerét [4, 5]. Bizonyos tanulmányok kimutatták, hogy az egyéb hatások mellett a L. plantarum fogyasztása csökkentette az ürülék Enterobacteriaceae hordozását, csökkentette a koszorúér-betegség bizonyos rizikófaktorait, és dózisfüggő csökkenést eredményezett az IBS tüneteiben [6]. Úgy tűnik, hogy a probiotikus potenciállal rendelkező törzsek kutatásában,

az étel megfelelő forrás lehet megfelelő izolátumok számára, hogy új probiotikus törzseket találjanak funkcionális élelmiszer-ipari termékekhez. Az a hagyományos ajánlás, miszerint az emberre szánt probiotikus törzseknek embertől kell származniuk (fajspecifikus kritérium), enyhül, mert jelenleg számos probiotikus termék között szerepel a nem induló LAB (NSLAB), például az L. paracasei és az L. plantarum. Ezek az L. plantarum probiotikus törzseket tartalmazó élelmiszer- és egészségügyi termékek kereskedelemben kaphatók [6].

Kutatásunk célja (1) a Bryndza sajtból izolált L. plantarum törzsek jellemzése és (2) a probiotikumként alkalmazható legmegfelelőbb törzsek kiválasztása funkcionális és biztonsági tulajdonságaik szerint, beleértve a kórokozókkal szembeni antagonista aktivitást, az epe rezisztenciáját, epesó dekonjugáció, ^ -galaktozidáz aktivitás, antibiotikum-rezisztencia és biogén aminok termelése.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Savval szemben ellenálló laktobacillusok mintavétele és izolálása. A szlovák Bryndza sajtból összesen 125 feltételezett savtoleráns laktobacillust izoláltak. A Bryndza-mintákat öt kereskedelmi gyártótól, nevezetesen Brezrnn-től (B), Cerveny Kamen-től (CK), Kluknava-tól (K), Liptovsky Mikulas-tól (LM) és Zvolenska Slatinától (ZS) - nyertük. A Brezrnn-i Bryndza friss anyajuhból, pasztörizálatlan anyatejből készült. Egyéb Bryndza-mintákat, nevezetesen az LM-t és a ZS-t friss anyajuhok (pasztőrözött anyatejből) és tehenek darabos sajtjai készítették pasztörizált tehéntejből, míg CK és K anyajuhokból néhány hónap, valamint pasztőrözött tehéntejből készült tehéncsomó-sajt, ahol az anyajuh egyösszegű sajtja a keverék több mint 50% -át adja szárazanyagban.

A LAB-okat alacsony pH-értékkel szembeni ellenálló képességük miatt vizsgáltuk. Röviden, a sajtmintát steril 2% (w/v) trinátrium-citrátban 45 ° C-on 3 percig emulgeáltuk, és a sejteket 5 percig végzett centrifugálással gyűjtöttük össze, 12 000 x g-vel. Az üledéket kétszer 1/4-es Ringers-oldattal mossuk, majd végül MRS-táptalajban szuszpendáljuk (a pH-értéket 1 N sósavval állítjuk be). A baktériumokat 3 órán át 37 ° C-on tenyésztettük, majd steril sóoldatban sorozatban hígítottuk, és három példányban az MRS agarra helyeztük. A lemezeket anaerob körülmények között inkubáltuk 48 órán át 37 ° C-on (Bugbox, Ruskinn Technology, Egyesült Királyság). Az egyes gyártók huszonöt véletlenszerűen kiválasztott Bryndza sajtmintáját két egymást követő szubkultúrával tisztítottuk, majd mikroszkópos vizsgálatnak, Gram festésnek és kataláz tesztnek vetettük alá. A kataláz-negatív, Gram-pozitív rudak telepeit feltételezzük, hogy laktobacillusok. 20% glicerint tartalmazó MRS-ben tároltuk -80 ° C-on.

2.2. Az antagonista tevékenység szűrése. Az izolátumok antagonista aktivitását a máshol leírtak szerint értékeltük [7]. Az izolátumok egyik napról a másikra tenyészeteit az agarlemezek felületére (MRS-0,2, 1,2% agarral) tapasztaltuk, és anaerob módon inkubáltuk 24 órán át 37 ° C-on (Bugbox, Ruskinn Technology, UK). 100 ^ L18 órás indikátor törzsek tenyészeteit beoltottuk 7 ml lágy BHI agarba (0,7% agart tartalmazva) és öntöttük a lemezre, amelyen a termelőt növesztettük. 48 órán át 37 ° C-on végzett aerob inkubálás után a lemezeket

ellenőrizte a gátló zónákat. A gátlás pozitívnak bizonyult, ha a termelő törzs telepei körül a tiszta zóna szélessége 1 mm vagy nagyobb volt. Indikátor törzsként a következő kórokozókat és opportunista kórokozókat használtuk: Listeria monocytogenes CCM 4699; Staphylococcus lentus CCM 3472; Acinetobacter calcoaceticus CCM 4503; Sphin-gomonas paucimobilis CCM 3293; és Salmonella enterica subsp. enterica, Typhimurium TA100 CCM 3812 szerovar törzs a Cseh Mikroorganizmus Gyűjteményből, Brno, Csehország, Enterococcus faecalis V583 az Oklahomai Egyetemről, Amerikai Egyesült Államok, Staphylococcus aureus SSV25 és Staphylococcus epidermidis SSV30 (gyűjteményünkből).

Az antagonista aktivitást mutató törzseket tovább teszteltük sejtmentes semlegesített felülúszók (CFNS) aktivitására Uhlman et al. [8]. Röviden, CFNS-eket nyertünk MRS táptalajban 18 órán át 37 ° C-on tenyésztett tenyészetekből. Miután a tenyésztést 12000 xg-vel 15 percig centrifugáltuk, a felülúszó pH-ját NaOH-val 6,5-re állítottuk és 100 ° C-on 5 percig melegítettük. A felülúszókat ugyanazon indikátor törzsekkel szemben teszteltük, mint korábban.

2.3. A kiválasztott izolátumok azonosítása. Huszonhat feltételezett laktobacillust azonosítottak fajszinten az API 50 CH rendszer és az 50 CHL táptalaj (Bio-Merieux, Franciaország), a gyártó utasításainak megfelelően. Az eredményeket 2 napos, 37 ° C-os inkubálás után rögzítettük, és a Bio-Meerieux által biztosított ApilabPlus azonosító szoftverrel értékeltük.

2.3.1. Sejtlizátumok előállítása. Két izolátum kolóniát szuszpendáltunk 50 ^ 1 Tris-HCl-EDTA-sóoldatban (pH 8,0). A baktérium-szuszpenziót 10 percig 95 ° C-on inkubáltuk, és 18600 xg-vel 2 percig centrifugáltuk, és a kapott felülúszót használtuk PCR-templátként.

2.3.2. PCR azonosítás. Az izolátumokat fajspecifikus primerekkel azonosítottuk a L. plantarum LbP11 (5 'AATTGAGGCAGCTGGCCA 3') és az LbP12 (5 'GATTAC-GGGAGTCCAAGC 3') [9] és

Lfer3 (5 'ACTAACTTGACTGATCTACGA 3') és Lfer4 (5 'TTCACTGCTCAAGTAATCATC 3') [10]. Az Lb1 (5 'AGAGTTTGATCATGGCTCAG 3') és az Lb2 (5 'CGG-TATTAGCATCTGTTTCC 3') primereket használtuk a PCR pozitív kontrolljaként LbP11 és LbP12 primerekkel. Az ebben a vizsgálatban használt összes primert Invitrogen-től (USA) szereztük be. A PCR-amplifikációt 25 ^ 1 reakcióban hajtottuk végre, amely 0,5 ^ L dNTP-t (10 ^ M mindegyik dNTP-ben), 0,75 ^ L primert (10 pM), 0,42 ^ L sejtlizátumot, 2,5 ^ 1 reakciópuffert (10x), 0,17 ^ L Taq DNS-polimeráz (5 U/^ L, GeneCraft, Németország) és 18,9 ^ l ioncserélt víz. A PCR reakciókat PTC-100 Peltier termikus ciklissel hajtottuk végre (MJ kutatás, USA). Az elegyet 5 percig denaturáltuk 95 ° C-on, és 35 alkalommal 94 ° C-on 30 másodpercig, 54 ° C-on 1 percig (55 ° C-on az L. fermentumnál) és 72 ° C-on 1 percig, majd egy utolsó 10 perc hosszabbítás 72 ° C-on. A PCR termékeket elektroforézissel elválasztottuk 1,5% -os agaróz gélen, amelyet etidium-bromiddal festettünk, UV-fényben láthatóvá tettük. Az egyes PCR-termékek méretét a 100 bp-os DNS-létra összehasonlításával határoztuk meg (Fermentas, Lettország).

L. plantarum CCM 4281 és L.fermentum CCM 91-et alkalmaztunk kontrollként a fajok azonosításához.

Az izolátumok genetikai változatosságát (GTG) 5-PCR-rel határoztuk meg Versalovic és mtsai. [11] egyetlen oligonukleotid primer alkalmazásával (5'GTGGTGGTGGTGGTG 3 '). A rep-PCR profilokat a Bio-1D szoftver (Vilber Lourmat, Franciaország) elemezte. A digitalizált profilok hasonlóságát a Jaccard együtthatóval számoltuk, és egy átlagos linkage (UPGMA) dendrogramot vezettünk le.

2.4. Epeellenállás. Az izolátumok epe jelenlétében való túlélését Vinderola és Reinheimer módszerével határoztuk meg [12]. Az izolátumokat (2% w/v) MRS táptalajba oltottuk 0,3%, 0,5% vagy 1% (w/v) epével (Sigma-Aldrich, USA). 24 órás 37 ° C-on történő tenyésztés után megmértük az A560 nm-t, és összehasonlítottuk egy kontroll tenyészettel (epesók nélkül). Az eredményeket a növekedés százalékában (A560 nm) fejezzük ki epesók jelenlétében a kontrollhoz viszonyítva.

2.5. Epesó dekonjugáció. Az izolátumokat az epesó lemezekre csíkoltuk, MRS agar alkalmazásával, 0,5% (w/v) nátriumsóval (Sigma-Aldrich, USA) taurokolsavval (TC), taurodeoxikolsavval (TDC), glikokolsavval (GC), és a glikodeoxi-kolsavat (GDC), és ezeket anaerob módon inkubáltuk 37 ° C-on 72 órán át. Az izolátumok azon képességét, hogy dekonjugálják az epesókat, a telepek körül kicsapódott epesav képződése bizonyítja - egy átlátszatlan halo [13].

2.6. p-galaktozidáz aktivitás. Az egész sejtek ^ -galaktozidáz aktivitását Miller [14] módszerével határoztuk meg, Vinderola és Reinheimer módosítása szerint [12]. Az o-nitro-^ -D-galaktopiranoziddal (Sigma-Aldrich, USA), mint reakció-szubsztráttal végzett ^ -galaktozidáz aktivitást laktóz-MRS táptalajba beoltott kultúrákban határoztuk meg. A reakció után meghatároztuk az optikai sűrűségeket 420 és 560 nm-en, és kiszámítottuk a ^ -galaktozidáz aktivitást (Miller egységek) az alábbiak szerint: 1000 x [A420 - (1,75 x A2560)/(15 perc x 1 ml x A1560) j ahol A1560 az abszorbancia közvetlenül a vizsgálat előtt, és A2560 a reakcióelegy abszorbancia értéke.

2.7. Antibiotikum érzékenység tesztelése. A 11 L. plantarum törzsek minimális gátló koncentrációját húsleves mikrodilúciós teszttel határoztuk meg. Az egyes telepeket 5 ml steril sóoldatban szuszpendáljuk McFarland-skálán 1-es zavarossá, majd 500-szorosára hígítjuk LSM-táptalajban (Iso-sensitest húsleves: MRS, 9: 1). Ötven liter hígított baktérium-szuszpenziót adtunk a kézzel előkészített MIC mikrotiter tesztlemezek mindegyik lyukához (a lyukankénti 50 ^ 1 térfogatú LSM-táptalajban különböző antibiotikum-teszt koncentrációkat tartalmazva). Az antibiotikumokat koncentrációs tartományokban (mg/l) teszteltük: ampicillin (0,032-16), gentamicin (0,5-256), kanamicin (2-256), eritromicin (0,016-16), klindamicin (0,032-16), tetraciklin (0,12-64) és klóramfenikol (0,12-64). A lemezeket 24 órán át 37 ° C-on inkubáltuk. A MIC-értékeket a legalacsonyabb antibiotikum-koncentrációként határoztuk meg, amely gátolta a baktériumok látható növekedését, turbidimetrikusan (A650nm) mérve egy mikrolemez-olvasóval

(Varioskan Flash, Thermo Scientific, Finnország). A fogékony és rezisztens törzseket megkülönböztettük az EFSA által közölt töréspontok (cut-off értékek) szerint [15]. Ennek megfelelően azokat a törzseket tekintettük rezisztensnek, amelyek MIC-értéke magasabb, mint a vonatkozó határértékek.

2.8. Biogén aminok előállítása. A biogén amintermelést 2% L-hisztidin-monohidrokloridot, L-tirozin-dinátrium-sót vagy L-ornitin-monohidrokloridot (Sigma-Aldrich, USA) tartalmazó dekarboxilező közeglemezeken vizsgáltuk Joosten és Northolt leírása szerint [16]. Az izolátumokat kétszer szubkultúráztuk dekarboxiláló táptalajban, kiegészítve a megfelelő aminosav-prekurzorral (1 g/l) és 1 mg/l piridoxal-5-foszfáttal, és 24 órán át 37 ° C-on inkubáltuk. Mindegyik tenyészetből 1 ^ l-t észleltünk a dekarboxilező agarokon, majd a lemezeket anaer-obikusan (Bugbox, Ruskinn Technology, Egyesült Királyság) inkubáltuk 37 ° C-on 72 órán át. Az összes tápközeg amintermelése mellett a lila halot pozitív reakcióként értelmezték, kivéve a tirozint tartalmazó dekarboxiláló közegeket, ahol a pozitív választ a telepeket körülvevő tiszta halo jelentette. A kísérleteket háromszor hajtottuk végre.

3. Eredmények és megbeszélés

Öt kereskedelmi forgalmazó Bryndza sajtmintáiból 125 feltételezett savrezisztens laktobacillus gyűjteményt izoláltak. Valamennyi izolátumot azon képességük alapján választottuk ki, hogy képesek túlélni a 3 órás tenyésztést pH-n 2,0 és pozitív Gram-reakciójuk, negatív kataláz-reakciójuk és rúd alakjuk alapján (az adatokat nem mutatjuk be). Az alacsony pH-val szembeni ellenállás fontos szelekciós kritérium a probiotikus mikroorganizmusok számára, mivel a gyomorban lévő gyomornedv elpusztítja a legtöbb bevitt mikroorganizmust. Burns és mtsai. [17] és Jamaly és mtsai. [18] azt is dokumentálta, hogy az összes vizsgált törzs három órányi savas expozíciót képes elviselni pH 2,0-nél, az életképesség csak lassú csökkenésével. Sok más tanulmány megerősítette, hogy a Lactobacillus törzsek 2,5-4,0 pH-értéknek való kitettsége nem befolyásolja túlélési arányukat, de alacsonyabb pH-értékeknél csökkent [19-21]. A flactobacillito képessége, hogy 2,0–3,0 fiziológiás pH-jú táptalajon keresztül (a gyomor környezetét utánozva) túlélje az áthaladást, változó és törzsfüggő volt, de körülbelül 85% -os túlélési rátával rendelkezik, ami a probiotikus mező szempontjából nagyon jelentős [22, 23].

Valamennyi izolátumot megvizsgáltuk a kiválasztott Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok gátló aktivitása szempontjából. Az agar folt tesztben a Lactobacillus izolátumok különböző gátló aktivitást mutattak, amikor teszteltük az indikátor törzsekkel, míg a gátlás zónája 1 mm és 5 mm között mozgott (1. táblázat). A Lactobacillus izolátumok 93% -a mutatott antimikrobiális aktivitást az L. monocytogenes ellen. A S. lentust és az E.faecalis-t 82, illetve 80% -kal gátolták. Az izolátumok 86% -a mutatott antimikrobiális aktivitást a S. aureus és 79% -a S. epidermidis ellen. Számos törzs (93%) gátló aktivitást mutatott a S. enterica ellen. A S. paucimobilis a törzsek 68% -ában gátolt. A Lactobacillus izolátumoknak csak 52% -a mutatott aktivitást az A. calcoaceticus ellen.

Összesen 26 izolátumból kiderült, hogy erős gátlási zónákat produkál (2 mm-nél nagyobb és 5 mm közötti gátlási zóna)

1. táblázat: Az indikátor törzsekkel szemben antimikrobiális hatású prediktív lactobacillus izolátumok száma.