A magas transz-zsírsavtartalmú és magas cukortartalmú étrend alkoholfogyasztó steatohepatitisben szenvedő egereket okozhat májfibrózissal és potenciális patogenezissel

Absztrakt

Háttér és célok

Még az alkoholmentes steatohepatitis (NASH) is a kulcsfontosságú szerepet játszik a májfibrózis vagy a cirrhosis folyamatában, egyetlen olyan májfibrózisos egérmodellt nem tartalmazó NASH sem, amely összhangban lenne a zsírsav és a glükóz anyagcserezavar mechanizmusaival, széles körben elfogadott. Itt létrehoztunk egy májfibrózisos alkoholmentes steatohepatitis (NASH) egérmodelljét magas zsírtartalmú, magas szénhidráttartalmú étrend (HFHC) felhasználásával, és transzkriptóm mikroarray segítségével elemeztük a lehetséges patogenezist.

Mód

Ötven egeret osztályoztunk tömeg szerint, és véletlenszerűen felosztottuk a HFHC modell és a kontroll (Con) csoportokra. Tíz egeret feláldoztunk a kísérletek kezdetén, 10 HFHC és Con csoport egerét eutanizáltuk a 20. és 30. hét végén. A következő elemzéseket végeztük: biokémiai elemzés; szövettani értékelés; a máj I típusú kollagén (Col-I), az a-simaizom aktin (a-SMA) és a transzformáló növekedési faktor-β1 (TGF-β1) fehérje és mRNS expressziós szintjének értékelése; és transzkriptikus gén chip elemzés.

Eredmények

Az egyes időpontokban a Con csoporttal összehasonlítva a HFHC modellcsoport egerek testtömege és májnedves súlya szignifikánsan magasabb volt. A 30. héten az alanin-aminotranszferáz (ALT), az aszpartát-aminotranszferáz (AST), az éhomi vércukorszint (FBG) és az éhomi inzulin (FINS) szintje vagy aktivitása, valamint a triglicerid (TG) és a hidroxi-prolin (HYP) tartalma a HFHC modellcsoportban szignifikánsan emelkedett. Súlyos steatosis volt jelen a máj szöveteiben, amelyek a HFHC egerek csoportjából származnak. Jellemzően ketrecszerű szerkezetű és áthidaló képződményeket mutató perisinusoidális fibrózist figyeltek meg az egerek májában a HFHC csoportban. A Col-I, α-SMA és TGF-β1 fehérje és mRNS expresszió szintje a HFHC egerek májszöveteiben az idő múlásával drámaian megnőtt. A Con csoporthoz képest a HFHC csoportban 151 differenciálisan expresszált gén volt, amelyek részt vettek 41 jelátviteli útban.

Következtetések

30 hetes HFHC diétás kezelés után az egerek jelentős májfibrózist, máj steatosist, ballonos degenerációt és gyulladást mutattak. A transzkriptóm mikroarray vizsgálatok alapján a májfibrózist magában foglaló kísérleti NASH, amely potenciálisan drámai módon megváltozott ECM-receptor interakcióhoz, Toll-szerű receptor szignálhoz és más jelátviteli utakhoz kapcsolódhat.

Főbb pontok

A fibrotikus betegségek előfordulási gyakorisága magas, és nincsenek ideális terápiás gyógyszerek vagy ideális állatmodellek, amelyek segítenék a gyógyszerfejlesztést.

Az egerek magas zsírtartalmú, magas cukortartalmú étrendjének 30 héten át történő táplálásával sikeresen megalapozták az alkoholmentes zsíros hepatitis fibrózis egér modelljét.

Ennek a modellegérnek a máját genetikailag elemezték és átvilágították a lehetséges patogenezis előrejelzése érdekében.

Bevezetés

A nem alkoholos zsírmájbetegség (NAFLD) világszerte gyakori krónikus májbetegséggé vált. A NAFLD betegségspektruma magában foglalja az alkoholmentes egyszerű zsírmájat (NAFL), az alkoholmentes steatohepatitist (NASH), a zsíros májfibrózist és a májcirrhózist [1]. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a májfibrózis a legfontosabb prediktív mutató, amely befolyásolja a NAFLD prognózisát, és a fibrotikus stádium szintén szorosan összefügg a hosszú távú teljes halálozással, a májtranszplantációval és a májjal kapcsolatos eseményekkel [2].

Célunk egy olyan NASH-modell kidolgozása, amely jelentős májfibrózt generál nem kombinált étrend által kiváltott, nem genetikailag módosított egerekben.

Anyagok és metódusok

Anyagok

Állatok

Ötven hetes, vad típusú, hím C57BL/6 SPF egeret 20–22 g testtömeggel vásároltunk a Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.-től, és gáttal védett állatban tartottuk, modelleztük és megfigyeltük őket. szoba a Sanghaji Hagyományos Kínai Orvostudományi Egyetem állatkutató központjában. A modellalapítás során a kísérleti állatok szabad hozzáférést kaptak élelemhez és vízhez (SYXK (Sanghaj) 2014–0008).

A HFHC modellcsoport étrendje 58 kcal% zsír/szacharóz Surwit Diet volt (D12331, tételszám: 17082101A10, Research Diets, USA), a kontroll (Con) csoport étrendje pedig 11 kcal% zsír/kukoricakeményítő Surwit Diet (D12328, tételszám: 17100212A4, Research Diets, USA). A fruktózt és a szacharózt (F0001/S0001) a Trophic Animal Feed High-Tech Co., Ltd.-től (Kína) vásároltuk.

Mód

Állatcsoportosítás és modellalapítás

Minden állatkísérleti protokollt a Sanghaji Hagyományos Kínai Orvostudományi Egyetem állatkísérleti etikai bizottsága hagyott jóvá. A C57Bl/6 egereket a Sanghaji Hagyományos Kínai Orvostudományi Egyetem állatkutató központjában helyezték el. 1 hét akklimatizáció után az egereket véletlenszerűen felosztották a Con csoportba (n = 30) és a HFHC modellcsoport (n = 20) testtömegük szerint. A HFHC modellcsoportba tartozó egerek szabad hozzáférést kaptak magas zsírtartalmú (58% kcal zsír, 25% kcal szénhidrát és 17% kcal fehérje) és magas szénhidráttartalmú (ivóvíz: 42 g/l, 55% fruktóz és 45%) szacharóz) diéta, és az egereket egyenlően osztották 20 (HFHC 20w) és 30 hetes (HFHC 30w) időponthoz, mindegyik időpontban 10 egérrel. A Con csoportba tartozó egereknek megfelelő alacsony zsírtartalmú étrendet (10,5% zsír, 73,1% kcal szénhidrát és 16,4% kcal fehérje) és normál ivóvizet tápláltak; ezeket az egereket szintén egyenlően osztottuk 0 (Con 0w), 20 (Con 20w) és 30 hetes (Con 30w) időpontokra, mindegyik időpontban 10 egérrel.

Mintagyűjtés

A 0., 20. és 30. hét végén az egereket 12 órán át éheztettük, és 2% pentobarbitál-nátriummal 3 ml/kg dózisban altattuk intraperitoneális injekcióval. A szemgolyókat eltávolítottuk, és mindegyik egérből 1 ml vért gyűjtöttünk. A májszövet egy részét ugyanabból a lebenyből extraháltuk és helyeztük mindegyik egérben, és 10% semleges pufferelt formalin oldatban rögzítettük.

Biokémiai elemzés

1) Máj enzimatikus változások: A szérum alanin-aminotranszferázt (ALT) és a szérum aszpartát-aminotranszferázt (AST) ALT és AST vizsgálati készletekkel (tételszám 20180628, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kína) mértük. 2) Glükóz-anyagcsere: 12 órás éhezés után körülbelül 3 μl vért gyűjtöttünk a farokvénából, és az éhomi vércukorszintet (FBG) Roche vércukorszintmérővel (Roche diagnostic GmbH, Németország) mértük. Az éhomi inzulin (FINS) szintjét az egyes csoportok egereinek szérumában enzimhez kapcsolt immunszorbens assay (ELISA) készlet (Ultra Sensitive Mouse Insulin ELISA Kit, tételszám: 90080, Crystal Chem, USA) alkalmazásával mértük. A homeosztatikus modell értékelése - inzulinrezisztencia (HOMA-IR) indexet a következő képlettel számoltuk: FBG (mM) x FIN (IU/L)/22,5. 4) A máj triglicerid (TG) tartalmát készlet segítségével mértük (tételszám: 2018080029, Dong’ou Diagnostic Products Co. Ltd., Zhejiang, Kína). 5) A máj hidroxiprolin (HYP) tartalmát HYP assay kit alkalmazásával mértük (tételszám: 20180630, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kína).

Hematoxilin és eozin (HE) és Sirius vörös festés

A rögzített májszövetet dehidratálták és beágyazták szövetfeldolgozó (Leica ASP300) és paraffinbeágyazó állomás (Leica EG1160) segítségével. Ezután a metszeteket HE festési készlet (20180530 tételszám, Nanjing Jiancheng Bioengineering) és egy Sirius piros festékkészlet (20180528 tételszám, Nanjing Jiancheng Bioengineering) segítségével festettük.

Olajvörös O festés

A májszövetet folyékony nitrogénben rögzítettük, ornitin-karbamoil-transzferáz (OCT) táptalajba ágyazottuk és -20 ° C-on 10 μm vastagságban metszettük. A metszeteket olajvörös O festő készlet segítségével festették (tételszám: 20180528, Nanjing Jiancheng Bioengineering).

Western blot elemzés

A következő fehérjéket megcélzó antitesteket használtunk ebben a vizsgálatban: α-simaizom aktin (α-SMA, ab5694, 1: 1000); máj I. típusú kollagén (Col-I, ab34710, 1: 1000); és transzformáljuk a β1 növekedési faktort (TGF-p1, Abcam, 1: 1000). Belső kontrollként gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH, proteintech, 10 494–1-AP, 1: 10000) fehérje expressziót alkalmaztunk.

Immunhisztokémia (IHC)

A mintákat először anti-α-SMA antitestben inkubáltuk 1: 100 hígításban (α-SMA, 1: 100, katalógusszám: ab5694, USA) egy éjszakán át 4 ° C-on, majd inkubáltuk primer antitesttel 1 hígításban.: 250. Néhány májmetszetet szintén anti-Col-I antitesttel (Col-I, Abcam, 1: 100, ab34710, USA) festettünk ugyanezzel a módszerrel.

Fordított transzkripciós polimeráz láncreakció (RT-PCR)

RNS extrakció: Az RNS-t egy UNIQ-10 oszlopos Trizol teljes RNS extrakciós készlet alkalmazásával extraháltuk (katalógusszám: E928KA9723, Sangon Biotech, Shanghai). A PCR-termékek relatív mennyiségi (RQ) értékeit elemzésnek vetettük alá △ △ CT módszerrel a Col-1, α-SMA, TGF-β1, Col-4 és Smad3 mRNS expressziós szintjének értékelésére.

Könyvtár előkészítése és az Illumina HiSeq X ten szekvenálás

A könyvtárakat 200-300 bp-os cDNS-fragmensekhez választottuk ki 2% -os alacsony tartományú ultra-agarózon, majd PCR-amplifikációt végeztünk Phusion DNS-polimeráz (NEB) alkalmazásával 15 PCR-ciklusig. A TBS380 fluorométerrel végzett kvantálás után a páros végű RNS-szekvencia könyvtárat egy Illumina HiSeq X Ten szekvenáló rendszerrel (2 × 150 bp olvasási hosszúsággal) szekvenáltuk. Az adatokat az ingyenes online Majorbio I-Sanger Cloud Platform (www.i-sanger.com) segítségével elemeztük.

Statisztikai analízis

Az adatbázis adatainak statisztikai elemzését SPSS 22.0 szoftverrel végeztük Mac OS rendszerhez. A statisztikai leírásban szereplő mérési adatokat S jelöli, és a számlálási adatokra utalnak. Amikor a variancia normalitása és homogenitása teljesült, t tesztet alkalmaztunk a két csoport összehasonlítására. A hierarchikus csoportosítási adatok összehasonlítását Radit analízissel számoltuk.

Eredmények

Az élelmiszer- és vízbevitel, a testtömeg és a máj nedves súlyszintjének változásai az egyes csoportok között

A máj megjelenése az egyes csoportok egereiben

A Con csoport egereinek májja sötétvörös és puha volt. A HFHC csoportba tartozó egerek májai különböző fokú sárgát mutattak különböző időpontokban, teltnek és tompának tűntek; a szakaszok zsírosak voltak, és a textúra kemény lett. 30. héten a HFHC egerek néhány máján sárgásfehér gócos zsírlerakódás volt a májukban (1a. Ábra).

Az átlagos táplálékbevitel, a vízfogyasztás és a máj nedves tömegének változásai

A kísérlet során egyetlen egér sem halt meg. Az egerek testtömege minden csoportban fokozatosan növekedett az idő múlásával (1b. Ábra). 20. héten a testtömeg és a máj nedves súlya a HFHC csoportban jelentősen megnőtt (P 0,05) (1d-f. Ábra).

Enzimológia és glükóz metabolizmus állapota minden csoportban

Az ALT és az AST aktivitásának változásai az egyes csoportokban

20. héten a HFHC csoport egerekben a szérum ALT és AST aktivitása szignifikánsan megemelkedett (P 2. ábra

Az FBG, a FINS és a HOMA-IR változásai az egyes csoportokban

A 20 W-os Con csoportos egerekhez képest a 20 W-os HFHC-csoportos egerek FBG- és FINS-szintje szignifikánsan magasabb volt (P 3. ábra

H&E festés

Fénymikroszkóp alatt a májszövet H&E festése azt mutatta, hogy a máj steatosis az egész máj lobuláját érintette, jelentős gyulladásos sejt beszivárgással és szétszórt nekrózissal. A 30 W-os HFHC egerek a májsejtekben és a hepatocytákban fellépő gyulladásos gócok ballonos degenerációját mutatták. A NAFLD aktivitási pontszámok (NAS) 4 és 8 között mozogtak, amelyek közül 80% magasabb volt, mint 5, megfelelve a NASH diagnosztikai kritériumoknak, és 40% közel 8-hoz (3a. És d. Ábra).

Olajvörös O festés

Olajvörös O festés azt mutatta, hogy mind a makrovezikuláris, mind a mikrovezikuláris steatosis jelen volt a HFHC csoportba tartozó egerek májszöveteiben 20 W-nál, 33-66% között. A HFHC-csoport májszövetében az olajvörös O-festés területe, sűrűsége és intenzitása az idő múlásával fokozatosan nőtt. 30. héten súlyos makrovesicularis és microvesicularis steatosis volt jelen a HFHC csoport májszöveteiben, 66 és 99% között mozogva (3b. Ábra).

Kollagénlerakódás és májstellátum sejt (HSC) aktivációs állapota a májszövetben az egyes csoportok egereitől

HYP tartalom

A máj HYP tartalma a HFHC csoportban fokozatosan növekedett az idő múlásával. Összehasonlítva a Con csoportban 20W-nál, a HFHC csoport egerekben a máj HYP-tartalma 20w-nál jelentősen megnőtt (P 4. ábra

Sirius vörös festés

Fénymikroszkóp alatt a májszövet Sirius vörös festése azt mutatta, hogy a 20. héten a periszinoidoidális tér fibrózisában csillag alakban volt jelen a HFHC egérmáj, és a fibrózis szakasza az F1-F2 tartományban volt, többségüknél (60 %) az F2 szakaszban. 30. héten a májban jelentős perisinusoidális fibrózis volt, ketrecszerű struktúrák és masszív rostos kötőszöveti hiperplázia volt jelen, néhány áthidaló képződménnyel. A szemikvantitatív elemzés azt mutatta, hogy a 30. héten a HFHC csoportban a kollagénszint szignifikánsan magasabb volt, mint a Con csoportban (P 5. ábra

A Col-1 és az α-SMA IHC-je az egyes csoportokban az egérmájban

Ez az α-SMA-pozitív festés szignifikánsan fokozódott a fibrotikus májszeptumban a HFHC csoportban 20 és 30 w-on, és főleg a vastag és sűrű fibrotikus septumban helyezkedett el. A pozitív festési terület idővel nőtt. Hasonlóképpen, a Col-I pozitív festés csak a Con csoport véredényfalaiban volt 0w-nál. Ez a Col-I pozitív festés szignifikánsan fokozódott a fibrotikus májszeptumban a HFHC csoportban 20 és 30 W-nál, és főleg a perisinusoidalis hepatocita membránokban és a fibrotikus septumban helyezkedett el. A pozitív festési terület idővel megnőtt (5b. Ábra).

Col-I, Col-4, α-SMA, TGF-β1 és Smad3 mRNS expressziós szintek az egerekben minden csoportban

Összehasonlítva a Con csoport májaival 0W-nál, a Col-I, TGF-β1 és α-SMA mRNS expressziós szintek a HFHC csoport máiban 20W-nál jelentősen megnőttek (P 6. ábra

Differenciálisan expresszált gének a modellcsoport és a normál csoport között

151 különbözőképpen expresszált gén volt, Log2FC ≥ 2 és P értékekkel. 1. táblázat: Differenciálisan felülszabályozott gének voltak a modellcsoportban és a kontroll csoportban, ahol a Log2FC ≥ 2 és P

A modellcsoport és a normál csoport között differenciáltan expresszált génekhez kapcsolódó jelszabályozott utak

A modellcsoport és a normál csoport között a Log1FC-értékek szerint ≥2-szeres változással rendelkező, 151 differenciálisan expresszált gént KEGG PATHWAY analízissel elemeztük R szkript segítségével. Amikor a javított P érték (P korrekció) volt a 3. táblázat: A modellcsoport és a kontrollcsoport között differenciáltan expresszált génekben azonosított KEGG jelátviteli utak

Vita

A NAFLD világszerte gyakori krónikus májbetegséggé vált, és betegségspektruma magában foglalja a NAFL-t, a NASH-t, a zsíros májfibrózist és a májcirrhosist. Jelenleg a NAFLD a nyugati országok lakosságának 30% -át, Kínában pedig 15–40% -át érinti. Az elhízott egyének több mint 50% -ának van NAFLD-je, és a súlyosan elhízott NASH-betegek 30–42% -ának jelentős májfibrózisa [1]. Egy nemrégiben végzett tanulmány kimutatta, hogy a tartós májkárosodás a májfibrózisra és a májcirrhosissá alakul a NASH-betegek kb. 40% -ában. Egy évtizeden belül a NASH-betegek nagy populációja magas zsírfibrózis és májcirrózis előfordulásához vezethet. Hosszú távú nyomonkövetési vizsgálatok kimutatták, hogy a májfibrózis a legfontosabb prediktív mutató, amely befolyásolja a NAFLD prognózisát [4, 5].

A fruktóz és a szacharóz kombinációja biztosítja a normál vízfelvételt a kísérleti állatokban.

A jelenlegi, főként elfogadott kutatási modellek szisztematikus elemzése, gondos összehasonlítása és mélyreható tanulmányozása után óvatosan úgy döntöttünk, hogy az egereket magas zsírtartalmú (különösen TFA-tartalmú) étrend mellett magas mennyiségű fruktóz és szacharóz takarmányozásával végzik. Hepatológia [3]. E tanulmány alapján különböző időpontokat tűztünk ki, meghosszabbítottuk a modell létrehozásának időtartamát 20 és 30 hétre. Fontos, hogy dinamikusan megfigyeltük ezen egerek modelljének kóros jellemzőit, beleértve, de nem kizárólag, a máj steatosisát, a gyulladást és a kollagén lerakódását. Így létrehoztunk egy ideális modellt, amely jobban összefoglalja a NASH-t májfibrózissal, és tovább hozzájárul a terápiás gyógyszerhatékonyság értékeléséhez a jövőben.

Ennek a májfibrózisos NASH egérmodellnek a sikeres felépítésén alapulva, amely utánozza a betegek kórképét és tüneteit, annak érdekében, hogy jobban bemutassuk ennek a modellnek a kórokozó mechanizmusát és megalapozzuk az új gyógyszerfejlesztést, összehasonlítottuk a génexpressziós szinteket a kontrollcsoport a modellcsoporttal. Elemzéssel 151 olyan gént találtunk, amelyek Log2FC különbsége többszöröse, mint 2 és P

Következtetések

Összefoglalva, az itt leírt NASH és májfibrózis egérmodellje, amelyet 30 hetes, magas zsírtartalmú (telített zsír + TFA-k) és magas szénhidráttartalmú (fruktóz + szacharóz) diéta indukált, szorosan utánozza a májfibrózishoz társuló NASH-t folyamat a betegeknél. Ezeknek a kóros elváltozásoknak a magas előfordulása, a modell létrehozásának magas sikerességi aránya és a nulla mortalitási ráta teszi ezt a modellt alkalmassá a májfibrózis alapmechanizmusainak vizsgálatára a NASH-ban és a gyógyszer hatékonyságának értékelésére.

Az adatok és anyagok rendelkezésre állása

A tanulmány során keletkezett vagy elemzett összes adatot ez a közzétett cikk tartalmazza.