A magas zsírtartalmú étrendbevitel modulálja az anya bélének terhességhez való alkalmazkodását, és placenta hypoxiát és a magzati bél károsodását eredményezi.

Absztrakt

Finanszírozási információk Farncombe Családi Emésztőrendszeri Egészségügyi Kutatóintézet (KMK); Kanadai Egészségkutatási Intézet (CJB); Kanadai Kutatószék Program (MGS, DMS); Kanadai Természettudományi és Mérnöki Kutatási Tanács, Genome Canada (PBM).

1. BEMUTATKOZÁS

Az anyák elhízása és a túlzott terhességi súlygyarapodás kulcsfontosságú előrejelzője a gyermekkori elhízásnak és a metabolikus szövődményeknek felnőttkorban. Az anya és az utód elhízása közötti kapcsolatot mind klinikai, mind kísérleti körülmények között alaposan megvizsgálták (Gluckman és Hanson, 2007). A telített zsírok túlzott bevitele és az elhízás a terhességi szövődmények, köztük a preeclampsia fokozott kockázatával jár együtt (Triunfo és Lanzone, 2014), és a magzat túlnövekedését és a placenta fejlődésének megváltozását eredményezheti (Wallace és mtsai, 2012). Bár állatkísérletek kimutatták, hogy az anyai zsírtartalmú étrend (HFD) által kiváltott elhízás szorosan összefügg az utódok anyagcsere betegségével (Morris és Chen, 2009; Howie és mtsai, 2009; Elahi és mtsai, 2009), az anyai A HFD bevitele, az elhízás vagy a túlzott terhességi súlygyarapodás az utódok metabolikus diszfunkcióját okozhatja, még mindig nem világos.

A bélmikrobák és a gazdaszervezet anyagcseréje közötti kapcsolat az elhízás kockázatát közvetítő legtöbb vizsgált tényezővé vált (Holmes et al., 2012), és bebizonyosodott, hogy a terhesség elmozdítja a bélben kolonizáló baktériumok számát és típusát (Koren et al., 2012). Ezekről az elmozdulásokról azt javasolták, hogy hozzájáruljanak az anya metabolikus alkalmazkodásához a terhességhez, és közvetíthetik a terhesség kimenetelét (Koren et al., 2012; Goltsman et al., 2018). Mi és mások megmutattuk, hogy ezeket a baktériumeltolódásokat az anyai HFD és az elhízás tovább módosítja (Collado és mtsai., 2008; Santacruz és mtsai., 2010; Gohir és mtsai., 2015), de a mikrobák bőségét összefüggő jelzőmolekulák a terhesség alatti gyulladásos és anyagcsere-válaszokra adott válaszokat nem vizsgálták alaposan. A legfrissebb adatok azt mutatják, hogy az anyai propionát negatívan kapcsolódik az anya leptinjéhez és a csecsemő súlyának méréséhez (Priyadarshini et al., 2014), és arra utalnak, hogy a terhes bél mikrobiotájának elmozdulása a rövid láncú zsírsavtermelés (SCFA) változásain keresztül befolyásolhatja az anyagcserét. Az SCFA-k befolyásolják a bélgát funkcióját (Burger-van Paassen et al., 2009). A hím magas zsírtartalmú táplált egerek bél mikrobiotájának változásai a megnövekedett keringő bakteriális lipopoliszacharidokkal (LPS) társulnak, ami metabolikus endotoxémiát indukál (Cani et al., 2008). A terhesség összefüggésében az anyai metabolikus endotoxémia hozzájárulhat a placenta gyulladásához az anyai HFD és az elhízás következtében (Li et al., 2013; Pantham et al., 2015; Salati et al., 2018).

Ebben a tanulmányban azt a célt tűztük ki célul, hogy meghatározzuk a terhesség előtti és alatti HFD bevitelnek az anyai bél mikrobiotájára gyakorolt hatását és annak kapcsolatát a bélgyulladással és a gát integritásával, valamint megvizsgáltuk, hogy az anya endotoxémiája összefügg-e a placenta metabolikus stresszével és gyulladásával, valamint a magzat károsodásával. bélfejlődés.

2 MÓDSZER

2.1 Etikai jóváhagyás

Ennek a vizsgálatnak az összes állati eljárását a McMaster Egyetem Állatkutatási Etikai Testülete (Animal Utilization Protocol 12-10-38) hagyta jóvá a Kanadai Állatgondozási Tanács irányelveinek és a folyóirat etikai alapelveinek megfelelően (Grundy, 2015).

2.2 Állatmodell

2.3 Anyai mikrobiota profilozás

DNS-extrakció és 16S rRNS-gén szekvenálás

A genomi DNS-t a székletmintákból extraháltuk a korábban leírtak szerint (Whelan et al., 2014), néhány módosítással: 0,2 g székletanyagot alkalmaztunk, és további mechanikus lízis lépést vezettünk be 0,2 g 2,8 mm-es kerámiagyöngyök felhasználásával. Ezt követően a 16S rRNS gén variábilis3 (V3) régiójának PCR-amplifikációját az egyes mintákból kivont DNS-en végeztük, egymástól függetlenül, korábban leírt módszerekkel (Bartram és mtsai., 2011; Whelan és mtsai, 2014). Minden reakció 5 pmol primert, 200 mmol dNTP-t, 1,5 μl50 mM MgCl2,2 μl 10 mg/ml szarvasmarha szérum albumint tartalmazott (transzilluminátorral besugároztuk a szennyező DNS eltávolítása érdekében) és 0,25 μl Taq polimerázt (Life Technologies, Kanada) a teljes reakcióhoz. térfogata 50μl. A 341F és 518R primereket úgy módosítottuk, hogy az illumina technológiára specifikus adapter szekvenciákat is beépítsünk, és 6 bázisú pár vonalkódokat alkalmaztunk a minták korábban leírt multiplexeléséhez. A PCR-amplifikáció 16S DNS-termékeit ezután az Illumina MiSeq platform (2 × 150 bp) felhasználásával szekvenáltuk a Farncombe Genomics Facility-ben (McMaster University, Hamilton ON, Kanada).

A szekvenálás feldolgozása és elemzése

Az eredményül kapott FASTQ fájlokat egyedi házon belüli feldolgozással dolgoztuk fel, ahogyan azt korábban leírtuk (Whelan et al., 2014). Röviden, a 16S rRNS V3 régiójának hosszát meghaladó leolvasásokat levágtuk (cutadapt, RRID: SCR_011841), a páros végű olvasásokat összehangoltuk (PANDAseq, RRID: SCR_002705), az operatív taxonómiai egységeket (OTU) 97% hasonlóság alapján csoportosítottuk Rengeteg TOT +, SCR_016527). A taxonómiát az RDP osztályozóhoz (Ribosomal Database Project, RRID: SCR_006633) rendelték hozzá a Greengenes referencia adatbázis 2011. február 4-i kiadásával (Greengenes, RRID: SCR_002830). Bármely OTU-t, amelyet nem rendeltek hozzá a bakteriális doménhez, megsemmisítették, csakúgy, mint bármely OTU-t, amelyhez csak 1 szekvenciát rendeltek. Ez a feldolgozás összesen 11 027 452 olvasást (mintánként átlagosan 137 843 olvasást; tartomány: 59 233-249 890) és 9237 OTU-t eredményezett.

A taxonómiai összefoglalókat a Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME; RRID: SCR_008249) felhasználásával készítettük. A béta-diverzitás méréseit a Bray Curtis-féle disszimilaritás-metrika (phyloseq, RRID: SCR_013080) segítségével számoltuk ki R-ben (R Statisztikai Számítástechnikai Projekt, RRID: SCR_001905), és a csoportok közötti egész közösségbeli különbségeket teszteltük permutációs többváltozós varianciaanalízissel (PERMANOVA) az adonis parancsban (vegán, RRID: SCR_011950). Ezeket az eredményeket a Principal Coordinate Analysis (PCoA) koordinálásával jelenítettük meg (ggplot2, RRID: SCR_014601). A csoportok között szignifikánsan különbözõ nemzetségeket (a kiigazítás utáni α = 0,01) a Benjamini-Hochberg többszörös vizsgálati kiigazítási eljárással számoltuk (DESeq2, RRID: SCR_015687).

2.4 Az anyai bél rövid láncú zsírsavainak mennyiségi meghatározása

Az SCFA szinteket az anyai vakbélmintákban mértük a McMaster Regionális Tömegspektrometriai Központ (MR-CMS) segítségével. Tömegekvivalens mennyiségű 3,7% HCl-ot, 10 μl10 ul belső standardot és 500 μl dietil-étert adunk mindegyik vakbélmintához, és 15 percig vortexeljük. Örvénykeverés után 400 μl dietil-éteres székletkivonatot vittünk egy tiszta 1,5 ml-es Eppendorf-csőbe. Egy betétet tartalmazó kromatográfiás injekciós üvegben 20 μl N-terc-butil-dimetil-szilil-N-metil-trifluor-acetamidot (MTBSTFA) adunk hozzá, majd 60 μl dietil-éteres székletkivonatot adunk hozzá. Az elegyet szobahőmérsékleten 1 órán át inkubáltuk, és GC-MS (Agilent 6890N GC, Agilent 5973N tömegszelektív detektorhoz kapcsolt) alkalmazásával elemeztük.

2.5. RNS extrakció és cDNS szintézis

2.6. Kvantitatív PCR

2,7 NF.κB aktivitás és Western Blot analízis

2.8 Az anyai bélgát integritása

Az egerek külön csoportjában fluoreszcein-izotiocianát-dextrán (FITC-dextrán) vizsgálatot alkalmaztunk az in vivo bélpermeabilitás mérésére az anyai bélgát integritásának felmérésére a terhesség előtt és alatt. Nem vemhes és vemhes (E18.5) egerekben a farokvénák vérzésével alapvért vettünk. A plazmát elkülönítettük és 4 ° C-on tároltuk közvetlen fénnyel szemben, az elemzésig. Minden egérnek ‥ μl 80 mg/ml FITC-jelölt dextránt (molekulatömeg 4kDa; Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA) adtunk be szájon át. 4 óra múlva a vérzés után egy második, vérzéses utáni vérmintát vettünk, és plazmát izoláltunk. A plazma fluoreszcencia intenzitását lemezolvasón (BioTek®, Oakville, Kanada) mértük 530 nM emisszióval és gerjesztéssel 485 nM mellett. A bélgát integritását úgy számszerűsítettük, hogy az egyes gátakban levontuk a kiindulási fluoreszcencia értékeket a szoptatás utáni fluoreszcencia értékekből, és relatív fluoreszcencia egységekben (RFU) fejeztük ki.

2.9 Biokémiai vizsgálatok

Házon belüli kolorimetriás riporter biológiai vizsgálatot alkalmaztunk az NF-κB aktivációjának számszerűsítésére a TLR-4 mintázatfelismerő receptorral az LPS-re adott válaszként (Verschoor et al., 2015). Röviden, egy LPS-re reagáló riporter sejtvonalat állítottunk elő a pNifty2-SEAP plazmid átmeneti transzfektálásával egy kereskedelemben kapható HEK293 sejtvonalba (RRID: CVCL_Y406), amely expresszál TLR4, MD2 és CD14 (Invivogen, CA, USA). A sejteket lyukanként 4 × 103 arányban oltottuk be egy 96 lyukú lemezen, komplett DMEM-ben 24 órán át. A szérummintákat 1: 5 arányban hígítottuk foszfátpuffer-sóoldatban (PBS), majd 1: 1 arányban steril vízben, és a hőmérsékletet 75 ° C-on 5 percig inaktiváltuk. A teljes DMEM táptalajt eltávolítottuk a hő-inaktivált plazma hozzáadása előtt a HEK Blue Detection (HBD) táptalajban (Invivogen, CA, USA); 10 μl mintát és 190 μl HBD táptalajt adunk a megfelelő üregekbe. Az olvasásokat 630 nm-en végeztük, 72 órával a stimuláció után, és a háttérszinteket levontuk a relatív abszorbancia egységekből. A tisztított LPS különböző dózisainak felhasználásával előállított standard görbéket használtuk az LPS relatív mennyiségének kiszámításához a szérumban.

TNF és IL-6

Az anyai szérum TNF és IL-6 szintjét Milliplex Map Mouse Cytokine Magnetic Bead Panel (EMB Millipore, MCYTOMAG-70K, Darmstadt, Németország) segítségével mértük, amely a Luminex xMAP detektálási módszert alkalmazta. A protokollt a gyártó utasításainak megfelelően követték.

2.10 Immunhisztokémia

2.11 Nanostring

A placenta minták egy részében Dr. Ask (McMaster University) által tervezett egyedi nCounter Reporter CodeSet-et használták a placenta génexpressziójának elemzésére a NanoString nCounter génexpressziós rendszer segítségével (3. táblázat). Röviden: 100 ng teljes RNS-t inkubáltunk egy éjszakán át 65 ° C-on nCounter Reporter CodeSet, Capture ProbeSet és hibridizációs pufferrel. A hibridizációt követően a mintákat az nCounter Prep-station segítségével dolgoztuk fel, és az nSolver Analysis Software 2.5-t használtuk a nyers NanoString adatok normalizálására 6 házvezetőnő számára: UBC, TUBA1A, HPRT, IPO8, GusB és β-aktin.