A mitokondriumokat célzó zsírsav-analóg plazma triacil-glicerin-csökkentő hatást fejt ki károsodott karnitin bioszintézisű patkányokban

Szerepek Formális elemzés, vizsgálat, projekt adminisztráció, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Berlini Egyetem Klinikai Tudományi Osztálya, Bergen, Norvégia, Szívbetegség Tanszék, Haukeland Egyetemi Kórház, Bergen, Norvégia

Szerepek vizsgálata, projekt adminisztráció, erőforrások, felügyelet, írás - áttekintés és szerkesztés

Bergeni Egyetem Klinikai Tudományi Tagozat, Bergen, Norvégia

Szerepek Formális elemzés, források, írás - áttekintés és szerkesztés

Graz Orvostudományi Egyetem Fiziológiai Kémiai Intézete, Graz, Ausztria

Szerepek Konceptualizálás, formális elemzés, források, írás - áttekintés és szerkesztés

Bergeni Egyetem Klinikai Tudományi Tagozat, Bergen, Norvégia

Szerepek Formális elemzés, források, írás - áttekintés és szerkesztés

Graz Orvostudományi Egyetem Fiziológiai Kémiai Intézete, Graz, Ausztria

Szerepek Konceptualizálás, források, felügyelet, írás - áttekintés és szerkesztés

Berlini Egyetem Klinikai Tudományi Osztálya, Bergen, Norvégia, Szívbetegség Tanszék, Haukeland Egyetemi Kórház, Bergen, Norvégia

Carine Lindquist,
Bodil Bjørndal,
Christine Renate Rossmann,
Asbjørn Svardal,
Seth Hallström,
Rolf Kristian Berge

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Lindquist C, Bjørndal B, Rossmann CR, Svardal A, Hallström S, Berge RK (2018) A mitokondriumokat célzó zsírsavanalóg plazma triacilglicerint csökkentő hatást fejt ki károsodott karnitin bioszintézisű patkányokban. PLoS ONE 13 (3): e0194978. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0194978

Szerkesztő: Catherine Mounier, Universite du Quebec, Montreal, Kanada

Fogadott: 2017. szeptember 15 .; Elfogadott: 2018. március 14 .; Közzétett: 2018. március 28

Adatok elérhetősége: Minden lényeges adat a cikkben található.

Finanszírozás: Ezt a munkát a Bergeni Kutatási Alapítvány és a Nyugat-norvég Regionális Egészségügyi Hatóság (911945) pénzügyileg támogatta a CL számára. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A metabolikus szindrómát jellemző egyik kockázati tényező a dyslipidaemia, beleértve a megnövekedett plazma-triacil-glicerint (TAG) [1]. A metabolikus szindróma a megnövekedett kardiovaszkuláris kockázattal jár [2–5], amelyben a kardiovaszkuláris betegségek jelentik a halál fő okát világszerte [6]. Az alkoholmentes zsírmájbetegséget a lipidek májban történő felhalmozódásaként definiálják, ami szintén diszlipidémiával társul [7], és vagy a metabolikus szindróma máj manifesztációjának vagy független kardiovaszkuláris rizikófaktornak számít [8]. A nyugati országok általános népességének 20–40% -a alkoholmentes zsírmájbetegségben szenved [9]; azonban az étrend megváltoztatása és a fokozott testmozgás mellett nem határoztak meg jóváhagyott kezelést. Számos esemény okozza a lipidek túlzott intrahepatikus felhalmozódását, mint például a máj fokozott lipidfelvétele, fokozott lipogenezis, valamint a nagyon hosszú sűrűségű lipoprotein (VLDL) részecskék szintézisének és/vagy szekréciójának zavara, megakadályozva a TAG eltávolítását a májból [10, 11]. Az alkoholmentes zsírmájbetegséget mitokondriális betegségnek nevezik, beleértve a diszfunkcionális mitokondriális zsírsav oxidációt és a biogenezist [11, 12], így a mitokondriális funkciót megcélzó gyógyszerek egyaránt javíthatják a zsírmáj betegségét és a plazma TAG-t.

A 3- (2,2,2-trimetilhidrazinium) -propionát-dehidrát (meldónium; márkanév Mildronate) a karnitin prekurzor γ-butirobetain analógja, így gátolja a γ-butirobetaine-hidroxilázt, elnyomja a karnitin bioszintézisét, és csökkent karnitin-koncentrációhoz vezet [21, 22]. Mivel ez a mechanizmus stimulálja a glükóz metabolizmusát a szívben, ezért kardioprotektív gyógyszerként alkalmazzák [23]. Kimutatták azonban, hogy a máj karnitinszintjének csökkenése zsírmáj kialakulását eredményezi az állatokban [22, 24]. Így Mildronáttal kezelt patkányok használhatók modellként a karnitin kimerüléséhez [22].

A 2- (tridec-12-in-1-il-tio) -ecetsav (C15H26O2S; 1-hármas TTA) hosszúsága megegyezik a palmitinsavval, amelyben a β-szénatom kénatommal helyettesített. Ezenkívül az ω végén hármas kötés van, amely ellenáll mind a β-oxidációval, mind az ω-degradációval szemben. Az 1-hármas TTA-t Lindquist et al. [25] mint mitokondriális aktivátor és proliferátor patkányokban. Kimutatták, hogy fokozza a máj mitokondriális zsírsav-oxidációját in vitro palmitoil-CoA oxidációs teszt, enzimaktivitási vizsgálatok és a mitokondriális β-oxidációban és a karnitin-transzferben részt vevő enzimek génexpressziója alapján. Emellett jelentősen csökkentette a plazma és a máj TAG-tartalmát, miközben csökkentette a máj ATP-szintjét. Megmértük a plazma karnitin szintjét is, ahol az L-karnitin, az acilkarnitinek és a karnitin prekurzor γ-butirobetain nyilvánvalóan csökkent a kontrollhoz képest. Ezért feltételeztük, hogy az 1-hármas TTA potenciális kezelés lehet a túlsúlyos és a zsíros máj.

Mivel az 1-hármas TTA kimutatta, hogy növeli a mitokondriális aktivitást és a lipid katabolizmust a májban, alacsonyabb TAG-szintet és karnitin-szintet a plazmában, jelen tanulmány célja annak megvizsgálása volt, hogy az 1-hármas TTA kedvezően befolyásolhatja-e a lipid anyagcserét, ha a karnitin bioszintézise károsodott.

Anyagok és metódusok

Állatkísérlet

A plazma és a máj paramétereinek számszerűsítése

Lipid elemzés.

A májlipideket Bligh és Dyer [28] szerint fagyasztott mintákból extraháltuk, nitrogénatmoszférában bepároltuk, és az elemzés előtt izopropanolban újra feloldottuk. A májból és a plazmából származó lipideket enzimatikusan mértük Hitachi 917 rendszeren (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Németország) a Roche Diagnostics triacilglicerin (Triglycerides GPO-PAP, 11730711) és a DiaSys foszfolipid készlet (Phospholipids FS, Ref 157419910930) segítségével. Diagnostic Systems GmbH, Holzheim, Németország).

Plazma-karnitin és karnitin-prekurzorok.

Az L-karnitint, trimetililizint, y-butirobetaint és acetilkarnitint plazmában nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (MS/MS) elemeztük, Vernez és mtsai. [29] néhány módosítással [30].

Máj nagy energiájú foszfátok.

A fagyasztással kapcsolt biopsziákat a májból vették és folyékony nitrogénben tárolták. A minta előkészítését és az ATP, ADP és AMP nagyteljesítményű folyadékkromatográfiás mérését a korábban leírtak szerint végeztük [31–33]. A részleteket Lindquist et al. [25]. Az energia töltését a következő képlet segítségével számoltuk ki: Energiatöltet = (ATP + 0,5 ADP)/(AMP + ADP + ATP).

Májenzim vizsgálatok.

1 g friss májmintát jégen hűtöttünk, és 4 ml jéghideg szacharóz-táptalajban (0,25 M szacharóz, 10 mM HEPES és 1 mM Na4EDTA, KOH/HCl-mel 7,4-re állítva) homogenizáltuk. A homogenizátumokat 1030 RCF-en 10 percig 4 ° C-on centrifugáltuk, és a mag utáni frakciót eltávolítottuk, és további elemzésre használtuk fel [34]. A palmitoil-CoA oxidációját azonnal meghatároztuk a mag utáni frakciójában a friss májból, mint savban oldódó termékek, a leírtak szerint [35]. További elemzéseket végeztünk fagyasztott mag utáni frakcióban: 3-ketotioláz (EC: 2.3.1.16) [36], karnitin O-palmitoiltranszferáz 2 (CPT2, EC: 2.3.1.21) [37], citrát szintáz (EC: 2.3.). 3.1) [38, 39], zsírsav-szintáz (FAS; EC: 2.3.1.85) [40], acetil-CoA karboxiláz (EC: 6.4.1.2) [41], citrát-ATP-liáz (EC: 2.3.3.8) [42], acil-CoA-oxidáz (ACOX; EC: 1.3.3.6) [43], glicerin-3-foszfát-acil-transzferáz (GPAT; EC: 2.3.1.15) [44, 45], acil-CoA-szintetáz (EC: 6.2). .1.3) [46] és malonil-CoA dekarboxiláz (EC: 4.1.1.9) [47]. A karnitin/acilkarnitin-transzlokáz (CACT) fehérje expresszióját PBS-ben homogenizált fagyasztott májban mértük a Nordic BioSite ELISA kit segítségével (Kat .: EKR1588; Täby, Svédország).

A fehérjekoncentrációt BioRad protein assay-vel (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) mértük.

Májgén expresszió elemzése.

Statisztikai analízis

Egyirányú ANOVA-t hajtottak végre, és statisztikailag szignifikáns esetekben (p 1. táblázat. Hím Wistar patkányok súlya és takarmányfelvétele három hét kezelés után.

A plazma karnitinre és a karnitin származékokra gyakorolt hatás

Jelen tanulmányban az L-karnitin (1A. Ábra) és az acetilkarnitin (1B. Ábra) plazmaszintje csökkent a Mildronate-táplált csoportban (85, illetve 87% -os csökkenés), valamint a Mildronate és 1-triple kombinált kezelésében TTA (70, illetve 65% -os csökkenés) a kontrollhoz képest. Ezt követte a y-byturobetaine plazmaszintjének 16-szoros növekedése a két Mildronate-kezelt csoportban a kontrollokhoz képest (1.C ábra), míg a Bbox1 mRNS kismértékű, de szignifikáns csökkenést mutatott a Mildronate + 1-tripla TTA-val összehasonlítva. kontroll (p = 0,021) és Mildronát (p = 0,003) (2. táblázat). Sőt, mindkét kísérleti csoportban a trimetil-lizin plazmaszintje (1D. Ábra), valamint a Tmlhe és Aldh9a1 mRNS-szintje állandó maradt (2. táblázat). A karnitin transzporter OCTN2 (Slc22a5) génexpresszióját 7-szer indukálta 1-hármas TTA a Mildronáttal kezelt patkányokban mind a kontroll, mind a Mildronate-hez képest (2. táblázat). Indukálták a máj karnitin-o-acetil-transzferáz (Crat) génexpresszióját

30-szoros, 1-hármas TTA Mildronáttal kezelt patkányokban, és a Mildronát nem változott a kontrollhoz képest. A CACT (Slc25a20) gén (2. táblázat) és fehérje (1. ábra E) expresszióját (2. táblázat) 1-hármas TTA indukálta Mildronáttal kezelt patkányokban, összehasonlítva a kontroll és a Mildronát kezeléssel.

A. Plazma L-karnitin; B. Plazma-acetilkarnitin; C. Plazma γ-butirobetain; D. Plazma-trimetil-lizin; E. A karnitin-transzlokáz fehérje expressziója (CACT). Az értékek átlag ± SD (n = 6–8) formájában vannak feltüntetve. Egyirányú ANOVA, p 0,05. C – Control, M – Mildronát (550 mg/testtömeg-kg), MT – Mildronát (550 mg/testtömeg-kg) és 1-hármas TTA (100 mg/testtömeg-kg) kombinációja.

A zsírsav oxidációra és a mitokondriális működésre gyakorolt hatás

(A) a palmitoil-CoA teljes β-oxidációja a májban; (B) a palmitoil-CoA teljes β-oxidációja malonil-CoA hozzáadásával a májban; (C) az acil-CoA szintetáz enzimaktivitása; (D) A karnitin-palmitoil-transzferáz (CPT) 2 enzimaktivitása; (E) 3-ketotioláz enzimaktivitása; (F) a malonil-CoA dekarboxiláz (MCD) enzimaktivitása; (G) az acil-CoA-oxidáz (ACOX) enzimaktivitása; (H) A citrát-szintáz enzimaktivitása. Az értékek átlagként ± SD (n = 6–8) jelennek meg. Egyirányú ANOVA, p 0,05. C – Control, M – Mildronát (550 mg/testtömeg-kg), MT – Mildronát (550 mg/testtömeg-kg) és 1-hármas TTA (100 mg/testtömeg-kg) kombinációja.

(A) Energiatöltés (ATP + 0,5 ADP)/(AMP + ADP + ATP). (B) Az AMP és az ATP aránya. Az értékek átlag ± SD (n = 6–8) formájában vannak feltüntetve. Egyirányú ANOVA, p 0,05. C – Control, M – Mildronát (550 mg/testtömeg-kg), MT – Mildronát (550 mg/testtömeg-kg) és 1-hármas TTA (100 mg/testtömeg-kg) kombinációja.

A máj TAG szintjére és a lipogenezisre gyakorolt hatás

(A) Az acetil-CoA karboxiláz (ACC) enzimaktivitása. (B) A zsírsav-szintáz (FAS) enzimaktivitása. (C) A citrát-ATP-liáz enzimaktivitása. (D) A glicerin-3-foszfát-transzferáz (GPAT) enzimaktivitása. Az értékek átlag ± SD (n = 6–8) formájában vannak feltüntetve. Egyirányú ANOVA, p 0,05. C – Control, M – Mildronát (550 mg/testtömeg-kg), MT – Mildronát (550 mg/testtömeg-kg) és 1-hármas TTA (100 mg/testtömeg-kg) kombinációja.

Hatás a plazma TAG szintjére és a lipoprotein gén expressziójára

A Mildronate-kezelés nem változtatta meg a plazma TAG-szintet a kontrollokhoz képest, de figyelemre méltó, hogy a Mildronate és az 1-tripla TTA kombinációjában a plazma TAG-értéke jelentősen csökkent (2. táblázat). Ezenkívül negatív összefüggés mutatkozott a plazma TAG és a mitokondriális zsírsav β-oxidációja, valamint a plazma TAG és a Dgat2 között (3. táblázat).

Mivel a VLDL-TAG szekréció sebességének és a plazma clearance sebességének változásai hozzájárulhatnak a TAG-csökkentő hatáshoz, megvizsgáltuk, hogy az ApoB, ApoCII, ApoIII és Vldlr (azaz VLDL receptor) génexpressziója megváltozott-e 1-hármas TTA után. A 2. táblázat azt mutatta, hogy a Mildronate és az 1-hármas TTA kombinációja csökkentette az ApoB, ApoCII, ApoCIII és Vldlr mRNS-szintjét (p = 0,016, p = 0,021) a kontrollhoz és a Mildronate-hez képest, míg maga a Mildronate-kezelés nem volt hatással ezekre a génekre.

Vita

Ez a munka bebizonyította, hogy annak ellenére, hogy a plazma karnitin a Mildronáttal kezelt patkányokban jelentősen csökkent, az 1-hármas TTA képes volt csökkenteni a plazma és a máj TAG-koncentrációját. Ezek a javulások valószínűleg a fokozott máj mitokondriális zsírsav-oxidációnak tudhatók be, ahol a karnitin hatékonyan fogyasztható, csökkent TAG-szintézissel és megnövekedett plazma-clearance-szel együtt. Ezek az adatok nem társultak megváltozott takarmánybevitelhez vagy súlygyarapodáshoz.

A Mildronate a plazma karnitinszintjének csökkenésével jár [49]. Jelen tanulmányban a Mildronate önmagában és 1-hármas TTA-val kombinálva csökkentette a plazma karnitin- és acetilkarnitin-szintjét a kontrollokhoz képest, a plazma γ-butirobetain-szintjének növekedésével együtt. Figyelemre méltó, hogy a Mildronate nem befolyásolta a karnitin bioszintézisében szerepet játszó enzimek májgén expresszióját. Azonban a Mildronate és az 1-tripla TTA kombinációja csökkentette a Bbox1-et a Mildronate-hez és bizonyos mértékben a kontrollcsoporthoz képest (p = 0,021). Korábban kimutatták, hogy az 1-hármas TTA kezelés patkányokon csökkenti a Bbox1 expressziót és 40-50% -kal csökkenti a plazma karnitin- és acetilkarnitinszintet, de a y-butirobetaine szintjét is 40% -kal [25]. Ez különböző mechanizmusokra utal: míg a Mildronate csökkenti a karnitin szintjét azáltal, hogy gátolja a karnitin bioszintézisében szerepet játszó enzimet [49], az 1-hármas TTA befolyásolhatja a Bbox1 gén expresszióját, és nagy valószínűséggel növelheti a karnitin fogyasztását [25]. Mildronát jelenlétében az 1-hármas TTA nem mutatta a plazma karnitin további csökkenését a Mildronate-hez képest (71% vs. 85%), de nagyobb csökkenést mutatott, mint azt korábban csak az 1-hármas TTA-val jelentették (52%, Lindquist et al. [ 25]). Ezért úgy tűnt, hogy a Mildronate uralja a karnitin csökkenését a kombinált intervenciós csoportban.

Korábban kimutatták, hogy a Mildronate növeli a máj TAG-szintjét, amit ebben a vizsgálatban nem figyeltek meg. Lehetséges, hogy ennek a hatásnak a reprodukálásához hosszabb vizsgálati időszakra vagy felnőtt patkányokra lehetett volna szükség, mivel ezt a vizsgálatot 5 hetes patkányokkal végezték három hétig. A Mildronátot azonban zsírmáj indukálására alkalmazták fiatal patkányokban hasonló és rövidebb ideig [22, 65]. Meg kell fontolni, hogy a máj orális adagjának alkalmazása a takarmányban történő folyamatos Mildronate adagolása helyett okozza-e a máj TAG és OCTN2 génexpressziójának növekedésének hiányát.

Összefoglalva, a karnitin bioszintézisét a Mildronate károsította, de a plazma karnitin szintjét nem csökkentette tovább az 1-hármas TTA. Az 1-hármas TTA a karnitin bioszintézisének károsodása ellenére a plazma és a máj TAG-értékének csökkenését mutatta, ami a karnitin hatékony használatát jelzi. A TAG-csökkentő hatást elsősorban a fokozott májzsírsav-oxidáció közvetítette, ami a mitokondriális aktivitással társult, de valószínűleg csökkent TAG-bioszintézist és lipoprotein-szintézist is magában foglal. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az 1-hármas TTA hatékony eszköz a lipid-anyagcsere és a mitokondriális funkció tanulmányozásában, és lehetséges jelölt az anyagcserezavarok, például a zsíros májbetegség és a karnitinhiány kezelésére.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Kari Helland Mortensennek és Mari-Ann Jørstad Davidsennek az állatok segítségét, valamint Randi Sandvik, Kari Williams, Liv-Kristine Øysæd és Svein Krüger technikai támogatását. Nagyra értékeljük Torunn Eide főmérnök nélkülözhetetlen segítségét is, aki elvégezte a plazma-acilkarnitin-elemzéseket. Köszönjük továbbá a JSC Grindeksnek (Lettország) és a Synthetica AS-nek (Oslo) (Norvégia) a Mildronate és az 1-tripla TTA biztosításáért. Ezt a munkát a Bergeni Kutatási Alapítvány és a Nyugat-norvég Regionális Egészségügyi Hatóság pénzügyileg támogatta (911945).