A méhpempő késlelteti a motoros funkcionális károsodást az öregedés során genetikailag heterogén hím egereknél

Nobuaki Okumura

1 Institute for Bee Products and Health Science, Yamada Bee Company, Inc., Okayama 708-0393, Japán; moc.eeb-adamay@0871on (N.O.); moc.eeb-adamay@0431it (T.I.); moc.eeb-adamay@0880tt (T. T.); moc.eeb-adamay@3660hk (K.H.)

Toshihiko Toda

2 Klinikai Sejtbiológiai és Orvostani Tanszék, Chiba University Graduate School of Medicine, Chiba 260-8670, Japán; pj.emoetorp@adot_kih (T. T.); moc.liamg@3ekusuyawazo (Y.O.); [email protected] (K.W.)

Yusuke Ozawa

Kenji Watanabe

Tomoki Ikuta

Tomoki Tatefuji

Ken Hashimoto

Takahiko Shimizu

Társított adatok

Absztrakt

1. Bemutatkozás

Az öregedő társadalmakban világszerte növekszik az időskorúakkal, például motoros rendellenességekkel, metabolikus szindrómával és kognitív hanyatlással küzdő idős emberek száma [1,2,3,4]. Ezek a betegségek közvetlenül kapcsolódnak a romlott életminőséghez (QOL), amely különbséget tesz az élet és az egészséges élettartam között. E problémák megoldása érdekében az étrendi beavatkozások, például az étrend korlátozása, a gyógyszerek és a tápanyagok, várhatóan lassítják az öregedés ütemét és egészséges öregedéshez vezetnek [5,6].

A mézelő méhekben (Apis mellifera) a méhpempő (RJ) meghatározza az epigenetikus változásokat, amelyek különböző sorsokhoz vezetnek a dolgozó méheknél és a hosszú életű méheknél, azonos genotípussal [7,8,9,10]. Az RJ-t az ápoló munkásméhek hypopharyngealis és mandibularis mirigyei termelik. Az RJ hosszú élettartamú táplálkozási táplálék lehet, mivel a mézelő méhlárvák RJ-vel történő kiegészítése méhkirálynővé fejlődést idéz elő, amelynek jellegzetes nagyobb teste és hosszabb élettartama van, mint a dolgozóknak [11]. Ezenkívül az RJ-t és összetevőit más gerinctelenek felhasználásával végzett vizsgálatok is meghosszabbító tényezőként azonosították [12,13,14,15]. Az RJ állítólag meghosszabbítja a C3H/HeJ egerek élettartamát is [16]. Az RJ várhatóan mérsékli az emberek egészséges élettartamát, mivel számoltak róla, hogy számos egészségügyi előnye van, mint például a hosszú élettartam elősegítése, a depresszió, a száraz szem, az elhízás és a szarkopénia elleni tevékenységek állatmodellekben valamint az embereknél is [16,17,18,19,20,21]. Ezért az RJ jelölt anyag az egészséges várható élettartam meghosszabbításához. Az RJ-vel végzett egész életen át tartó kezelés hatása az egészséges élettartamra a normális öregedés során azonban nem teljesen tisztázott.

Úgy tűnik, hogy egyesek anafilaxiás reakción mennek keresztül az RJ-kiegészítést követően. Ennek a kérdésnek a leküzdésére korábban kifejlesztettünk enzimmel kezelt RJ-t (ERJ). Az RJ alkalikus proteázokkal történő kezelésével az RJ allergiás reakciója csökkenthető az ásványi anyagok, vitaminok és RJ-specifikus zsírsavak, például a 10-hidroxi-2-decénsav (10-HDA) táplálkozási vesztesége nélkül [22]. Azt azonban nem tisztázták, hogy az RJ egészségügyi előnyei fennmaradnak-e a proteázkezelés után.

Az öregedést késleltető vegyületek azonosítására kísérleti állatmodelleket alkalmaztak. Számos tanulmány számolt be az egerek meghosszabbított élettartamáról [23]. Ezeket a vizsgálatokat azonban azonos genetikai háttérrel rendelkező egereken végezték; ezért gondosan meg kellett fontolnunk, hogy az élettartamra gyakorolt hatások genotípustól függenek-e vagy sem. Az elmúlt években genetikailag heterogén (HET) egérmodellt alkalmaztak olyan szerek vizsgálatára, amelyek várhatóan megnövelik az élettartamot az Országos Öregedési Intézet (NIA) által lefolytatott intervenciós tesztprogramokban [24]. A HET modellnek számos előnye van az öregedési kutatás más modelljeivel szemben. Mivel a HET egereket négy különböző beltenyésztett törzsből (BALBc, C57BL/6, C3H és DBA/2) generálják, genetikai sokféleségük van, és különböző halálozási okokkal rendelkeznek, hasonlóan az emberi populációkhoz. Az ITP-kben több mint 10 vegyületet teszteltek a HET egér modell alkalmazásával [25], és csak a rapamicinről derült ki, hogy mind a hím, mind a nőstény állatokban nő az élettartam [26]. Az olyan élelmiszer-összetevők, mint a resveratrol, a zöld tea kivonata, a kurkumin, a közepes láncú trigliceridek és a halolaj, mind nem hosszabbították meg az egészséges élettartamot [27,28].

Jelen tanulmányban az RJ hatását vizsgáltuk HET egerek felhasználásával az élettartamra és az egészséges élettartamra. Összehasonlítottuk a normál méhpempő (NRJ) és az ERJ hosszú élettartamát. Az egész életen át tartó RJ kezelés hatásainak tisztázása érdekében az egerek hat hónapos korában kezdtük el a kezeléseket. Különböző fizikai teljesítőképességi vizsgálatokat végeztünk egereken, hogy felmérjük az RJ képességét az állatok egészséges élettartamának meghosszabbítására.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Egérgyártás és -karbantartás

Az ebben a vizsgálatban elvégzett összes állatkísérletet a Chiba Egyetem etikai bizottsága jóváhagyta belső irányelveik alapján. Genetikailag heterogén négyutas keresztes egereket állítottak elő a Chiba Egyetemen az előzőekben leírtak szerint [24]. A BALB/cCrScl, C57BL/6NCrSlc és CB6F1/Slc (F1 hibrid a női BALB/cCrScl és a hím C57BL/6NCrSlc között F1 hibrid) törzseket a Japan SLC Inc.-től (Shizuoka, Japán) szereztük be. Először párosítottuk a DBA/2CrSlc hímet C3H/HeSlc nősténnyel, így kaptuk az F1 hibrid C3D2F1/CU-t. Ezután hím C3D2F1/CU-t párosítottunk nőstény CB6F1/Slc-vel genetikailag heterogén egerek előállításához (S1. Kiegészítő ábra). Az egereket 4 hetes korukban választották el, majd műanyag ketrecben helyezték el 5-6 egér/ketrecben, 12 órás világos-sötét ciklus alatt, szobahőmérsékleten. Az egerek szabad hozzáférést kaptak a vízhez egy műanyag palackkal, és M libanás étrendet adtak nekik (Oriental Yeast Co., Ltd., Tokió, Japán) ad libitum.

2.2. Kísérleti étrend és RJ kezelés

Liofilizált nyers RJ-t (enzimmel nem kezelt RJ (NRJ, tételszám: YRP-M-140830) és enzimmel kezelt RJ-t (ERJ, tételszám: YDP-M-140423)) a Yamada Bee Company, Inc.-nél (Okayama, USA) készítettünk. Japán). Az RJ-t specifikus zsírsavak (E) -10-hidroxi-2-decénsav (10H2DA) és 10-hidroxidekánsav (10HDA) mennyiségével standardizáltuk: az NRJ legalább 3,8% 10H2DA-t és legalább 0,6% 10HDA-t tartalmazott, míg az ERJ legalább 3,5% 10H2DA-t és minimum 0,6% 10HDA-t tartalmazott. A kísérleti étrendeket úgy készítettük el, hogy a liofilizált RJ-t alaposan összekevertük MF por-étrenddel (Keleti élesztő), akár 0,05% (alacsony dózis), akár 0,5% (nagy dózis) (v/v) koncentrációban. A kísérleti étrendek általános összetételét az S1 kiegészítő táblázat mutatja. Az egyes diéták összetételeit az MF por étrend, az NRJ és az ERJ gyártási információi alapján számoltuk ki.

Ebben a vizsgálatban hím heterogén egereket használtunk. 6 hónapos korban az egereket véletlenszerűen öt csoportba osztották, nevezetesen: Kontroll (n = 66), 0,05% NRJ (NRJL, n = 62), 0,5% NRJ (NRJH, n = 66), 0,05% ERJ ( ERJL, n = 64) és 0,5% ERJ (ERJH, n = 66), és ekkor ad libitum kísérleti étrendet kaptak. Az étrendet hetente kétszer frissítették.

2.3. Fizikai teljesítmény tesztek

A kontroll és a méhpempővel (RJ) kezelt egerek túlélési görbéinek összehasonlítása. A medián élettartam becsléséhez Kaplan – Meier-elemzést használtak. A nyíl az RJ kezelés kezdetét jelzi. A fehér nyílhegyek jelzik azt az időpontot, amikor az egerek fizikai teljesítményét tesztelték. A szürke nyílhegyek azt az időpontot jelzik, amikor az egereket feláldozták, hogy mintákat kapjanak a kísérletekhez. Cont: kontroll; NRJL: enzimmel nem kezelt RJ alacsony dózis; NRJH: enzimmel nem kezelt RJ nagy dózis; ERJL: enzimmel kezelt RJ alacsony dózisú; ERJH: enzimmel kezelt RJ alacsony nagy dózisban.

2.4. Vér- és szövetgyűjtemény

A teljes vért 10 és 24 hónapos korban gyűjtöttük 18 órás érzéstelenítésben (pentobarbitál és éter kombinációja). A vérsejtek számát a vérvétel után azonnal megmértük egy automatikus hematológiai elemzővel (Celltac MEK-4150; Nihon Kohden, Tokió, Japán). EDTA-plazmát is készítettünk ugyanabban az időpontban a plazma biokémiai paramétereinek elemzésére: plazmaalbumin, aszpartát-aminotranszferáz (AST), alanin-aminotranszferáz (ALT), összkoleszterin (T-CHO) és triglicerid (TG). A szöveteket 9–10, 24 és 36–39 hónapos korban távolították el az egerekből (1. ábra, szürke nyílhegyek). Az eltávolítás előtt az összes szövetet jéghideg foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) perfundáltuk, majd folyékony nitrogénnel átöblítettük. Az összes mintát az elemzésig -80 ° C-on tároltuk.

2.6. Szövettani elemzések

A vázizmokat (gastrocnemius izmokat) paraformaldehiddel rögzítettük, és keresztmetszeteket készítettünk. Az általános izomszövettan értékeléséhez a keresztmetszeteket hematoxilinnal és eozinnal festettük. A fényképeket az All-In-One fluoreszcens mikroszkópos rendszerrel, a BZ-700-val (Keyence, Osaka, Japán) készítettük. Az izomrostok keresztmetszeti területét (CSA) és a centronukleusok számát BZ-Z analizátorral elemeztük (Keyence).

2.7. A csontásványi sűrűség mérése

A csontásványi sűrűséget (BMD) 9–10, 24 és 36–39 hónapos korban mértük kettős energiájú röntgenabszorpciós módszerrel. Röviden: az egereket pentobarbitállal altattuk, majd a combcsontjaik BMD-jét PIXImus eszközzel (Lunar Corp., Madison, WI, USA) mértük.

2.8. Az mRNS expressziójának elemzése

A teljes RNS-t 10 és 24 hónapos korban extraháltuk a gastrocnemius izomból TRIzol® RNS izoláló reagensekkel (Thermo Fisher Scientific K.K., Kanagawa, Japán). A teljes RNS-t RQ-1 RNáz szabad-DNázzal (Promega, Madison, WI, USA) kezeltük a szennyezett genomi DNS eltávolítása érdekében. A teljes RNS koncentrációját a NanoDrop (Thermo Fisher Scientific K.K) segítségével számszerűsítettük. Egy mikrogramm teljes RNS-t fordítottunk át ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix-el (Toyobo, Osaka, Japán). A valós idejű polimeráz láncreakciót (PCR) az SYBR Green fluoreszcens festékkel, SsoAdvanced ™ Universal SYBR® Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) alkalmazásával valósítottuk meg, egy Miniopticon valós idejű PCR rendszerrel ( Bio-Rad Laboratories). Az ebben a kísérletben használt primerpárokat az S4 kiegészítő táblázat mutatja. Öt referencia génjelölt stabilitását értékeltük a „NormFinder” algoritmus segítségével [29]: B2m, Actb, H2a, Gurb és Rsp18. A H2a-t azért választottuk ki háztartási génként, mert ez a legstabilabb expressziót mutatta a vázizomban.

2.9. Statisztikai elemzések

Minden statisztikai elemzést a GraphPad Prism7 alkalmazásával végeztünk. Az adatokat átlag ± standard hiba átlagként (SEM) ábrázoltuk. A csoportok közötti statisztikai különbségeket a nem-parametrikus Kruskal – Wallis teszttel elemeztük (post-hoc Dunn többszörös összehasonlító tesztje). Ha két csoportot elemeztek, a szignifikanciát a Mann – Whitney-féle U-teszt határozta meg. A túlélési görbéket Kaplan – Meier módszerrel számoltuk, és a statisztikai különbséget a log-rank teszttel határoztuk meg. Az egyes kísérletek statisztikai elemzését az ábra jelmagyarázatai írják le.

3. Eredmények

3.1. Ételbevitel, testtömeg és túlélés

A kísérleti étrendek általános összetétele és összes kalóriája összehasonlítható volt a csoportok között (S1. Kiegészítő táblázat). Az élelmiszerfogyasztás az életkor előrehaladtával az összes csoportban fokozatosan csökkent, de hasonló korú csoportoknál hasonló volt (S2. Kiegészítő ábra). Az RJ bevitelt az élelmiszer-fogyasztási értékekből számítottuk ki. Az egerek RJ-t fogyasztottak kb. 50 mg/testtömeg-kg/nap az alacsony RJ-csoportban és 500 mg/testtömeg-kg/nap a magas-RJ-csoportban a kísérletek során (S2a kiegészítő ábra, jobb oldali panel). Hat hónapos kortól kezdve havonta mértük a testsúlyt (az RJ kezelés kezdete). A testtömeg 15 hónapos kor körül érte el a csúcspontját (9 hónappal az RJ-kezelés után), majd az öregedési folyamat során fokozatosan csökkent. A testtömeg az ERJL csoportban 14 és 22 hónapos kor között szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a kontroll csoportban, de ennek a súlycsökkenésnek az okait nem tártuk fel. A többi csoportban nem volt szignifikáns változás a testtömegben (S2b kiegészítő ábra). Ezután megbecsültük az RJ hatását a túlélésre (1. ábra). A nagy dózisú RJ (mind NRJH, mind ERJH) nem befolyásolta a medián élettartamot. Az alacsony dózisú RJ nem mutatott markáns hatást a túlélésre. A plazma biokémiai paraméterek és a vérsejtek értékelése során nem észleltünk az RJ-val történő kezeléssel kapcsolatos biztonsági aggályokat (S2 és S3 kiegészítő táblázat).

3.2. Az RJ hatása a fizikai teljesítmény korfüggő károsodására

A méhpempő javította a genetikai heterogén egerek motoros funkciójának életkorral kapcsolatos károsodását. A tapadási szilárdságot rugós nyomtávú próbával (a) és drótfüggesztéssel (b). A mozgásszervi aktivitást vízszintes oszloppróbával mértük (c) és gyorsított rotarod teszt (d). Az adatokat az átlag ± standard hiba (SEM) formájában mutatjuk be (n = 14–18 30–33. Hónapban vagy n = 4–7 36–39. Hónapban). ** P 3. ábra, fehér nyíl). Ezeket az izom atrófiás tulajdonságokat azonban gyengítették RJ-vel kezelt egerekben (3. ábra). A szálkeresztmetszeti terület (CSA) gyakorisági csúcsa az életkor előrehaladtával 1800-ról 1200 µm2-re tolódott (3. i ábra). Azonban a szálak nagyok maradtak (több mint 2100 µm 2) az RJ-vel kezelt egerekben (3. i ábra). Az átlagos rost CSA szintén csökkent az idős kontroll egerekben, de nem különbözött szignifikánsan az RJ-vel kezelt egerekétől (3. j ábra). Ezenkívül az életkor előrehaladtával a centrronukleáris miofiberek prevalenciájának szignifikáns növekedése az RJ-vel kezelt idős egerekben általában csökkenést mutatott (3. k ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az RJ kissé befolyásolta az izomrostok korral járó morfológiai változásokat.

Az RJ hatása az izomrostok korral összefüggő morfológiai változásokra genetikailag heterogén egerekben. A – D, Gastrocnemius izomrostok morfológiája (Hematoxylin – eozin (H & E) festés) fiatal (a,e), idősebb (b,f), NRJ-vel kezelt (c,g) és az ERJ-vel kezelt (d,h) egerek. A felső panelek kis nagyítást mutatnak (a-d), és az alsó panelek nagy nagyítást mutatnak (e,f). Centronukleusos rostokat figyeltek meg idős egerekben (lásd az ábra nyílhegyeit). A gyulladásos sejtek behatolását a fehér nyíl jelzi. A sáv 100 µm-t jelöl. (én), A gastrocnemius izomrostok keresztmetszeti területeinek (CSA) megoszlása. ** P 4. ábra). Ezután megvizsgáltuk az RJ hatását a MyoD és a myogenein [31] izomdifferenciáló génekre és az izomnövekedést szabályozó myostatinra [32]. A csoportok között nem volt szignifikáns különbség a MyoD, a myogenin és a myostatin expressziójában (4. ábra). Megvizsgáltuk az RJ hatását az izom-specifikus E3 ubiquitin ligázok MuRF1 és atrogin-1 (más néven MAFbx) expressziójára is, amelyekről beszámolnak, hogy különböző izom atrófiás modellekben, beleértve az öregedés modelljeit is, szabályozzák [33]. Megerősítettük, hogy a MuRF1 és az atrogin-1 az életkor előrehaladtával szignifikánsan növekedett a HET egerekben. Azonban RJ-vel kezelt egerekben a MuRF1 és az atrogin-1 expressziója hasonló volt a fiatal egerekéivel (4. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az RJ késleltette az izom minőségének életkorfüggő deregulációját az izomregeneráció és a katabolikus gének szabályozásával egyaránt.

5. Következtetések

Jelen tanulmányban kimutattuk, hogy az RJ a HET egerek segítségével csillapította az életkorral összefüggő motoros funkció csökkenésének progresszióját. Az RJ befolyásolta a szövettani és molekuláris változásokat, amelyek az izmok életkorával általában bekövetkeztek, ami arra utal, hogy az RJ előnyösen befolyásolja az izom minőségét az izom mennyiségével szemben. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az RJ hasznos lehet a QOL javításában az életkorral kapcsolatos motoros funkciókárosodás csillapításával.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Shuichi Shibuya és Naotaka Izuo (Haladó Öregedés Orvostudományi Tanszék, Chiba University Graduate School of Medicine, Chiba, Japán) segítséget nyújtó beszélgetését. Ezt a munkát támogatta a Yamada Bee, Ltd. támogatása.