A pamut patkányok értékelése a súlyos akut légzőszervi szindróma modelljeként

D.M. Watts

1 Patológiai Osztály, Texas Egyetem Orvosi Osztálya, Galveston, Texas.

C. J. Peters

1 Patológiai Osztály, Texas Egyetem Orvosi Osztálya, Galveston, Texas.

P. Newman

1 Patológiai Osztály, Texas Egyetem Orvosi Osztálya, Galveston, Texas.

N. Wang

1 Patológiai Osztály, Texas Egyetem Orvosi Osztálya, Galveston, Texas.

N. Yoshikawa

1 Patológiai Osztály, Texas Egyetem Orvosi Osztálya, Galveston, Texas.

C.K. Tseng

1 Patológiai Osztály, Texas Egyetem Orvosi Osztálya, Galveston, Texas.

P. R. Wyde

2 Molekuláris Biológiai Tanszék, Baylor College of Medicine, Houston, Texas.

Absztrakt

Bevezetés

A súlyos akut légzési szindróma (SARS) 2002–2003 közötti kitörése után globális kutatási erőfeszítések folynak az emberi betegségek modellezésére alkalmas állatfajok létrehozására (Peiris et al. 2003). Számos laboratóriumi állatfajról kimutatták, hogy támogatják a kórokozó, a SARS koronavírus (SARS-CoV) replikációját, de az embernél jelentett betegséghez hasonló betegséget nem láttak (Roberts és mtsai 2008, Tseng és mtsai 2007, McCray és mtsai. al. 2007). Bár ezek a modellek hasznosnak bizonyultak a patogenezis tanulmányozásában, valamint a vírusellenes gyógyszerek és oltások értékelésében, az ötletmodell egyetlen alkalmas állatfaj lenne (Tseng et al. 2007). Ezért a jelen vizsgálat célja két pamut patkányfaj (Sigmodon hispidus és Sigmodon fulviventer) értékelése volt, hogy jobb modellt találjon a SARS-CoV fertőzésre és az emberhez hasonló SARS betegségre. A pamut patkányokat (S. hispidus) más légúti vírusos megbetegedések megfelelő modelljeként dokumentálták, kereskedelmi forrásokból beszerezhetők, és az immunválasz vizsgálatához reagensek állnak rendelkezésre (Niewiesk és Prince 2002, Ottolini et al. 2005, Blanco és mtsai 2004).

Mód

A kísérlet során a pamut patkányok, mint a SARS-CoV fertőzés és a betegség lehetséges modelljeinek értékelésével végzett kísérleti megközelítésünk először azt határozta meg, hogy bármelyik faj érzékeny-e fertőzésre. Ha fogékony, akkor egy második, részletesebb kísérletet végeztek a fertőzéssel összefüggő klinikai tünetek, a vírus biodisztribúciójának és esetleges patológiájának meghatározására.

Állatok

Az első és a második kísérletben használt hím és nőstény beltenyésztett Sigmodon hispidus-t egy ismeretlen nemzedékű tenyésztő telepből nyertük a texasi University of Texas Medical Branch (UTMB) (Galveston, Texas), illetve a virioni rendszerek (Rockville, Maryland) rendjéből. A Sigmodon fulviventert, beleértve a hímeket és nőstényeket, ismeretlen generációs tenyésztelepekből nyertük, amelyeket a Virion Systems Inc.-nél tartottak fenn. A Virion Systems-től vásárolt pamut patkányokat igazolták, hogy szeronegatívak az esetleges vírusok szempontjából. Az állatokat nagy polikarbonát ketrecekben helyezték el, standard rágcsáló-chow-val és vízzel etették őket, és 6-12 hetes korukban használták őket. Ebben a korosztályban a pamut patkányok súlya körülbelül 100–150 g volt; életkor és súly szerint egyeztették őket a különböző csoportokban történő felhasználáshoz. Az állatokat minden manipulációhoz izofluránnal altattuk, és izoflurán fulladással feláldoztuk a szövetminták gyűjtésére. Minden állatkísérletet az UTMB Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottság hagyott jóvá.

Vírus- és szövetkultúrák

A SARS-CoV Urbani törzsét a Vero 2. passzázs szintjén (T.G. Ksiazek, Betegségmegelőzési és Megelőzési Központok szívesen szolgáltatták) használták ebben a vizsgálatban. A Vero E6 sejteket (American Type Culture Collection) használtuk fel a SARS-CoV vírusállományok előállítására és a vírusfertőzőségi vizsgálatokra a vírusspecifikus citopátiás hatás megfigyelésén alapulva, az előzőekben leírtak szerint (Tseng et al. 2007). Az állományokat úgy készítettük el, hogy a vírust kétszer passzáltuk Vero E6 sejtekben 0,001-es fertőzés sokaságával (4. passzus), és a titert 50% -os szöveti tenyészet fertőző dózisban (TCID50)/ml fejeztük ki. A törzsvírust alikvotizáltuk és -80 ° C-on tároltuk a kísérletek felhasználásáig. Amellett, hogy az állati vírust inokulumként használtuk az állatok fertőzéséhez, és a semlegesítési tesztben, minden egyes alkalommal külön alikvot részt titráltunk, amikor a vér- és szövetmintákat teszteltük, hogy kontrollként szolgáljunk a fertőzőségi vizsgálat megfelelő működésének ellenőrzésére. Az összes fertőző vírust tartalmazó kísérletet az UTMB 3. szintű biológiai biztonsággal foglalkozó laboratóriumában végezték.

Eljárások

Minden állatból vért, turbinás mosómintákat és szöveteket gyűjtöttünk, beleértve a tüdőt, a szívet, a májat, a lépet és a vese-t a vírusfertőzőség vizsgálatára Vero E6 sejtekben (Tseng et al. 2007). Mindegyik vért és turbinát 1: 10 arányban hígítottuk 10% FCS-sel, valamint sztreptomicinnel és penicillinnel (100 mg/ml) kiegészített steril PBS-sel. A szövetmintákat steril fiolákba helyeztük; az összes mintát azonnal -80 ° C-on tároltuk, amíg homogenizáltuk és teszteltük a vírust. Megvizsgálás után a mintákat gyorsan felolvasztották, megmérték és 10% FCS-sel kiegészített steril PBS-ben homogenizálták TissueLyser alkalmazásával, így 10% szövet/PBS szuszpenziót kaptak. A szuszpenziót centrifugálással tisztítottuk, majd Vero sejtekben teszteltük. Az egyes minták vírustiterét TCID50-ben fejeztük ki a szuszpenzió milliliterenként. Ezenkívül a tüdő, a szív, a máj, a lép és a vese mintáit vettük, 10% semleges pufferolt formalinba helyeztük 72 órán át, majd 70% -os etanolba helyeztük szövettani elemzés céljából az alábbiakban leírtak szerint. Valamennyi állatot naponta megfigyelték a betegség jelei szempontjából, és egyes kísérletek során az állatokat naponta lemérték; a fennmaradó állatokat minden kísérlet végén inhalációs úton izoflurán túladagolással eutanizálták.

Szövettan és IHC

A SARS-CoV beoltott és kontroll állatokból nyert szöveteket, beleértve a tüdőt, a szívet, a májat, a lépet és a vesét, szövettani és immunhisztokémiai (IHC) módszerekkel dolgoztuk fel publikált technikákkal (Tseng és mtsai 2007, Subbarao és mtsai 2004). . A szöveti metszeteket 10% -os pufferolt formalinban rögzítettük 72 órán át, 70% -os etanolba helyeztük, majd később paraffinba ágyazottuk. A hisztopatológiai értékelést deparaffinizált szakaszokon végeztük rutin hematoxylin- és eozinfestéssel. A SARS-CoV IHC tesztelésére egy korábban leírt kolorimetriás indirekt immunoalkalin-foszfatáz módszert (Tseng és mtsai 2007) használtunk nyúl anti-SARS-CoV nukleokapszid fehérje antitesttel (Imgenex, katalógusszám: IMG-548). Normál egér- és kecskeszérumokat használtunk negatív kontrollként, SARS-CoV antigén pozitív Vero sejteket használtunk pozitív kontrollként. Elsődleges antitesteket vagy biotinilezett sertés nyúlellenes immunglobulinnal (DAKO katalógusszám: E0353), vagy nyúl anti-kecske immunglobulin (KPL katalógusszám: 16-13-06) szekunder antitestekkel detektáltunk. A vizualizációt ezután sztreptavidin-lúgos foszfatázzal és naftol-gyors vörös szubsztráttal (DAKO) inkubálva érték el, miután Mayer hematoxilinnel (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) inkubáltuk.

Eredmények

1. kísérlet

Az UTMB kolóniából származó Sigmodon hispidus egy floridai patkánytól származott. Ennek a fajnak a SARS-CoV fertőzésre való hajlamának értékelésére szolgáló kísérleti kísérletként összesen 16 állatot oltottunk be intranazális úton 100 μl-rel, amely 106 szöveti tenyész adagot50 (TCID50) tartalmazott SARS-CoV-ból, és két kontrollállatot. 10% FCS-sel és antibiotikumokkal kiegészített sóoldattal oltottuk be (1. táblázat). A kísérlet során az állatok közül hat - köztük a két kontroll - ismeretlen okokból elhunyt. Annak lehetőségét, hogy a SARS-CoV-ben haltak meg, kizárták, mert a Vero sejt assay segítségével nem sikerült kimutatni a vírust az elvágott szövetekben. Ezenkívül hasonló mortalitási mintát figyeltek meg az UTMB pamut patkány kolóniájában. A P.I. 21. napig túlélő 10 állat közül egyik sem mutatta betegség jeleit, és a 21. napon vett vérminták negatívak voltak a SARS-CoV antitestre nézve. Az UTMB kolóniából származó pamut patkányokkal további kísérleteket nem végeztek a telep megkérdőjelezhető egészségi állapota miatt.

Asztal 1.

Kísérleti tanulmányok összefoglalása a Sigmodon hispidus és a Sigmodon fulviventer értékelésére a SARS-betegség modelljeként

KísérletFajok (n) a Jelek b Fogyás c Vírusizoláció d IHC e Patológia f Antitest g

1	S. hispidus (16)	Egyik sem	Nincs kész	Nincs kész	Neg	Nincs kész	Nincs kész
2	S. hispidus (15)	Egyik sem	Egyik sem	Pozitív	Neg	Egyik sem	Negatív
3	S. fulviventer (12)	Egyik sem	Nincs kész	Negatív	Neg	Nincs kész	1/80 - 1/360
4	S. fulviventer (20)	Egyik sem	Egyik sem	Negatív	Neg	Pozitív	1/40 - 1/160

2. kísérlet

3. kísérlet

A Sigmodon fulviventer SARS-CoV fertőzésre való érzékenységének felmérésére szolgáló kísérleti kísérletként 12 állatot oltattunk be IN-be 106 TCID50 SARS-CoV-vel, és két kontrollállatot oltottunk be PBS 10% FCS-sel és antibiotikumokkal (1. táblázat). 21 napos megfigyelési időszak alatt egyik állatnál sem jelentkeztek betegség jelei. Azonban a 21. napon a mind a 10 vizsgált állat vérmintájánál kimutatható antitest volt, amelynek titerje 1/80 és 1/360 között volt, és a két kontroll antitestre negatív volt. Így a pozitív szerológiai adatok azt jelezték, hogy az S fulviventer hajlamos a SARS-CoV fertőzésre. Ezért egy második kísérletet hajtottak végre az S fulviventer további értékelésére.

4. kísérlet

Vita

Az emberi fajok SARS-betegség modellezésére irányuló állatfajták azonosítására irányuló erőfeszítések számos általános laboratóriumi állatot alkalmaztak, egerektől kezdve a főemlősökig (Roberts et al. 2008). Néhány állat (pl. Hörcsög, idős egerek, SARS-CoV hACE2 receptorral rendelkező transzgénikus egerek és sorozatban passzált adaptált vírussal fertőzött egerek) újabban ígéretes eredményeket hoztak betegségmodellként (Roberts et al. 2008, Tseng et al. 2007, McCray és mtsai 2007).

Első kísérletünkben a S. hispidus-ban semlegesítő antitestet nem mutattunk ki a 21. napon a SARS-CoV 106 TCID50-nek való kitettségét követően. Mivel ezeknek az állatoknak az egészségi állapota gyanús volt, és nem volt bizonyíték a fertőzésre, nem végeztek újabb kísérleteket az UTMB kolóniából származó állatokkal. Ezért egy második kísérletet végeztek a kereskedelemben vásárolt S. hispidus-szal. Hasonlóképpen semlegesítő antitestet nem detektáltunk a 21. napon a TCS50 SARS-CoV 106 TCID50-nek való expozíciója után, ami azt jelzi, hogy ez a faj nem volt hajlamos a fertőzésre a vírus ezen adagjának alkalmazásával. Ezzel szemben két egymást követő kísérletben a S. fulviventer megfertőződött ugyanolyan vírusdózisnak való kitettség után, mint azt az antitest kimutatása állatokban a vírusnak való kitettség utáni 21. napon jelezte. Annak ellenére, hogy a fertőzést kimutatták, egyik állat sem mutatta betegség jeleit, és a kiválasztott szövetekben sem volt egyértelmű bizonyíték a vírusreplikációra. A két faj SARS-CoV iránti érzékenységében mutatkozó különbség oka ismeretlen. A két faj neme és kora azonos volt. Míg az állatok generációja eltérhetett volna, a fogékonyságra gyakorolt lehetséges hatás, ha van ilyen, nem ismert.

Ha a fertőzött S. fulviventer nem tudott lefogyni, mint a klinikai betegség lehetséges bizonyítéka a SARS-CoV 106 TCID50-nek való kitettségét követően, ellentmondott azoknak a megfigyeléseknek, amelyek szerint a letálisan fertőzött transzgénikus egerek a testsúly 40% -át vesztették hasonló dózisú fertőzés után. ugyanaz a vírustörzs (Tseng et al. 2007). Ezenkívül a transzgénikus egerek egyéb törzseinek jellemzésére irányuló újabb tanulmányainkban, amelyekben nem alakult ki halálos fertőzés, a súlycsökkenés a SARS-CoV fertőzés következetes mutatója volt (Tseng et al., 2007). Mások szerint a súlycsökkenés a SARS-CoV klinikai eredménye fertőzött beltenyésztett egerekben (Roberts et al. 2008). Bár a súlycsökkenés megbízható mutatója a SARS-CoV fertőzésnek egyes egerekben, ezek az eredmények nem feltétlenül alkalmazhatók pamut patkányokra. Például a pamut patkányok kiváló modelljei a légzőszervi vírusoknak, például a légúti syncytialis vírusnak (RSV) és a humán metapneumovírusnak (HMPV), de ezekkel a vírusokkal való fertőzés nem eredményez súlycsökkenést. Így a súlycsökkenést óvatosan kell értelmezni, mivel az emlős fajok közötti válaszváltozás lehetősége fennáll.