A NAD + és az ADP-riboziláció szerepe a Golgi-struktúra fenntartásában

Alekszandr Mironov

* Sejtbiológiai és Onkológiai Tanszék, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri, Consorzio Mario Negri Sud, 66030 Santa Maria Imbaro (Chieti), Olaszország; és ‡ Kaliforniai Egyetem Biológiai Tanszéke, San Diego, La Jolla, Kalifornia 92093

Antonino Colanzi

Maria Giuseppina Silletta

Giusy Fiucci

Silvio Flati

Aurora Fusella

Roman Polishchuk

Alekszandr Mironov, ifj.

Giuseppe Di Tullio

Roberto Weigert

Vivek Malhotra

Daniela Corda

Maria Antonietta De Matteis

Alberto Luini

Absztrakt

Anyagok és metódusok

Sejtkultúra

Patkány bazofil leukémia (RBL) -2H3 sejteket tenyésztettünk 16% FCS-sel és 1 mM 1 -glutaminnal kiegészített DME-ben. CHO sejteket 10% FCS-sel kiegészített DME-ben tenyésztettünk.

Antitestek és egyéb reagensek

A csontváz nyúlizmokból származó NAD +, NADP +, NADH +, NADH, BFA és GAPDH-t a Sigma Chemical Co.-tól (St. Louis, MO) szereztük be. A szöveti tenyésztési anyagok a GIBCO BRL-től (Grand Island, NY) és a Seromed-től (Berlin, Németország) voltak. A GTP és az ATP a Boehringer Mannheim-től (Mannheim, Németország) származott. Nyúl anti-α-mannozidáz II (Man II) antitestet K. Moremen (University of Georgia, Athén, GA), nyúl anti-β-COP antitestet J. Donaldson és J. Lippincott-Schwartz (Nemzeti Intézetek) szolgáltatott. Bethesda, MD). Az összes többi vegyi anyagot a lehető legnagyobb tisztasággal kereskedelmi forrásokból nyertük. A BFA-t -20 ° C-on DMSO törzsoldatokban tároltuk. A dikumarolt vizes oldatként történő felhasználás előtt állítottuk elő.

Sejtek permeabilizálása

Az RBL-t (üvegkamrás tárgylemezeken növesztve) jégre helyeztük és azonnal átmostuk a permeabilizációs pufferrel (PB: 25 mM Hepes-Koh, pH 6,95, 125 mM KOAc, 2,5 mM Mg [OAc] 2, 10 mM glükóz, 1 mM DTT, 1 mM EGTA és 0,5 μM taxol). A sejteket ezután 3 U/ml sztreptolcin O-val (SLO) (Biomerieux, Marcy l'Etoile, Franciaország) inkubáltuk, amelyet előzőleg 5 percig aktiváltunk szobahőmérsékleten PB-ben 8 percig jégen. A nem kötött SLO-t eltávolítottuk, és a sejtek egyrétegét hideg PB-vel mostuk, majd 1 mg/ml patkányagyi citoszollal, 1 mM ATP-vel, 250 μM UTP-vel, 2 mM kreatin-foszfáttal, 7,3 U/ml kreatin-foszfokinázzal kiegészített permeabilizációs pufferrel kezeltük 37 ° C-on. ° C-on 20-30 percig (a jelzett kezelések jelenlétében). A permeabilizáció mértékének ellenőrzésére a sejteket Trypan kék (és propidium jodid) festékkel mértük, és mértük a citoszolos enzim tejsav-dehidrogenáz szivárgását. Az SLO-kezelés elfogadott ütemtervével a sejtek 95% -át Trypan-kékkel vagy propidium-jodiddal festették, és a tejsav-dehidrogenáz aktivitás> 80% -át a permeabilizált sejt egyrétegű felülúszójában nyertük el. Patkány agyi citozolt készítettünk Malhotra és mtsai. (1989).

BFA-függő ADP-ribozilezés

ADP-ribozilezés permeabilizált sejtekben.

Az RBL sejteket 24 üregű lemezekre szélesztettük, és 24 óra elteltével 90% -os összefolyásnál (300 000 sejt/üreg/250 μl) felhasználtuk. A fent leírtak szerint permeabilizáltuk, majd 20 vagy 60 percig PB-nek tettük ki 500 μM timidint, 30 μM 32 P-NAD + -ot (3 μCi/minta) és adott esetben BFA-t tartalmazó PB-vel. Az inkubációk végén a felülúszót és a sejtfehérjéket 10% TCA-val kicsapjuk, mintapufferben oldjuk és SDS-PAGE-n elválasztjuk. A BARS-50-hez és a GAPDH-hoz kötött radioaktivitást fluorográfiával értékeltük.

A citoszol ADP-ribozilezése.

A citoszolt és a membránokat patkányagyból készítettük a leírtak szerint (De Matteis és mtsai, 1994). A citoszolt (10 mg/ml) és a sóval mosott membránokat (2 mg/ml) inkubáltuk 200 μM NAD + vagy 100 μM BFA vagy mindkettő jelenlétében vagy hiányában 60 percig 37 ° C-on. Ilyen kísérleti körülmények között a BARS-50 ADP-ribozilációja (amelyet 32 P-NAD + jelenlétében futtattunk párhuzamos kísérletekben értékeltünk) maximális volt (> 90%), míg a GAPDH csak részleges (3–4%). Semmilyen más fehérjét nem detektálhatóan ADP-ribozilezett a BFA (lásd a 3. ábrát). 3). Az inkubáció végén a mintákat 100 000 g-vel 60 percig centrifugáltuk, majd a felülúszókat (citoszolt) 16 órán át 4 ° C-on dializáltuk, és permofilizált sejtekben végzett immunfluoreszcencia kísérletekben használtuk az alábbiakban leírtak szerint.

A BFA a BARS-50 és a GAPDH ADP-ribozilezését indukálja permeabilizált sejtekben. (A) Az RBL sejteket 3 U/ml SLO-val permeabilizáltuk, és 10 μg/ml BFA-nak tettük ki 32 P-NAD + jelenlétében 20 vagy 60 percig, 37 ° C-on. Az inkubáció végén a fehérjéket SDS-PAGE-n szétválasztottuk, és a BARS-50-hez és a BAP jelenlétében a GAPDH-hoz kötött radioaktivitást fluorográfiával értékeltük. Hasonló eredményeket kaptunk négy kísérletben. (B) A citoszolt ADP-riboszilezettük pontosan az Anyagok és módszerek részben leírtak szerint. A fehérjéket SDS-PAGE-n szétválasztottuk, és a radioaktív sávokat fluorográfiával tártuk fel. Csak a BARS-50 és a GAPDH volt detektálhatóan ADP-ribozilezett a BFA-val. A GAPDH a toxin hiányában is gyengén módosult, a BFA által kiváltottaktól eltérő nemenzimás ADP-riboziláció következtében (De Matteis et al., 1994).

Immunfluoreszcencia és lektinfestés

Elektronmikroszkópia

A sejteket 2% glutáraldehiddel PBS-ben (pH 7,4) rögzítettük, redukált ozmiummal (1% OsO4 és 1,5% kálium-ferrocianid 0,1 M kacodilátpufferben, pH 7,4) utólag rögzítettük, és az Epon 812-be ágyazottuk, a korábban leírtak szerint (Buccione et al., 1996).

BARS-50-del dúsított citoszolos frakciók előállítása

A patkány agyi citozolt (Malhotra és mtsai, 1989) 35% telített (NH4) 2SO4-tal kicsapjuk. A csapadékot 25 mM Hepes-ben (pH 8,0) oldjuk, amely 5% glicerint, 0,5 M (NH4) 2SO4 és 1 mM DTT-t (A puffer) tartalmaz, és egy fenil-szefaróz HP oszlopra (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), pufferral egyensúlyba hozva. A. A fehérjéket az A puffer lineáris gradiensével eluálva mínusz (NH4) 2SO4. A BARS-50-et tartalmazó frakciókat a BFA-függő ADP-ribozilációs esszével azonosítottuk (De Matteis et al., 1994). Ezeket a (45-szeresen dúsított BARS-50-t és GAPDH-t nem tartalmazó) frakciókat betöményítettük, és egy éjszakán át B pufferrel (25 mM Hepes, pH 7,2, 50 mM K és 1 mM Mg acetát) szemben dializáltuk. A végső fehérjekoncentráció 2-3 mg/ml volt.

Eredmények

NAD + szükséges a Golgi-komplex BFA által kiváltott tubuláris retikuláris transzformációjához és a Golgi-enzimek ER-be történő újraelosztásához

NAD + szükséges a Golgi markerek BFA által indukált újraeloszlásához permeabilizált sejtekben. Az ép RBL-sejteket (a és b) 3 μg/ml BFA-val kezeltük 15 percig (b), vagy 3 U/ml SLO-val (c – f) permeabilizáltuk, és 20 percig inkubáltuk 37 ° C-on, az alábbiak szerint: Anyagok és módszerek (c) vagy 150 μM NAD + (e), vagy 10 μg/ml BFA önmagában (d) vagy BFA és 150 μM NAD + (f) hiányában. A sejteket ezután anti-Man II antitesttel festettük. Hasonló eredményeket kaptunk a helix pomatia lectin alkalmazásával, amely a cis Golgi rekesz markerje (nem látható). A kísérleteket négyszer ismételtük meg, hasonló eredményekkel. Rúd, 5 μm

A Golgi komplex ultraszerkezete permeabilizált sejtekben: NAD + szükséges a BFA hatásához. Az ép RBL-sejteket (a és b) 3 μg/ml BFA-val kezeltük 15 percig (b), vagy 3 U/ml SLO-val (c – f) permeabilizáltuk, és 20 percig inkubáltuk 37 ° C-on. (c) vagy önmagában BFA (d) vagy 150 μM NAD + (e) vagy BFA és 150 μM NAD + (f) kombinációjában. A sejteket ezután elektronmikroszkóppá dolgoztuk fel. A kísérleteket legalább háromszor ismételtük meg, hasonló eredményekkel. Rúd, 0,5 μm.

Ezután megvizsgáltuk a NAD + hozzáadását a permeabilizáló közeghez. A nukleotid (15–450 μM) és a dializált citoszol (1 mg/ml) jelenlétében a BFA feltűnően visszanyerte képességét a Golgi-komplex újraeloszlásának kiváltására (1. ábra 1 f), bár alacsonyabb hatékonyság, mint ép sejtekben (EC50: ∼5 μg/ml). Mind a NAD +, mind a citoszolra volt szükség a BFA aktivitásának kifejezéséhez. A NAD + BFA hiányában nem volt látható hatással (1. ábra e). A BFA nagyon magas koncentrációi (> 50 μg/ml) vagy a toxinnal végzett hosszú inkubációk képesek voltak lassú Golgi-szétesést kiváltani, még NAD + hiányában is az inkubációs közegben (nem látható). A BFA, amely feltételezhetően a permeabilizálás után megmaradt, a sejtek NAD + -ja elegendő lehet a Golgi-szétszerelés fenntartásához. Annak megvizsgálására, hogy a NAD + ezen hatása a nukleotid redoxireakciókban való részvételének köszönhető-e, az NADH (amely inaktív az ADP-szubsztrátjaként) riboszilezést) adtunk a NAD + -val együtt az oxidált nuklé kétszeres koncentrációjáig eotid. A NADH nem volt hatással a Golgi morfológiájára mind BFA jelenlétében, mind annak hiányában (nem látható).

BFA-függő ADP-ribozilezés permeabilizált sejtekben

Mivel az ADP-ribozilezést korábban csak sejthomogenátumokon vizsgálták, fontos volt ellenőrizni, hogy a reakció permeabilizált sejtekben is lejátszódik-e. A sejteket a morfológiai kísérletekhez használt körülmények között SLO-val porizáltuk, radioaktív NAD + -nak és BFA-nak tettük ki az permeabilizált sejtekben az EC50 kétszeres koncentrációjában, és értékeltük a GAPDH és a BARS-50 jelölését. A 3. ábra A 3 A ábra azt mutatja, hogy az ADP-riboziláció (a maximális szint ~ 10% -ánál) 20 perc elteltével egyértelműen kimutatható volt. Az erősebb jel hiányának oka lehet a BARS-50 (natív Mol Wt: ∼200 kD; Di Girolamo és mtsai, 1995) lassú cseréje az SLO által indukált pórusokon keresztül. Ez a BARS-50 hosszú állandóságát eredményezné a sejtben (az ADP-riboziláló enzim közvetlen közelében), és ezért az ADP-ribozilezett fehérje magas intracelluláris koncentrációját eredményezné, míg az extracelluláris citoszol ADP-riboszilezett lehet kisebb mértékben.

Az ADP-ribozilációs szubsztrátumok bevonása a BFA hatásaival a golgi morfológiára

A pre-ADP-ribozilezett citoszol helyettesíti a NAD + -ot a BFA Golgi-szétszerelő aktivitásának fenntartásában. A BARS-50 tartalmú kivonatok hatása. Az RBL sejteket 3 U/ml SLO-val permeabilizáltuk, és kontroll (a – c) vagy ADP-ribosilált (d – i) citozollal (1 mg/ml) inkubáltuk 20 percig 37 ° C-on, a és d hiányában. vagy 10 μg/ml BFA jelenlétében (b, c és e – i). A natív BARS-50-et (az Anyagok és módszerek szerint előállított és ADP-ribozilezett citoszollal tízszer hígított kivonatot) i-be (NAD + -val) és g-ba NAD + nélkül adtuk. AD-riboszilezett BARS-50-et (a natív BARS-50-et tartalmazó kivonattal megegyező kivonatot, de ADP-ribozilezett citozolból készített kivonatot; lásd: Anyagok és módszerek) h-hez adtuk. A sejteket rögzítettük és anti-Man II antitesttel jelöltük. Hasonló eredményeket kaptunk négy különböző kísérletben. Rúd, 5 μm.

A Coatomer szerepe

NAD + nem szükséges a BFA által indukált koatomer disszociációhoz a Golgi komplextől permeabilizált sejtekben. Az ép RBL-sejteket (a és b) 3 μg/ml BFA-val (b) kezeltük, vagy 3 U/ml SLO-val permeabilizáltuk, majd kontroll puffernek (c) vagy 150 μM NAD + -ot (e ), vagy 10 μg/ml BFA önmagában (d), vagy BFA 150 μM NAD + (f) -vel kombinálva. A sejteket rögzítettük, szaponinnal permeabilizáltuk és anti-β-COP antitesttel festettük. Az SLO permeabilizáció a β-COP részleges leválását indukálja a Golgi-komplexből (c) az ép sejtekhez képest (a), de a BFA teljesen hatékonyan indukálja a β-COP teljes citoszolos redisztribúcióját, függetlenül a NAD + jelenlététől a permeabilizációs pufferben (d és f). Az pre-ADP-ribozilezett citoszol (g és h) megkülönböztethetetlenül viselkedik a kontroll citozoltól. Hasonló eredményeket kaptunk permeabilizált CHO sejtekben (nem látható). A kísérleteket négyszer ismételtük meg, hasonló eredményekkel. Rúd, 5 μm.

A BFA-függő ADP-ribosiláció gátlói megakadályozzák a BFA által kiváltott Golgi szétszerelést. Az ADP-ribozilációs szubsztrátok szerepe

A dicumarol megakadályozza a BFA által kiváltott tubuláris-retikuláris transzformációt a Golgi-készülékben. Az RBL sejteket 30 percig 200 μM dikumarollal végzett előkezelés után 15 percen keresztül kezeltük a megadott BFA koncentrációval. Ezután elektronmikroszkópiára dolgozták fel őket. A dicumarol (és az ilimaquinone, nem látható) megakadályozza a Golgi-kötegek tubuláris-retikuláris átalakulását és eltűnését, amelyet a közepes (a), de nem a BFA (b) magas koncentrációja indukál. Hasonló eredményeket kaptak három független kísérletben, amelyeket két példányban futtattak. Rúd, 0,5 μm.

Az pre-ADP-ribozilezett citoszol megakadályozza, és a natív BARS-50 megmenti a dikumarol anti-BFA hatásait a permigilizált sejtekben a Golgi komplexre. Az RBL sejteket 3 U/ml SLO-val permeabilizáltuk, és 20 percig 37 ° C-on inkubáltuk BFA-t (10 μg/ml) és NAD + -ot (150 μM) tartalmazó táptalajban (a, c, e és g) vagy 200 μM dicumarollal (b, d, f és h) kontroll (a és b) vagy pre-ADP-ribosilezett (c – h) citoszol (1 mg/ml) jelenlétében. Egy natív BARS-50-tel dúsított kivonatot (lásd a 4. ábra 4. ábráját) adtunk az (e) és (f) pontokhoz, míg az ADP-riboszilezett BARS-50-et a (g) és (h) pontokhoz adtuk. A sejteket rögzítettük és anti-Man II antitesttel jelöltük. Hasonló eredményeket kaptunk három független kísérletben. Rúd, 5 μm.

Vita

NAD + szükséges a Golgi szétszereléséhez a BFA-nál

Az ADP-ribozilezett citoszol helyettesíti a NAD + -ot a BFA által kiváltott Golgi-szétszerelés támogatásában

Az ADP-riboziláció-gátlók megakadályozzák a BFA hatását a golgi szerkezetére, és a citoszolos ADP-ribozilációs szubsztrátokon keresztül hatnak.

A szubsztrát fehérjék ADP-ribozilációja a permeabilizált sejtekben történik

Összességében a fenti megállapítások a NAD + és az ADP-ribozilezett citoszol szerepéről erősen alátámasztják a NAD + és az ADP-ribosiláció szerepét a Golgi architektúrát ellenőrző BFA-érzékeny gépekben. Az ADP-ribozilezés azonban nem elegendő a toxin morfológiai hatásainak magyarázatához, mivel az ADP-ribozilezett citozol önmagában nem tudta kiváltani a BFA fenotípust. További mechanizmusokra van szükség, amelyek valószínűleg a koatomer BFA-indukálta disszociációját jelentik a Golgi-membránoktól, szükségesek a Golgi-megbontáshoz.

A Coatomer és a NAD + -függő mechanizmusok szerepe a Golgi szétszerelésében

A Golgi-apparátus bonyolultsága ellenére nagyon dinamikus organelle, amelyet a BFA gyors és visszafordítható hatásai mutatnak be a legdrámaibban. Ez a tanulmány azt sugallja, hogy a NAD + és az ADP-ribosiláció új tényezők a Golgi-komplex szerkezetét és különösen a BFA-val szembeni tubuláris-retikuláris transzformációját vezérlő gépezetben. Új kérdéseket vet fel a NAD + -függő szabályozás jelentőségével ezen organella fiziológiájában, valamint az ADP-ribosilációs fehérje szubsztrátok pontos szerepével (szerepeivel) kapcsolatban.