A monociták makrofág-differenciálódását az alacsony sűrűségű lipoproteinek lipid-oxidációs foka befolyásolja

1 Mikrobiológiai Tanszék, Immunológiai és Immunológiai Betegségek Intézete, Brain Korea 21 PLUS Orvostudományi Projekt, Yonsei Egyetem Orvostudományi Főiskolája, Szöul 120-752, Koreai Köztársaság

2 Fizikai Tanszék, Yonsei Egyetem, Seoul 120-752, Koreai Köztársaság

Absztrakt

Az LDL fontos szerepet játszik az érelmeszesedéses plakkképződésben és a makrofág differenciálódásban. Az LDL oxidációs fokáról és a makrofágok differenciálódásáról azonban nincsenek jelentések. Vizsgálatunk kimutatta, hogy az M1 vagy M2 makrofágokká történő differenciálódás összefügg az LDL lipidoxidációs szintjével. A lipidperoxidáció szintje alapján az LDL-t magas oxidációjú LDL (hi-oxLDL) és alacsony oxidációjú LDL (alacsony oxLDL) kategóriákba sorolják. A makrofágok differenciálódási profilját a felszíni receptor expressziója és a citokin szekréció profiljai határozták meg. Az alacsony oxLDL által indukált CD86 expresszió és TNF termelés-α és IL-12p40 THP-1 sejtekben, ami M1 makrofág fenotípust mutat. A Hi-oxLDL indukálta a mannóz receptor expresszióját és az IL-6 és a monocita kemoattraktáns protein-1 termelését, amelyek többnyire megfelelnek az M2 makrofágok fenotípusának. A hi-oxLDL által végzett M2 polarizáció további alátámasztó bizonyítéka volt a LOX-1 indukciója a THP-1 sejtekben, amelyeket hi-oxLDL-vel kezeltek, de nem alacsony oxLDL-vel. Hasonló eredményeket értek el az elsődleges humán monociták esetében. Ezért eredményeink határozottan arra utalnak, hogy az LDL oxidációs foka befolyásolja a monociták M1 vagy M2 makrofágokká történő differenciálódását, és meghatározza a gyulladásos sorsot az érelmeszesedés korai szakaszában.

1. Bemutatkozás

Az oxidált kis sűrűségű lipoproteinek (oxLDL) kritikus szerepet játszanak az érelmeszesedéses plakkképződésben, amelyet a lipidekkel terhelt makrofágok [1] perzisztenciája, valamint az endothelsejtek motilitásának zavarása okoz az artéria falában. A monociták makrofágokká történő differenciálódását, amelyek felhalmozzák az oxLDL-t, hogy habsejteket képezzenek, az oxLDL indukálja [1, 3]. A folyamat az endotheliális aktivációval indul a subendoteliális területeken oxLDL lerakódással [4, 5]. A monociták kemokinek irányításával vándorolnak az intimába [6], és makrofágokká differenciálódnak. Ezek a makrofágok ezután módosított lipoproteineket vesznek fel, és amint felhalmozzák a felesleges lipideket, habsejteket képeznek [3]. A habsejtek elpusztulnak és intracelluláris tartalmat bocsátanak ki [7], ami gyulladásos reakciót vált ki. Ez viszont több makrofágot vonz az elváltozásba. E folyamat során az LDL enzimekkel, például mieloperoxidázzal [8, 9] vagy reaktív oxigénfajokkal (ROS) [3] oxidálódhat a plakk gyulladásos mikrokörnyezetében. Bár az oxLDL fontos az érelmeszesedés gyulladásában, az LDL oxidációs fokáról és a makrofág differenciálódásról nincsenek beszámolók.

A makrofágok alapvetően hozzájárulnak az érelmeszesedés kialakulásához és előrehaladásához. Az intimába toborzott monocitákat különféle ingereknek, például citokineknek, lipideknek, vasnak és kalciumnak teszik ki, amelyek összetett mikrokörnyezetben léteznek. Ezek a tényezők befolyásolhatják a makrofágok fenotípusos polarizációját és azok későbbi aktiválódását [10]. A klasszikusan aktivált (M1) makrofágok és az alternatív módon aktivált (M2) makrofágok jól definiált fenotípusok. Ezenkívül a legújabb vizsgálatok azt sugallják, hogy az M2 makrofágok (M2a, b, c és d) számos altípusa és az ingerek által kiváltott alpopulációk, például a Mox, Mhem, M (Hb) és M4 makrofágok léteznek ateroszklerotikus elváltozásokban [11].

Ezért feltételeztük, hogy a korai atherosclerotikus közegben különböző oxidációs szintekkel rendelkező LDL létezik, és hogy az LDL oxidációs foka befolyásolja a makrofágok differenciálódását klasszikusan aktivált (M1) vagy alternatív módon aktivált (M2) makrofágokká, ami meghatározza az érelmeszesedés fejlődésének gyulladásos sorsát. Ebben a vizsgálatban a monocitákat magas oxidációjú LDL-vel (hi-oxLDL) vagy alacsony oxidációjú LDL-rel (alacsony oxLDL-értékkel) kezelték, és felszíni receptoruk expresszióját és citokin-szekréciós profiljaikat elemezték annak meghatározása érdekében, hogy differenciálódtak-e M1 vagy M2 makrofágokká.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Reagensek

Az emberi natív LDL-t és az oxidált LDL-t a Biomedical Technologies Inc.-től (Stoughton, MA, USA) szereztük be. Az elektroforézis során az alacsony oxLDL tovább vándorol, mint a natív LDL, és alacsony TBAR-érték (8,7–11,8 nmol/mg fehérje) is meghatározza. A Hi-oxLDL 2,7-szer tovább vándorol, mint a natív LDL, és magas TBAR-érték (55,7–75,6 nmol/mg fehérje) határozza meg. Anti-humán CD86-PE és anti-humán CD206- (mannózreceptor) FITC antitesteket a Beckman Coulter Inc.-től (Brea, CA, USA), illetve a BD Biosciences-től (San Jose, CA, USA) szereztünk be. Az anti-LOX-1 és anti-tubulin antitesteket az Abcam-tól (Cambridge, MA, USA), illetve a BioLegend-től (San Diego, CA, USA) szereztük be. Rekombináns humán M-CSF-et a BioLegend-től (San Diego, Kalifornia, USA) vásároltunk. LPS (E. coli O26: B6) a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, USA) vásároltuk.

2.2. A THP-1 sejtek tenyésztése

A humán monocita THP-1 sejtvonalat az ATCC-től szereztük be, és 10% FBS-t és penicillin-sztreptomicint (100 egység/ml és 100 μg/ml, ill.) 37 ° C-on, nedvesített 5% -os CO2 inkubátorban.

2.3. A sejtproliferáció elemzése

A sejtproliferációs sebességet kolorimetrikus sejtszámláló készlet-8 (CCK-8) alkalmazásával mértük (Dojindo laboratóriumok, Kiotó, Japán). A THP-1 sejteket 1x105 sejt/lyuk tenyésztéssel 24-lyukú lemezeken tenyésztettük, és natív LDL, alacsony oxLDL vagy hi-oxLDL (50 μg/ml). 24, 48 vagy 96 óra elteltével az egyes mélyedésekbe CCK-8 reagenst adunk, és a sejteket 30 percig inkubáljuk 37 ° C-on. A felülúszót összegyűjtöttük és 96 lyukú lemezekre helyeztük. Az O.D. 450 nm-en spektrofotométerrel határoztuk meg.

2.4. Áramlási citometria

A THP-1 sejteket 2 × 105 sejt/lyuk tenyésztés mellett 12 lyukú lemezeken tenyésztettük, és natív LDL, alacsony oxLDL vagy hi-oxLDL (50 μg/ml). 24 vagy 96 óra elteltével a sejteket összegyűjtöttük és áramlási citometriával elemeztük a granularitás és az autofluoreszcencia mérésére. A felszíni markerek kimutatásához a sejteket natív LDL-rel, alacsony oxLDL-értékkel vagy hi-oxLDL-lel kezeltük (50 μg/ml) 96 órán át, és PE-konjugált anti-humán CD86 antitestekkel festettük. Az áramlási citometriás elemzést egy BD LSR II áramlási citométerrel (BD Bioscience) végeztük.

2.5. Konfokális mikroszkópia

A THP-1 sejteket 2 üreges kamrákban lévő takarópoharakban tenyésztettük, lyukanként 2 × 105 sejt sejtenként, és natív LDL, alacsony oxLDL vagy hi-oxLDL kezeléssel kezeltük. μg/ml) 96 órán át. A csatolt sejteket FITC-konjugált anti-humán mannóz receptor (CD206) antitestekkel festettük és FV1000 mikroszkóppal elemeztük (Olympus, Tokió, Japán).

2.6. Az emberi monociták izolálása és a morfológiai változások megfigyelése

A vért egészséges donoroktól szerezték, miután megszerezték a belső ellenőrző bizottság jóváhagyását és a beleegyező tájékoztatást (4-2012-0088. Szám). A perifériás vér mononukleáris sejteket (PBMC) Ficoll-Hypaque sűrűség gradiens centrifugálással (sűrűség = 1,077) elválasztottuk 1600 fordulat/perc sebességgel 30 percig, és az emberi monocitákat tisztítottuk PBMC-kből a Monocyte Isolation Kit II (Miltenyi Biotec, Bergsch Gladbach, Németország) alkalmazásával. A CD14 festését a megerősített monocita populációra végeztük, és általában a sejtek 95% -a volt pozitív. Az emberi monocitákat 10% FBS-t és penicillin-sztreptomicint (100 egység/ml és 100 μg/ml, ill.) 37 ° C-on, nedvesített 5% -os CO2 inkubátorban. Az emberi monocitákat 12 lyukú lemezeken tenyésztettük 2x105 sejt/üreg mennyiségben, és M-CSF-el (50 ng/ml) és hi-oxLDL-rel vagy alacsony oxLDL-rel (50 μg/ml) 7 napig. Fénymezõs mikroszkóppal (IX71, Olympus, Tokió, Japán) morfológiai változásokat figyeltünk meg.

2.7. Enzimhez kapcsolt immunszorbens assay (ELISA)

A THP-1 sejteket 2 × 105 sejt/mélyedés mellett tenyésztettük 12 üreges lemezeken, és előkezeltük natív LDL-rel, alacsony oxLDL-értékkel vagy hi-oxLDL-gyel (50 μg/ml) 24, 48 vagy 96 órán át. A táptalajt friss tápközeggel helyettesítettük, majd a sejteket LPS-sel (100 ng/ml) stimuláltuk. A primer monocitákat 2 × 105 sejt/mélyedés mellett tenyésztettük 12 üregű lemezeken, és előkezeltük M-CSF-rel (50 ng/ml) és natív LDL-rel, alacsony oxLDL-értékkel vagy hi-oxLDL-rel (50 μg/ml) 24, 48 vagy 72 órán át. Az elsődleges monocitákat LPS-sel (20 ng/ml) stimuláltuk. Tizennyolc órával az LPS-stimuláció után a tenyészet felülúszókat összegyűjtöttük és -80 ° C-on tároltuk. Az ELISA-t humán citokin TNF-mel végeztük-

, IL-12p40, IL-6 és monocita kemoattraktáns protein-1 (MCP-1) vizsgálati készlet (BD Bioscience). Az O.D. 450 nm-en meghatároztuk.

2.8. Western Blot

A THP-1 sejteket lyukanként 2x105 sejt maggal oltottuk, és natív LDL, alacsony oxLDL vagy hi-oxLDL (50 μg/ml). 24 és 48 óra elteltével a sejteket összegyűjtöttük és lizáló pufferrel lizáltuk. Centrifugálás után az összes fehérjét -80 ° C-on tároltuk. Mindegyik 50 μg fehérje mintát 12% SDS-PAGE-ba töltünk és nitrocellulóz membránra visszük (GE Healthcare, NJ, USA). Ezután a membránokat anti-LOX-1 vagy anti-tubulin antitestekkel reagáltattuk. Fehérje sávokat detektáltunk egy West Save Up Western blot detektáló készlet segítségével (Ab határ, Szöul, Korea).

2.9. Statisztikai analízis

Egyirányú ANOVA elemzést végeztek.

jelentősnek tekintették.

3. Eredmények

3.1. Az LDL oxidációs fokának differenciális hatásai a monociták granularitási indukciójára és proliferációjára

Az LDL oxidációs fokának hatásainak vizsgálatához megvizsgáltuk a THP-1 sejtek differenciálódását és proliferációját natív LDL, alacsony oxLDL vagy hi-oxLDL kezelés után. A sejtek granulitása (1. ábra (a)) és az autofluoreszcencia (1. ábra (b)) szignifikánsan megnőtt a hi-oxLDL-lel kezelt sejtekben, összehasonlítva a natív LDL-gyel vagy alacsony oxLDL-vel kezelt sejtekkel. A hi-oxLDL ezen hatásai idővel fokozódtak. Hi-oxLDL-kezelés után a sejtproliferációs sebesség nem változott a natív LDL-lel kezelt sejtekéhez viszonyítva. Az alacsony oxLDL-lel kezelt sejtekben azonban a sejtproliferáció szignifikánsan csökkent, összehasonlítva a hi-oxLDL-lel kezelt sejtekével (1. ábra (c)). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a hi-oxLDL növeli a granularitást és az autofluoreszcenciát, míg az alacsony oxLDL csökkenti a sejtek proliferációját, ami arra utal, hogy a monociták eltérően reagálnak az LDL oxidációs fokára.

3.2. Az OxLDL hatása a makrofágok felületi markereinek expressziójára

Ezután megvizsgáltuk, hogy az LDL oxidáció mértéke befolyásolja-e a monociták makrofágokká történő differenciálódását. Amikor a sejteket alacsony oxLDL-lal kezeltük, az M1 makrofágok markerének, a CD86-nak az expressziós szintje megemelkedett a hi-oxLDL-lel kezelt sejtekéhez viszonyítva (2. ábra (a)). Ezzel szemben az M2 makrofágok, a mannózreceptor (CD206) markerének expressziós szintje szignifikánsan megemelkedett a hi-oxLDL-lel kezelt sejtekben, összehasonlítva a natív LDL-rel vagy alacsony oxLDL-rel kezelt sejtekével (2. ábra (b)). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az LDL oxidáció mértéke befolyásolja a monociták differenciálódását a makrofágok különböző altípusaiba.

3.3. Az OxLDL hatása a citokintermelésre

A citokintermelés értékeléséhez a THP-1 sejteket 24, 48 vagy 96 órán keresztül előzetesen kitettük differenciálisan oxidált LDL-re, majd LPS-sel stimuláltuk. A hi-oxLDL-rel előkezelt sejtekben csökkent a TNF- és IL-12p40 termelődése, összehasonlítva az alacsony oxLDL-rel előkezelt sejtekével (3. ábra (a)). Az IL-6 és az MCP-1 termelése azonban szignifikánsan megnőtt a hi-oxLDL-rel előkezelt sejtekben, összehasonlítva az alacsony oxLDL-rel előkezelt sejtekkel (3. ábra (b)). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a makrofágok az LDL oxidációs szintjétől függően különböző citokinkészleteket választanak ki. Még érdekesebb, hogy az alacsony oxLDL és a hi-oxLDL ellentétes citokin profilokat indukált.

, Az IL-12p40, IL-6 és MCP-1 értékeket ELISA-val mértük. Az adatok átlagosan ± S.E. három független kísérletből. A szignifikancia meghatározásához egyirányú ANOVA-analízist alkalmaztunk (

3.4. Az OxLDL hatása a LOX-1 expresszióra

Az OxLDL kötődik a megkötő receptorokhoz, például az LOX-1-hez, és indukálja az LOX-1 expresszióját a makrofágokban is. Teszteltük az oxLDL hatását az LOX-1 expressziójára THP-1 sejtekben. A LOX-1 expresszió növekedett a hi-oxLDL-lel kezelt sejtekben, összehasonlítva a natív LDL-lel vagy alacsony oxLDL-vel kezelt sejtekkel 24 vagy 48 óra elteltével (4. ábra). A LOX-1 expressziója kissé, de nem szignifikánsan csökkent az alacsony oxLDL-rel kezelt sejtekben, szemben a natív LDL-lel kezelt sejtekben (4. ábra).

3.5. Az OxLDL hatása az elsődleges monociták morfológiai változásaira és citokintermelésére

Amikor az emberi monocitákat alacsony oxLDL-lal kezelték, a sejtek orsószerű alakúra változtak, ami az M1 makrofágok egyedülálló tulajdonsága, míg a hi-oxLDL kezelése kerek sejtekhez vezetett, amelyek M2 makrofágokat képviselnek (5. ábra (a)) . A TNF előállítása-α és az IL-12p40 mennyisége csökkent volt a hi-oxLDL-rel előkezelt monocitákban, összehasonlítva az alacsony oxLDL-rel előkezelt sejtekkel (5. ábra (b)). Ezenkívül az IL-6 és az MCP-1 termelődése jelentősen megnőtt a hi-oxLDL-rel előkezelt monocitákban (5. ábra (c)). Ezek az eredmények alátámasztják, hogy az LDL oxidációs foka az elsődleges monocitákra hasonlóan hat, mint a monocita sejtvonal, a THP-1 sejtek.

4. Megbeszélés

Az érelmeszesedéses lepedék kialakulása során az LDL különféle mértékben oxidálható ROS vagy a subendotheliális területen lévő makrofágok által felszabadított enzimek segítségével [3]. Ez a módosított LDL, valamint a növekedési faktorok, például az M-CSF, befolyásolja a monociták makrofágokká történő differenciálódását. Az oxidáció mértékétől és időtartamától függően az LDL fizikai-kémiai tulajdonságai, például a töltés, a részecskeméret és a lipidtartalom megváltoznak [12]. Ezenkívül attól függően, hogy a lipid vagy a fehérje komponens oxidálódott-e, az oxidált LDL különböző jelátviteli utakat indukálhat [13]. Vizsgálatunk a differenciálisan oxidált LDL hatását vizsgálta a makrofágok differenciálódására. Kétféle oxLDL-t használtunk, amelyeket alacsony oxLDL vagy hi-oxLDL kategóriába soroltunk a lipidperoxidáció TBAR értéke és az agaróz géleken lévő LDL részecskék relatív elektroforetikus mobilitása alapján [14, 15].

Az MCP-1 fontos szerepet játszik a keringő monociták gyulladásos helyekre történő toborzásában. A monociták MCP-1 által közvetített toborzása hozzájárul a patogenezishez, de számos tanulmány kimutatta, hogy az MCP-1 jótékony szerepet játszik különböző gyulladásos állapotokban. A bélben a lamina propria makrofágok, amelyek M2-szerű fenotípust tártak fel, nagy mennyiségű MCP-1-t termelnek. Ezenkívül a lamina propria makrofágok egy alcsoportját toborozzák válaszul az MCP-1-re, és nagy mennyiségű IL-10-t termelnek a bél homeosztázisának egyensúlyi állapotban tartása, valamint a bélben a felesleges gyulladás megszüntetése érdekében [23]. Ezenkívül az MCP-1 más gyulladásos betegségekben, például az ischaemiás szívbetegségekben is jótékony hatást fejt ki az ROS keletkezésének gátlásával és a szívizom nekrotikus területeinek gyógyításával [24, 25].

Az IL-6 és az MCP-1 pontos szerepe továbbra is ellentmondásos. Az IL-6 és az MCP-1 gyulladáscsökkentő hatásaival kapcsolatos korábbi vizsgálatok azonban alátámasztják azokat az eredményeket, amelyek szerint a makrofágok hi-oxLDL-indukálta differenciálódása az M1-fenotípus helyett az M2-szerű fenotípus felé torzul (2. b) és 3. ábra b).

Eredményeink azt mutatják, hogy a hi-oxLDL IL-6 és MCP-1 termelést indukál a makrofágokban, jelezve, hogy ezen citokinek expressziója az M2 makrofágok jellemzője lehet. Bár a citokinprofilok értelmezése nehéz lehet, a citokintermelésre és a felületi marker expresszióra vonatkozó eredményeink többsége arra utal, hogy az alacsony oxLDL indukálja az M1 polarizációt, míg a hi-oxLDL M2 polarizációhoz vezet.

Ezután értékeltük a LOX-1 expresszióját. A LOX-1 az oxLDL receptora, és számos sejtben expresszálódik, például endothel sejtekben, izomsejtekben, monocitákban és makrofágokban [2, 26, 27]. Az oxLDL-hez való kötődést követően az LOX-1 internalizálódik; ez indukálja az endoplazmatikus retikulum (ER) stresszt, amely a LOX-1 upregulációját okozza, amely az ER stressz és az LOX-1 expresszió, valamint az M2 makrofágok közötti makrofág differenciálódás és a habsejtképződés közötti pozitív visszacsatolási hurok révén történik [27–29]. A 4. ábra azt mutatja, hogy a hi-oxLDL kezelés fokozta a makrofágok LOX-1 expresszióját. Ezek a magas LOX-1 szintek felerősítik a hi-oxLDL szignáljait, és ezáltal fokozott differenciálódást váltanak ki M2 makrofágokká. A mesenchymális őssejteket használó jelentés bebizonyította, hogy az oxLDL-gyel végzett kezelések jelentősen növelik az LOX-1 és az MCP-1 expresszióját [30], de az LDL oxidációs fokát nem határozták meg egyértelműen.

Végül megvizsgáltuk a differenciálisan oxidált LDL hatásait a primer monocitákban. Vizsgálatunk kimutatta, hogy az elsődleges monociták orsó alakúra változtak alacsony oxLDL-kezelés után, és kerek sejtekké a hi-oxLDL kezelés után. Köztudott, hogy az M1 makrofágok alakja orsószerűbb formát ölt, míg az M2 makrofágok lekerekítettebbek [31, 32]. A morfológiai változások mellett a citokinek profiljai és a TNF termelésének csökkenése-α és az IL-12p40, valamint az IL-6 és az MCP-1 megnövekedett termelése hi-oxLDL-kezelés után (5. ábra (b)) erősen alátámasztják a differenciálisan oxidált LDL szerepét az M1 vagy M2 makrofágok monocita differenciálásában.

Összességében a granularitásra, az autofluoreszcenciára, a citokinprofilokra és a felületkészítőkre vonatkozó eredményeink azt sugallják, hogy az alacsony oxLDL indukálja a makrofág polarizációt az M1 fenotípus felé, míg a hi-oxLDL az M2 fenotípust. Amint a 6. ábrán összefoglaltuk, eredményeink azt sugallják, hogy az LDL oxidációs foka a monociták és makrofágok differenciálódásának fontos tényezője, és meghatározhatja a gyulladás állapotát vagy akár az ateroszklerózis kialakulását a betegség korai szakaszában.