A mikroglia hiányos autofágia károsítja a szinaptikus metszést és társadalmi viselkedési hibákat okoz

Tárgyak

Absztrakt

Bevezetés

Az autizmus spektrum rendellenességek (ASD-k) neurodevelopmentális rendellenességek, amelyekre jellemző a káros szociális interakció, a kommunikációs hiány, az ismétlődő viselkedés, valamint a szűk és intenzív érdeklődés. 1 Különböző genetikai vizsgálatok azt sugallják, hogy az ASD összefüggésbe hozható a posztszinaptikus glutamaterg szinapszisokhoz kapcsolódó sejtutak rendellenességeivel. 2, 3 Megnövekedett dendrit gerincsűrűséget találtak az ASD 4 agyban, és abnormális szinaptikus struktúrákat figyeltek meg ASD modell egerekben. 5.

A posztnatális szinaptikus fejlődést dinamikusan szabályozza az egyidejű szinapszis képződés és elimináció az emlős agykéregében. 6, 7 A szinapszisok feleslege a fejlődés korai szakaszában képződik, több, mint amit általában az érett agyban tartanak fenn. A felesleges és felesleges szinapszisokat ezután kiküszöbölik, és a szinapszisok egy részét fenntartják és megerősítik. 8., 9. Ezért a szinapszis képződésének és eliminációjának pontos szabályozása fontos az agy normális fejlődése szempontjából, és a szinapszisok csökkentett, többletet eredményező eliminációját feltételezik neurodevelopmentális rendellenességekkel, például ASD-vel. 10, 11

Egyre több bizonyíték utal arra, hogy az ASD-kben központi szerepet játszik az immunrendszer diszregulációja. Számos ASD-kockázati gén kapcsolódik az immunrendszerhez, az anyai immunrendszerrel kapcsolatos kockázati tényezők pedig az ASD-khez. 12 Az agy reprezentatív immunsejtjének, a Microglia-nak fontos szerepe van a 10., 13., 14., 15. szinaptikus finomításban, és úgy gondolják, hogy részt vesznek az ASD-k patogenezisében is. 12, 16, 17, 18, 19, 20 Számos jelentés az ASD agyak mikroglia aktivációjának, mennyiségének és eloszlásának változását is mutatja. 17, 18, 19, 21

Különböző tanulmányok azt sugallják, hogy az ASD-k patogenezisében autofágia-utak vesznek részt. 22 ASD-asszociált exonikus kópiaszám-variánsról számoltak be az autofágia útjaiban részt vevő fehérjéket kódoló génekben. Az autofágia az a katabolikus folyamat, amely a citoplazmát, beleértve az aberráns organellákat és a makromolekulákat, kettős membrános vezikulákká szeparálja, és lizoszómákba juttatja a keletkező makromolekulák lebontása és esetleges újrafeldolgozása céljából. A rapamicin emlős célpontja (mTOR) az autofágia indukció egyik fontos gátló szabályozója. 25, 26 Egerek PTEN mutáció által közvetített mTOR disinhibícióval, amely gátolja az autofágia kialakulását, autista viselkedést és rendellenes neuronális arborizációt mutat, ami arra utal, hogy az autofágia deregulálódik az ASD-ben. 27 Autizmus-szerű fenotípusokat figyeltek meg olyan nőstény egerekben, amelyekből hiányzott az ambra-1, amely pozitív szabályozója a beclin-1-nek, amely az autofagoszóma kialakulásának fő szereplője. 28 Az rapTycin mTOR gátlása, amely aktiválja az autofágia, helyreállítja az autizmus-szerű tüneteket és javítja a rendellenes neuro-anatómiai struktúrákat a PTEN mutáns egerekben. 29, 30 Nemrégiben hiperaktivált mTOR-t és károsodott autofágia volt megfigyelhető a post mortem ASD betegek temporális kérge. 11.

Ennek megfelelően feltételeztük, hogy a mikroglia autofág folyamatai részt vehetnek a szinaptikus metszésben, és arra gondoltunk, hogy a mikroglia autofágia is fontos-e az autista viselkedésben. Noha a glia sokkal nagyobb mennyiségben fordul elő az agyban, és a közelmúltban megállapították, hogy fontosabb szerepet töltenek be az agy szinaptikus aktivitásának szabályozásában és az agy homeosztázisának fenntartásában, mint azt korábban gondolták, 19, 23 a mikroglia autofágia és az ASD kapcsolata továbbra is kérdéses tisztázott.

Anyagok és metódusok

Állatok

Egér viselkedési tesztek

A részletes anyagokat és módszereket a Kiegészítő információk tartalmazzák.

Sejtkultúrák

A Microglia-t olyan kevert primer gliakultúrákból izoláltuk, amelyeket 3 napos egerek agykérgéből nyertünk, az előzőekben leírtak szerint. 31 Az egér kérgi neuronjainak elsődleges tenyészeteit a 16. napos embrionális kölykök agyából készítettük, a korábban leírtak szerint. 32 Részletes anyagokat és módszereket a Kiegészítő információk tartalmaznak.

Western blot és egyéb kísérletek

A Western-blotokat standard módszerekkel, denaturáló és redukáló körülmények között hajtottuk végre, az előzőekben leírtak szerint. 33 A részletes anyagokat és módszereket a Kiegészítő információk tartalmazzák.

Eredmények

Egerek generálása Atg7-hiányos mikrogliával

A mikroglia autofágia hozzájárulását a szinaptikus finomításhoz és az ASD-hez vizsgálva Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre egereket állítottunk elő. Ezekben az egerekben az autofágia szempontjából létfontosságú Atg7 törlődik a myeloid vonal-specifikus lizozim M-expresszáló sejtekben, amint azt korábban leírtuk. 34 Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre egér keresztezésével ROSA26-tdTomato riporter egerekkel, amelyek loxP-STOP-loxP szekvenciákat hordoztak a tdTomato gént, vizualizáltuk a Cre-expresszáló mikrogliát. Amint az Atg7 fl/+; Lyz2 Cre/+; ROSA26-tdTomato egér agyának szagittális síkjában látható a posztnatális 7. napon, a paradicsomot expresszáló mikrogliákat minden agyrégióban detektáltuk (1a. Ábra), és Iba-1-pozitív mikrogliaval kolokalizáltuk. (1b. Ábra). Az Atg7 fehérjeszintje az elsődleges tenyésztett mikrogliaban, valamint az Atg7 fl/fl-ből gyűjtött peritoneális makrofágokban; a Lyz2-Cre egerek vagy nem voltak kimutathatók, vagy nagyon alacsonyak voltak a Western blot elemzésben (1c. Ábra). Az Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre egerek fejlődésükben normálisak és termékenyek voltak. A felnőttek nem mutattak különbséget a testben vagy az agyban a kontrollokhoz képest (1d. Ábra).

Atg7-hiányos mikrogliával rendelkező egerek fenotípusai. (a) Az Atg7 fl/+; Lyz2 Cre/+; ROSA26-tdTomato egér agyának sagittális képei a szülés utáni 7. napon Iba-1 (zöld) és Hoechst 33342 (kék) ellen antitesttel festettek. Paradicsom expressziót (vörös) minden agyi régióban kimutattunk. Méretarány = 500 μm. (b) A paradicsom expressziójának (vörös) nagy része Iba-1-pozitív mikroglia (zöld) mellett lokalizálódott. Méretarány = 20 μm. (c) Az primer mikroglia kultúrák lizátumában vagy az Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre egérből gyűjtött peritoneális makrofágokban nem detektáltunk Atg7 fehérjét. (d) A felnőtt Atg7 fl/fl test- és agytömege; a Lyz2-Cre egerek hasonlóak voltak a kontrollokéhoz (n= 12 csoportonként).

Az Atg7-hiányos mikrogliában szenvedő egereknél a szociális interakció és az ismétlődő viselkedés károsodott

Az autizmust a káros interakció és kommunikáció, valamint az ismétlődő viselkedés határozza meg. Először azt vizsgáltuk, hogy az Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre egerek kóros társadalmi interakciót mutattak-e be. A háromkamrás társas interakciós vizsgálatban az Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre hím egerek nem mutattak semmiféle preferenciát az 1. idegen számára, míg a kontroll hím egerek lényegesen több időt töltöttek idegenekkel 1, mint az üres pohárral, jelezve, hogy az Atg7 fl/fl fl; Lyz2-Cre egerek autista jellegű károsodást mutattak a társas interakcióban (2a. ábra). Amikor az üres csészét egy másik új egérrel (2. idegen) foglalták el, mind a kontroll, mind az Atg7 fl/fl; a Lyz2-Cre egerek inkább a 2. idegen körül kutattak (2b. Ábra). Az egyes tesztek során a teljes megtett távolságban nem volt különbség a csoportok között (2a – c. Ábra). A hím egerekhez hasonlóan a nőstény egerek is hiányos társas jellegűek voltak (S1. Kiegészítő ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az autofágiahiányos mikrogliában szenvedő egereknek csökkent szociabilitása, de normális társadalmi felismerése van. Ezután értékeltük a márványtemetési tesztet és a fészeképítési viselkedést. Az Atg7 fl/fl; A Lyz2-Cre egerek több golyót temettek el, mint a kontrollok (2d. Ábra), ami megnövekedett ismétlődő viselkedést tükröz, ami az ASD egyik jellemzője. Az Atg7 fl/fl; a Lyz2-Cre egereknél a fészeképítési pontszámok is rosszabbak voltak, mint a kontrolloknál (2e. Ábra).

Megnövekedett dendrit gerincsűrűség Atg7-hiányos mikrogliában szenvedő egereknél

Ismét magasabb PSD95 immunreaktivitást igazoltunk az Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre egerek agyi szakaszain, mint a kontrollokban (3b. Ábra). A PSD95 antitesttel és az Iba-1 antitesttel történő kettős jelöléssel a PSD95- és Iba-1-pozitív immunreaktivitások bőséges ko-lokalizációját találtuk Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre egerekben a kontroll állatokkal összehasonlítva. Szinaptofizin elleni antitesttel festve preszinaptikus marker, Iba-1 és szinaptofizin ko-lokalizációkat is gyakrabban detektáltak Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre egerekben, mint a kontrollokban (3b. Ábra). A születés utáni 12. napon számszerűsítettük a kortikális területen az elnyelt PSD95-pozitív puncta számát mikrogliánként (3c. Ábra). Az elnyelt PSD95-pozitív punctákat kvantifikáltuk minden konfokális z-veremből felépített mikroglia nagyfelbontású háromdimenziós vetületeiben. A PSD95-pozitív puncta száma az Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre egerekben szignifikánsan magasabb volt, mint a kontrollokban (3c. Ábra).

Az Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre egerekben az autofágia markerek fehérjeszintjei, köztük az LC3 (könnyű lánc-3) -II és a p62, szignifikánsan különböztek a kontrollokétól (3d. Ábra). A Western blot analízis során az autofagoszóma marker LC3-II szignifikánsan csökkent az Atg7 fl/fl-ben; a Lyz2-cre egerek és a p62, az autofágia fehérje szubsztrátja, amelyet az autofág forgalom nyomon követésére használtak, 37 szignifikánsan megnőtt, tükrözve a károsodott autofágia microglia. Összességében azt feltételeztük, hogy a mikroglia autofágiahiánya a korai fejlődés során a dendritikus tüskék megnövekedését eredményezi a csökkent mikroglia autofágia által közvetített elimináció miatt.

A szinapszisok károsodott romlása és az éretlen szinapszisok számának növekedése a atg7-hiányos mikroglia miatt

Ezután a primer egér neuronokat együtt tenyésztettük Atg7 fl/fl vagy Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre egerek mikrogliaival, hogy megvizsgáljuk a mikroglia autofágia hatását az idegsejtek fejlődésére. A korábbi eredményekhez hasonlóan (3. és 4. ábra) a szinaptofizin felhalmozódása markánsabb volt a atg7-hiányos mikrogliákban (5a. Ábra), ami tovább erősítette az autofágia-hiányos mikroglia károsodott szinapszis lebomlását. A synaptophysin puncta növekedett a atg7-hiányos mikrogliával együtt tenyésztett neuronokban (5b. Ábra), hasonlóan a in vivo eredmények (3. ábra). A atg7-hiányos mikrogliával együtt tenyésztett idegsejtekben a MAP2-pozitív dendrites filopódia is növekedett (5c. Ábra), ami arra utal, hogy az éretlen szinapszisokat fokozták az autofágia-hiányos mikroglia. A atg7-hiányos mikrogliákkal együtt tenyésztett neuronok szintén megnövekedett ideggyulladás-vastagságot, neurit-faszikulák és fragmentált neuritek képződését mutatták (S2. Kiegészítő ábra). Érdekes módon ezek a változások nem mindig jártak közvetlen érintkezéssel a mikrogliákkal, ami arra utal, hogy vannak további humorális tényezők, amelyek befolyásolják a szinapszis fejlődését, a mikroglia autofágia szinapszis degradációra gyakorolt közvetlen hatásán túl.

Az anatómiai és funkcionális agyi kapcsolat megváltoztatása autofágiahiányos mikrogliában szenvedő egerekben

Mivel a hiányos neuron-mikroglia jelátvitel károsítja az agy funkcionális kapcsolódását, 10 és neuritikus és szinaptikus változásokat észleltünk a atg7-hiányos mikrogliával rendelkező egerek idegsejtjeiben és agyában (3., 4., 5. ábra és S2. Kiegészítő ábra), agyi kapcsolatokat tártunk fel. diffúziós tenzor képalkotás és nyugalmi állapotú mágneses rezonancia képalkotás (fMRI) segítségével. Az Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre egerek agyában az átlagos diffúzió növekedett S2-ben (S3a. Kiegészítő ábra). Ez azt sugallja, hogy az Atg7 fl/fl; Lyz2-Cre egerek több agyrégiójában vannak mikrostrukturális anomáliák, amelyek befolyásolhatják az anatómiai és funkcionális agykapcsolatot, és tükrözhetik a neurotikus változásokat, amelyeket az atg7-hiányos mikrogliával végzett neuronok együttes tenyésztése során észleltek (kiegészítő Ábra S2). A globális fMRI BOLD szignálanalízis alapján kiszámított korrelációs mátrixok tendenciát mutattak az S2 és a kortikális területek közötti megváltozott fMRI funkcionális kapcsolat felé. A funkcionális kapcsolódás S2-ről az elülső cinguláris kéregre nőtt, és S2-ről prefrontális kéregre csökkent Atg7 fl/fl; Lyz2-cre egerekben a kontroll egerekhez képest (S3b. Kiegészítő ábra). Ez azt is sugallja, hogy a károsodott mikroglia autofágia megváltoztatja az agyak mikrostruktúráját és funkcionális összekapcsolhatóságát, ami hozzájárulhat az ASD patogeneziséhez.

Vita

Jelen tanulmányban először azt hisszük, hogy az autofágia elvesztése a korai fejlődési mikrogliában károsítja a szinaptikus metszést, és megnöveli a dendritikus gerincsűrűséget, valamint az ASD-re utaló rendellenes társadalmi interakciókat és ismétlődő viselkedéseket. Ezért a mikroglia autofágia fontos szerepet játszik a szinaptikus homeosztázis és a neuropszichológiai viselkedés szabályozásában (S5. Kiegészítő ábra).

Felvetődött, hogy az autofágia részt vegyen az ASD patogenezisében. 22, 23 Tang et al. 11 nemrégiben fedezte fel, hogy az autofágia károsodott post mortem Az ASD temporális kéregek azt mutatják, hogy az LC3-II autofagoszóma marker csökkent, és a p62 autofágia szubsztrát megnövekszik. Ezenkívül az mTOR és szubsztrátjának foszforilációja fokozódik, ami azt jelzi, hogy az mTOR aktiválódik és képes gátolni az autofágia kialakulását. Megfigyelték továbbá a szinaptikus metszés és az ASD-szerű viselkedés hibáit a neuronális autofágiahiányos egerekben, megmutatva, hogy a neuronális autofágia fontos a szinaptikus finomítás és a normális agyi fejlődés szabályozásában. Ezenkívül létezhet egy másik mechanizmus is a szinaptikus metszéshez, nevezetesen az, hogy a microglia a posztnatális fejlődés során fagocitózis útján kiküszöböli a gyenge és nem megfelelő szinapszisokat. 13, 15 Az autofágia károsodását mutató eredmények a post mortem Az ASD 11 agy nemcsak az idegsejtekben, hanem a gliaban, beleértve a mikrogliákat is, károsodott autofágia következménye lehet, mivel a glia nagyobb mennyiségben fordul elő, mint a neuronoké. Itt megmutattuk, hogy a mikroglia autofágia a szinaptikus finomításban és az agy normális fejlődésében is fontos (3., 4., 5. ábra). A károsodott mikroglia autofágia hozzájárulhat a teljes autofágia károsodásához az ASD-s betegek agyában. 11.

Az ASD prevalenciája különbözik a férfiak és a nők között. 60 A heterozigóta ambra-1 hiány csak nőstény egerekben eredményez autista viselkedést, hím egerekben nem. Az aktivitásfüggő neuroprotektív fehérje (ADNP) mutációval jár ASD-s betegeknél és a legtöbb olyan mutációval rendelkező férfi gyermeknél, amelyek a mai napig súlyosabb értelmi fogyatékosságot mutatnak, mint a nők. 61, 62, 63 Az ADNP haploinsufficiency a hím egereknél súlyos kognitív károsodást eredményez, míg a nőstény egerek részlegesen megkíméltek. 64, 65 Érdekes, hogy az ADNP mikrogliában is expresszálódik, és kompenzációs védelmi funkciókkal rendelkezik a stresszes állapotok ellen. 66 Ezeket a tulajdonságokat az ASD mutációk is ronthatják. A hímeknél több mikroglia van bizonyos agyi területeken, beleértve a preoptikus területet, a hippocampust, a parietális kéreget és az amygdalát, ami arra utal, hogy a mikroglia szerepet játszik az agy szexuális differenciálódásában. 67, 68, 69 Noha kísérleti körülményeink mind a hím, mind a nőstény egerekben csökkent autocidiahiányos mikrogliában mutatkoztak társas jellegűek (2. ábra és 1. kiegészítő ábra), az autista viselkedés és a szinapszis súlyosságában vagy érzékenységében különbségek lehetnek a férfiak és a nők között a környezet és a környezet függvényében, amelyekkel a jövőben foglalkozni kell.

Az ASD hatása az emberekre nagy mértékben eltér. A kognitív funkciókat tekintve az autizmus bármilyen szintű intelligenciával létezhet. 70 Noha az értelmi fogyatékosságot gyakran ASD kíséri, az ASD-k 70% feletti IQ-val rendelkező gyermekek aránya nőtt. 71 Érdekes lesz tehát megérteni az alacsony és magas kognitív funkciójú ASD közötti különbség neurobiológiai hátterét. Az autofágiahiányos mikrogliában szenvedő egerek olyan ASD fenotípusokat mutattak, mint a csökkent szociabilitás és az ismétlődő viselkedés, de az intakt kognitív funkciókat, például a normális társadalmi újdonságot (2b. Ábra). Ez a tulajdonság jellemző lehet az autofágiahiányos mikroglia által okozott ASD-típusra, amely érdekes téma lesz a jövőbeni tanulmányokban.

Különböző MRI vizsgálatok az anatómiai és funkcionális kapcsolatok rendellenességeit tárták fel az ASD-s betegek agyában. 72, 73, 74 A mikroglia szinaptikus metszésének hibái a fejlesztés során az agyi régiók közötti funkcionális kapcsolat csökkenését és a szociális interakció károsodását eredményezik. 10 Megfigyeltük azt is, hogy az Atg7 fl/fl agyában a mikrostrukturális kapcsolat és a funkcionális kapcsolat csökken, a Lyz2-cre egerek diffúziós tenzoros képalkotásában és fMRI elemzésében, amelyek összefüggésben lehetnek autofágiahiányos mikroglia okozta szinaptikus változásokkal Kiegészítő S3 ábra). Így a mikroglia autofágia hatással lehet az agyi régiók közötti funkcionális kapcsolatra, és a mikroglia autofágia károsodása csökkent funkcionális kapcsolódást és ASD-szerű viselkedést eredményez.

Összefoglalva: eredményeink feltárják a mikroglia autofágia szerepét az idegsejtek szinaptikus metszésében és érésében a fejlődés és a normális társas viselkedés kialakulása során. Az autofágiahiányos mikrogliában szenvedő neuronok megnövekedett dendritikus tüskéi és éretlen filopodiumai hozzájárulhatnak az ASD patogeneziséhez (S5. Kiegészítő ábra). Ezért a mikroglia autofágia szabályozása stratégia lehet az ASD terápiában és megelőzésben.

Hivatkozások

BH király, Navot N, Bernier R, Webb SJ. Frissítés az autizmus diagnosztikai osztályozásáról. Curr Opin Pszichiátria 2014; 27.: 105–109.