Az anya oldható rosttartalmú étrendje terhesség alatt megváltoztatja a bél mikrobiotáját, javítja a növekedési teljesítményt és csökkenti a malacok béláteresztő képességét

ABSZTRAKT

FONTOSSÁG Bár az étrendben oldódó rostoknak a bél mikrobiotájára gyakorolt közvetlen hatásait alaposan tanulmányozták, az anya táplálkozásának közvetettebb, kizárólag terhesség alatti hatásai az utódok belének fejlődésére mindeddig nagyrészt nem voltak feltárva. Adataink azt mutatják, hogy az anya oldható rosttartalmú étrendje a terhesség alatt függetlenül összefügg a bél mikrobiota összetételének és a szoptató malacok anyagcseréjének változásával. Ezek a megállapítások közvetlen hatással vannak a terhességi étrendi ajánlások finomítására. Ezenkívül az anyai oldható rosttartalmú étrend csökkenti a bél áteresztőképességét és megakadályozza a bélgyulladást és a szoptató malacok túlzott szisztémás immunválaszát. Ezért a szoptató malacok fokozottan ellenálltak a betegségekkel szemben, csökkent a hasmenés és nőtt a súlygyarapodás. Emellett az anyai oldható rosttartalmú étrendre adott válaszként a bél mikrobiotájában bekövetkező változások szintén közvetlen összefüggésben lehetnek az utódok növekedésével és bélfejlődésével.

BEVEZETÉS

Az anyák alultápláltságának terhesség alatti káros hatásai az utódokra egyre inkább elismerik (1). Az egészség és betegség fejlődési eredete (DOHaD) elmélete szerint a terhesség alatti alultápláltság megzavarhatja a normális fejlődést és hozzájárulhat a felnőttkori betegséghez azáltal, hogy állandó hatással van a fejlődő utódok szerkezetére, működésére és anyagcseréjére (2). A rágcsálók és az emberek bizonyítékai alátámasztják azt a tudományos feltételezést, miszerint az anya magas zsírtartalmú vagy magas fehérjetartalmú étrendjének való kitettség terhesség alatt hosszan tartó anyagcsere-aláírást eredményez a csecsemő veleszületett immunrendszerén és a fiatalkori bél mikrobiotáján, amely hajlamosítja az utódokat az elhízásra és az anyagcserére. betegségek (3, 4), míg az anyai étkezési rostbevitel megvédi az utódokat a magas zsírtartalmú étrend okozta elhízástól és más anyagcsere-betegségektől (5, 6). Az anya oldható rosttartalmú étrendjének terhesség alatti hatása a növekedési tulajdonságokra és a fejlődő bélre azonban még mindig nem feltárt.

A belekről ismert, hogy döntő fontosságú az egész test egészsége szempontjából, de a korai életprogramozás szempontjából még mindig viszonylag fel nem tárt szerv. A bélmikrobiota az élet korai szakaszában megszerezhető, és több szerepet játszik a gazdaszervezet növekedésében és egészségében, beleértve az étrendből történő energia kinyerését, a bélgát funkcióját és az immunrendszer érését, valamint a növekedési teljesítményt (7, 8). Egyre több bizonyíték arra utal, hogy a bél mikrobiota szukcessziójának korai változásainak állandó metabolikus következményei vannak (9). Ezért az optimális mikrobiota összetétel kialakítása a korai életszakaszban döntő fontosságú az újszülöttek növekedése és anyagcsere-egészsége szempontjából.

A feltörekvő adatok rámutatnak a bélhám fontosságára is, mint a felnőttek és újszülöttek egészségének szabályozójaként (10). A fokozott bélpermeabilitás számos, alacsony fokú gyulladással járó rendellenességben vesz részt, beleértve az elhízást és az irritábilis bél szindrómát gyermekeknél (11, 12). Feltételezzük, hogy a javasolt mechanizmus magában foglalja a bél mikrobiota komponenseinek, például a bakteriális lipopoliszacharidnak (LPS) a bélgáton keresztül a keringésbe történő fokozott átjutását. Ezt követően a bakteriális LPS megnövekedett keringési koncentrációja metabolikus endotoxémiához vezethet, amely a gyulladás lehetséges közvetítője (13). A zonulin olyan közvetítő, amelyről ismert, hogy szabályozza a bélpermeabilitást az intracelluláris feszes csomópontok modulálásával. A keringő zonulint a bélpermeabilitás potenciális markerként alkalmazták (14). Az anyai tápanyagok, például az n-3 többszörösen telítetlen zsírsavak, összefüggésbe hozhatók az utódok bélpermeabilitásának változásával (15). Ezenkívül kimutatták, hogy a bél mikrobiotájában a dysbiosis növeli a bél permeabilitását (16).

Bár az élelmi rostoknak a bél mikrobiota összetételére gyakorolt közvetlen hatásait alaposan tanulmányozták, az anya táplálkozásának közvetettebb, kizárólag a terhesség alatti hatásai az utódok belének fejlődésére mindeddig nagyrészt nem voltak feltárva. Ezért feltételeztük, hogy az előre zselatinizált viaszos kukoricakeményítő és a guargumi (SF) kombinált oldható rostanyagainak bevonása a terhességi étrendbe figyelemre méltó hatással lehet az utód növekedési tulajdonságaira, a bél mikrobiotájára és a bélműködés fejlődésére. Ennek megfelelően a jelen tanulmányban megvizsgáltuk az anyai oldható rosttartalmú étrend terhesség alatti hatásait a szoptató malacok növekedési teljesítményére, hasmenés előfordulására, a bél mikrobiota összetételére és anyagcseréjére, valamint a bélpermeabilitására és a gyulladás állapotára.

EREDMÉNYEK

Az SF-vel táplált kocák szoptató malacainál nőtt a növekedési ütem és csökkent a hasmenés. A malacok súlygyarapodását és hasmenésének előfordulását a teljes laktációs periódus alatt (21 nap) értékeltük. Bár a kezdeti testsúlyban (BW) nem volt szignifikáns különbség (P> 0,05), azt találtuk, hogy a végső BW magasabb volt (P Tekintse meg ezt a táblázatot:

Soron belüli megtekintése
Felugró ablak megtekintése

Az anyai SF étrend terhesség alatti hatása a szoptató malacok növekedési teljesítményére és hasmenési gyakoriságára

Az anyai SF étrend terhesség alatti hatása a 14 napos szoptató malacok plazmahormonjára

A székletbaktériumok taxonómiai profiljai a CONS és SF táplált kocák 14 napos szoptató malacaiban 16S rRNS génszekvenálásból. A szoptató malacokban mind a CON-, mind az SF-vel táplált kocákból származó top 10 phyla (A) és a felső 15 nemzetség (B) relatív bősége. CON1, az első minta a kontroll étrend csoportból; SF1, az első minta a 2,0% -os előzselatinizált viaszos kukoricakeményítő és guargumi étrendből.

LEfSe A 14 napos szoptató malacok széklet baktérium közösségének elemzése a terhesség alatti anyai SF étrend után. CON, kontroll diéta csoport; SF, 2,0% előzselatinizált viaszos kukoricakeményítő és guargumi diéta csoport. LDA, lineáris diszkrimináns elemzés.

A malacok bél mikrobiotájának összetételében a különböző kezelések során bekövetkezett figyelemre méltó változások arra késztettek minket, hogy értékeljük a széklet mikrobiota alfa- és béta-változatosságának mértékét. A széklet baktériumközösség alfa-változatosságának mérései (megfigyelt fajok, Chao1 és Shannon indexek) elhanyagolható különbségeket mutattak a CON- és SF-táplált kocák szoptató malacai között (4A – C. Ábra), míg a béta-változatosság, a fő-koordináta A súlyozott UniFrac távolságon alapuló elemzés (PCoA) kimutatta, hogy a bél mikrobiota nyilvánvaló szegregációt mutatott a szoptató malacokban a CON-vel táplált és az SF-vel táplált kocák között (4D. ábra). Ezenkívül az egyének közötti eltéréseket a CON és SF szoptató malacok egyedei közötti átlagos súlyozott UniFrac távolságok határozták meg, míg az intraindividuális variációkat a párosított CON és SF minták közötti távolság határozta meg. Bár a CON és az SF szoptató malacok között nem volt szignifikáns különbség az egyének közötti eltérésekben, azt tapasztaltuk, hogy a CON és SF közötti intraindividuális eltérés nagyobb volt, mint a CON malacok közötti egyéni eltérés (4E. Ábra), ami azt is megmutatta, hogy a bél mikrobiota szerkezete a szoptató malacokat jelentősen megváltoztatta az anyai SF-stílusú étrend.

A CON- és SF-táplált kocák 14 napos szoptató malacainak székletmikrobiális közösségbeli sokféleségének összehasonlítása a terhesség alatt. (A-tól C-ig) A megfigyelt OTU-k (A), Chao1 (B) és Shannon-index (C) összehasonlítása a vemhesség alatt CON- és SF-táplált kocák 14 napos szoptató malacai között. (D) A kocák bél mikrobiotaszerkezetének pályája a szaporodási ciklus során a súlyozott UniFrac távolság alapján. (E) Az egyének közötti eltéréseket a CON és az SF malacok egyedei közötti átlagos súlyozott UniFrac távolságok alapján határozták meg, míg az intraindividuális variációkat a távolság párosított CON és SF malacok határozták meg. Az adatokat átlagként ± SEM adjuk meg (n = 10). (A-tól D-ig) A kezelés szignifikáns hatása 0,05-es P érték mellett a valerát, az izobutirát és az izovalerát székletében a CON- és SF-táplált kezelések között.

Az anyai SF étrend terhesség alatti hatása a rövid láncú zsírsavakra a széklet (a) és a plazma (b) mintáiban 14 napos szoptató malacokban. Az adatokat átlag ± SEM-ként adjuk meg (n = 10). *, a kezelés hatása, (PA anyai SF étrend csökkenti a bél áteresztőképességét és elősegíti a szoptató malacok bél egészségét. Figyelembe véve a legújabb bizonyítékokat, amelyek arra utalnak, hogy a mikrobiota eredetű butirát a szoros kötésű fehérjék expressziójának modulálásával modulálja a bél gát integritását (25), feltételezte, hogy az anyai SF étrend csökkentheti a szoptató malacok béláteresztő képességét, ezáltal gyengítheti a bél- vagy szisztémás gyulladásos választ. A bélpermeabilitással kapcsolatos három biomarkert mértünk. A 6. ábrán bemutatott eredmények azt mutatják, hogy a zonulin, az endotoxin, a és a diamin-oxidáz szintje szignifikánsan csökkent az SF-vel táplált kocák szoptató malacaiban, összehasonlítva a CON-vel etetett kocákéval. Korábbi tanulmányok szerint a károsodott bélnyálkahártya-integritás növelheti a zonulin és a diamin-oxidáz koncentrációját, és növelheti az endotoxin tartalmát a vérben (14)., 26). Ez arra utal, hogy a terhesség alatti SF diéta csökkenti a bél pe-jét szoptató malacok jól kezelhetősége.

Összefoglalva, adataink azt mutatják, hogy a terhesség alatti anyai SF étrend függetlenül kapcsolódik a bél mikrobiota összetételének és a 14 napos szoptató malacok anyagcseréjének jelentős változásához. Ezek a megállapítások közvetlen hatással vannak a terhességi étrendi ajánlások finomítására. Ezenkívül az anyai SF étrend csökkenti a bél áteresztőképességét és megakadályozza a bélgyulladást és a szoptató malacok túlzott szisztémás immunválaszát. Ezért a szoptató malacok fokozottan ellenálltak a betegségekkel szemben, csökkent a hasmenés és nőtt a súlygyarapodás. Ezenkívül feltételezett összefüggéseket figyeltek meg a nemzetségek és a növekedési tulajdonságok, valamint a bél egészségi állapotának paraméterei között, ami azt jelenti, hogy a bél mikrobiotájában bekövetkezett változások az anyai SF étrendre reagálva szintén közvetlenül korrelálhatnak az utód növekedésével és bélfejlődésével, de további kutatásokra van szükség e potenciális mechanizmusok kezelése érdekében.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Etikai jóváhagyás. Az állatokat érintő összes eljárást a Huazhong Agráregyetem Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága által kiadott, az állatkísérletekre vonatkozó iránymutatásoknak megfelelően hajtották végre, és protokollját ez a bizottság jóváhagyta (engedélyszám HZAUSW-2016-009).

A növekedési teljesítmény és a hasmenés mértékének meghatározása. A malacok testtömegét egyedileg mértük az 1., 7., 14. és 21. napon az ADG meghatározása céljából. Feljegyeztük az egyes malacok egészségi állapotát és mortalitását, és a hasmenés előfordulását vizuálisan értékeltük és értékeltük úgy, hogy az egyes betegek minden nap 0900 és 1600 órakor értékelték a széklet konzisztenciáját képzett megfigyelők, akik megvakultak a kezelésekre a Marquardt et. al. (50). A hasmenés arányát (%) a következőképpen számolták: [hasmenéses malacok teljes száma a kezelés során]/[a kísérleti malacok összes száma × összes megfigyelési nap]) × 100. A hasmenés indexét a széklet pontszámának összegeként számolták ki ( a kísérleti malacok száma × összes megfigyelési nap).

Minta kollekció. A 14. napon minden alomból egy közepes súlyú malacot választottak (összesen 12 malac/kezelés), hogy vér- és ürülékmintákat gyűjtsenek. A malacokból vena jugularis segítségével vérmintákat gyűjtöttek, minimális stressz mellett, heparinizált csövekbe (5 ml). Ezután a vérmintákat 3000 × g és 4 ° C hőmérsékleten 10 percig centrifugálva nyertük, és az elemzésig -80 ° C-on tároltuk. A friss székletmintákat egyenként steril, 20 ml-es centrifuga csövek segítségével (kezelés nélkül) gyűjtöttük a malacoktól, majd az elemzésig -80 ° C-on tároltuk.

A széklet és a plazma rövid láncú zsírsavak elemzése. A kocák székletében és plazmájában a rövid láncú zsírsav (acetát, propionát, butirát és valerát) és az elágazó láncú zsírsav (BCFA) (izobutirát és izovalerát) koncentrációját gázkromatográfiás (GC) módszerrel elemeztük, Chen és mtsai. (51), kisebb módosításokkal. Röviden: körülbelül 1,5 g ürüléket homogenizáltunk először 1,5 ml ionmentes vízben. A mintákat 12 000 x g és 4 ° C hőmérsékleten 10 percig centrifugáltuk. Ezt követően a széklet felülúszóit és a plazmamintákat megsavanyítottuk 25% meta-foszforsavval 1: 5 arányban. 30 perc elteltével 4 ° C-on a mintákat ezután 12 000 x g és 4 ° C hőmérsékleten 10 percig centrifugáltuk. A felülúszó alikvot részét (1 μl) elválasztottuk és gázkromatográfiával (GC 2010; Shimadzu, Japán) analizáltuk, amely CP-Wax 52 CB oszloppal volt felszerelve, 30,0 m és 0,53 mm belső átmérővel (id) (Chrompack, Hollandia). ). Az SCFA-k mennyiségét külső standard görbékkel határoztuk meg 0,5-100 μmol/ml-ig a megfelelő autentikus szerves savakhoz (Fluka, Svájc).

Hormonok, zonulin, endotoxin, diamin-oxidáz és citokinek meghatározása a plazmában és lipokalin-2 a székletben. A széklet homogenizátumait úgy állítottuk elő, hogy a székletet 10% (tömeg/térfogat) foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) oldottuk, és -80 ° C-on tároltuk. A plazma GH, IGF-1, IL-6, IL-10, TNF-α, TGF-β, zonulin és endotoxin és a széklet összes lipokalin-2 koncentrációját sertés enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálati készletek (Bio- Swamp Life Science, Wuhan, Kína), a gyártó utasításainak megfelelően. A plazma diamin-oxidáz aktivitást enzimatikus kinetikus spektrofotometriás módszerrel határoztuk meg a diamin-oxidáz vizsgálati készlet segítségével (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kína). Minden eljárást két példányban hajtottunk végre.

DNS-extrakció, 16S rRNS-gén amplifikáció és Illumina MiSeq szekvenálás. Minden székletmintából 200 mg-ból mikrobiális DNS-t extraháltunk QIAamp Fast DNS széklet minikittel (Qiagen, Németország), a gyártó utasításainak megfelelően. A sikeres DNS-izolálást agarózgél-elektroforézissel választottuk el. A 343F előreindítót (5'-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3 ') és a fordított 806R primert (5'-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3') alkalmaztuk a V3 – V4 hipervariábilis régió amplifikációjához. egy 16S rRNS gén. A PCR-körülmények egy preenaturációs ciklus voltak 94 ° C-on 4 percig, 25 denaturációs ciklus 94 ° C-on 30 másodpercig, anniálás 50 ° C-on 45 másodpercig, megnyúlás 72 ° C-on 30 másodpercig, és egy utolsó poszt-megnyúlási ciklus. 72 ° C-on 5 percig. A PCR termékeket AMPure XP gyöngyökkel (Agencourt) tisztítottuk. Tisztítás után a PCR termékeket használták fel a könyvtárak felépítéséhez, majd páros végű szekvenálást (2 × 250) egy MiSeq platformon (Illumina, USA) a Pekingi Genomikai Intézetben (BGI, Kína).

Statisztikai analízis. Az alom volt a kísérleti egység a növekedési teljesítmény és a hasmenés pontszám adatainak (BW, ADG, hasmenés aránya és hasmenés indexe), a malac pedig a többi index kísérleti egysége. Az adatok normál eloszlását Kolmogorov-Smirnov teszttel igazoltuk az elemzés előtt. A bélpermeabilitással és a gyulladással kapcsolatos adatok, köztük a növekedési teljesítmény, az SCFA-k, a plazma növekedéssel kapcsolatos hormon és a biomarkerek különbségeit Student t teszttel vizsgáltuk (Statistical Analysis System 8.1; Cary, NC). A test 2 tesztet használtuk a hasmenés gyakoriságának tesztelésére. A jelentőséget a csatlakozási szám (ok) P értékén jelentik. A 16S rRNS génszekvencia adatait az Országos Biotechnológiai Információs Központban (NCBI) Sequence Read Archive (SRA) tároltuk SRP149389 csatlakozási szám alatt.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Tudomásul vesszük a Yangxiang részvénytársaság számára a kocák etetési lehetőségeinek biztosítását.

S.J. és J. P. tervezte a kísérleteket, C.C. elvégezte a kísérleteket és megírta a kéziratot, és H.W. és C.X. elemezte az adatokat. Minden szerző jóváhagyta a végleges verzió közzétételét. Minden szerző jóváhagyta a végleges kéziratot.

Ezt a kutatást a Kínai Nemzeti Kulcsfontosságú Kutatási és Fejlesztési Projekt (2017YFD0502004 támogatás), a Kínai Mezőgazdasági Kutatási Rendszer (CARS-36 támogatás), a Hubei Tartományi Agrártudományi és Technológiai Kreatív Csapat Projekt (2007-620. Támogatás) és az Alapvetés támogatta. Kutatási alapok Kína központi egyetemeihez (támogatás: 2662017PY017).