A polydatin csillapítja a diéta okozta alkoholmentes steatohepatitist és fibrózist egerekben

Rui Li 1, Jingzhi Li 3, Yiji Huang 1, Hui Li 2, Sishan Yan 1, Jiaxin Lin 1, Ying Chen 1, Limin Wu 4, Bing Liu 1, Genshu Wang 2, Tian Lan 1

1. Farmakológiai Tanszék, Gyógyszerészeti Iskola, Guangdong Gyógyszerészeti Egyetem, Guangzhou 510006, Kína.
2. a Sun Yat-sen Egyetem Harmadik Társult Kórházának Májsebészeti és Májtranszplantációs Központja; Guangzhou 510630, Kína.
3. Ápolóiskola, Guangdong Gyógyszerészeti Egyetem, Kanton 510006, Kína.
4. Guangdong ShowYong Nature Medical Technology Co., Ltd., Foshan 528000, Kína

Idézet:
Li R, Li J, Huang Y, Li H, Yan S, Lin J, Chen Y, Wu L, Liu B, Wang G, Lan T. A polydatin enyhíti a diéta okozta alkoholmentes steatohepatitist és fibrózist egerekben. Int J Biol Sci 2018; 14 (11): 1411-1425. doi: 10,7150/ijbs.26086. Elérhető a https://www.ijbs.com/v14p1411.htm oldalon

Hatály: Az alkoholmentes steatohepatitist (NASH) a májsejtekben lévő lipidfelhalmozódás és a gyulladásos sejtek beszivárgása jellemzi.

Tekintettel a polydatin antioxidáns és gyulladáscsökkentő hatására, a jelenlegi tanulmány célja a polydatin NASH-ra és annak fibrózisára gyakorolt farmakológiai hatásainak vizsgálata volt.

Mód: A C57BL/6 egereket metionin-kolinhiányos (MCD) táplálékkal etették a NASH és a májfibrózis kiváltására, és polidatinnal (5 mg/kg, minden másnap, i.p.) 4 hétig kezelték őket. A palmitinsav (PA) által indukált HepG2 sejteket polidatinnal kezeltük.

Eredmények: A szérum alanin-aminotranszferáz (ALT) és az aszpartát-aminotranszferáz (AST), az aktív kaszpáz-3, a TUNEL-pozitív sejtek és a triglicerid tartalom emelkedését csökkentette a polydatin kezelés. Ezenkívül a polydatin MCD-vel táplált egereknek történő beadása csökkentette az oxidatív stresszt az NOX4 enzimek lefelé történő szabályozásával. Ezenkívül a gyulladás csökkenése és a CD68 makrofág aktiváció korrelációban áll a toll-szerű receptor (TLR) -4/NF-KB p65 jelátviteli út gátlásával polydatin kezeléssel. A polydatin szintén csillapította a lipid felhalmozódást, a gyulladást és az apoptózist a palmitinsavval (PA) és lipopoliszachariddal (LPS) kombinálva vagy anélkül kombinált HepG2 sejtekben. Végül a máj fibrózisának csökkentése polydatin kezeléssel megfelelt a fibrózis markerek máj gén expressziójának csökkenésének.

Következtetések: Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a polydatin megakadályozza a NASH-t és a fibrózist az oxidatív stressz és gyulladás gátlásán keresztül, kiemelve a polydatint mint a NASH megelőzésének és kezelésének lehetséges terápiás szerét.

Kulcsszavak: Polydatin, NASH, gyulladás, oxidatív stressz, apoptózis, májfibrózis.

Az oxidatív stressz mellett a gyulladás is kiemelkedő szerepet játszik a NASH-ban. A NASH-ban szenvedő betegeknél gyakran megfigyelhető a jól ismert gyulladásinduktor, a vér lipopoliszacharidjának (LPS) emelkedett szintje [4, 5]. A Toll-szerű receptor 4 (TLR4) az LPS mintázat-felismerő receptora, és a veleszületett immunjelzés aktiválását indukálja a MyD88 adaptív fehérjék és a TIR-domént tartalmazó adaptert indukáló interferon-b (TRIF) révén [6]. Korábbi tanulmányok egyértelműen igazolták a TLR4 és a MyD88 kritikus szerepét a NASH és a kapcsolódó fibrózis elősegítésében [7, 8]. Ezek az eredmények jól bemutatták a TLR4 és ROS jelátvitel releváns szerepét a NASH progressziójának elősegítésében.

A polydatin, egy resveratrol-glükozid (resveratrol-3-O-β-mono-D-glükozid), egy aktív komponens, amelyet a Polygonum gyökereiből egy cuspidatum Sieb izolál. et Zucc. A sejtekbe passzívan behatoló resveratrollal ellentétben a polydatin aktív mechanizmuson keresztül jut be a sejtekbe glükózhordozó segítségével [9]. Ezenkívül a polydatin jobban ellenáll az enzimatikus oxidációnak, mint a resveratrol, és sokkal jobban oldódik vízben.

Korábban azt tapasztaltuk, hogy a polydatin az oxidatív stressz és a gyulladás gátlásával véd az egerek májfibrózisától. Nemrégiben egy csoport azt javasolta, hogy a polydatin az inzulinrezisztencia és a lipid-anyagcsere gátlásával javíthatja a patkányok étrendje által kiváltott NAFLD-t [10, 11]. A polydatin terápiás szerepét a metionin- és kolinhiányos (MCD) által kiváltott máj steatohepatitisben és fibrózisban, valamint mögöttes mechanizmusát, különösen az antioxidáns és gyulladáscsökkentő funkcióval kapcsolatban, még nem határozták meg egyértelműen. Ez a tanulmány ezért értékeli a polydatin steatohepatitisre és fibrózisra gyakorolt hatását egerekben, amelyeket MCD-étrend indukált, és HepG2-sejteket, amelyeket palmitinsav (PA) indukált.

Anyagok és reagensek

Állatok és kezelés

Minden állatkísérletet a kínai állatjóléti jogszabályoknak megfelelően hajtottak végre, és a laboratóriumi állatok gondozásával és felhasználásával foglalkozó etikai bizottság jóváhagyta a Guangdongi Gyógyszerészeti Egyetemen (Guangzhou, Kína). A C57BL/6 egereket (28 hím, 10 hetes, 25-27 g) a kínai Guangdong tartomány Kísérleti Állatok Központjától vásároltuk. Az egereket szabályozott hőmérsékletű környezetben (22 ± 2 ° C) helyeztük el, standard 12 órás világos/sötét körülmények között, és ad libitum táplálékot és vizet kaptunk. Az egereket 4 hétig metionin-kolinhiányos étrenddel (MCD) etették a NASH kiváltása érdekében (n = 10). Az egereket metioninnal és kolin-kiegészítéssel (MCS) etettük kontrollként (n = 8). A kezelt csoportban (n = 10) az egereket intraperitoneálisan injektáltuk polidatinnal (5 mg/kg, sóoldatban oldva) minden egyes indukált MCD-étrendet követően. A kezeletlen csoportokban lévő egereket ugyanolyan térfogatú sóoldattal adtuk be, mint a vivőanyag-kontroll.

Szérum biokémia

Az alanin-aminotranszferáz (ALT), a trigliceridek (TG) és az aszpartát-aminotranszferáz (AST) szérumszintjét standard enzimatikus eljárásokkal mértük a gyártás utasításai szerint (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kína).

Hidroxiprolin assay

A máj hidroxiprolin tartalmát kereskedelmi hidroxi-prolin vizsgálati készlet segítségével mértük a gyártó utasításai szerint (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kína). Röviden, a májmintákat 95 ° C-on 20 percig hidrolizáltuk, majd pH-ját 6,5-re állítottuk és aktív szénen szűrtük. Centrifugálás után a felülúszót detektáló folyadékkal összekevertük és 60 ° C-on 15 percig inkubáltuk. Végül a mintákat mikrolemez-olvasóval mértük 550 nm-en.

Caspase3 aktivitás elemzése

A máj kaszpáz3 aktivitását kaszpáz3 aktivitás vizsgálati készlet segítségével mértük a gyártó utasításainak megfelelően (Bestbio, Kína). Röviden, a májszöveteket ledaráltuk és centrifugáltuk 12000 fordulat/perc sebességgel, a felülúszót 405 nm-nél detektáltuk.

Sejtkultúra és kezelés

A HepG2 humán hepatocelluláris karcinóma sejtvonalat (Sanghaji Biokémiai és Sejtbiológiai Intézet, Sanghaj, Kína) 10% magzati szarvasmarha szérummal és 1% penicillin-sztreptomicinnel kiegészített DMEM sejtekben tenyésztettük 5% CO2 inkubátorban, 37 ° C-on. Az 5 mM palmatinsav (PA)/5% BSA törzsoldatait 15 percig 55 ° C-on melegítettük, majd szobahőmérsékletre hűtöttük, így kaptuk a PA-BSA komplexet. A PA-BSA keveréket szérumtartalmú sejttenyésztő tápközeghez adtuk 250 μM végkoncentrációig. A sejteket 12 órán át szérummentes DMEM-ben éheztettük, majd további 24 órán át PA-indukciót hajtottunk végre polidatin (5, 10, 20 uM) hiányában vagy jelenlétében. 5% BSA-t tartalmazó táptalajban tartott HepG2 sejtek kontrollként szolgáltak. A laktát-dehidrogenázt (LDH) és a triglicerideket (TG) standard enzimes eljárásokkal mértük a gyártás utasításai szerint (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kína).

Western blot elemzés

A májszöveteket vagy sejteket RIPA pufferben lizáltuk. A lizátumokat centrifugáltuk (12 000 x g 20 percig 4 ° C-on), és a felülúszót összegyűjtöttük. Az összes fehérje azonos mennyiségét (30 ug) SDS-PAGE-val frakcionáltuk, majd polivinilidén-difluorid (PVDF) membránokra vezettük (Millipore Corp, Bedford, MA, USA). Miután a membránokat 5% nem zsíros tejjel Tisz-20 pufferolt fiziológiás sóoldatban blokkoltuk 1 órán át szobahőmérsékleten, a membránokat primer antitestekkel inkubáltuk 4 ° C-on egy éjszakán át, majd szekunder antitestekkel inkubáltuk (1: 5000 hígítás). 1 órán át szobahőmérsékleten. A sávokat fokozott kemilumineszcens (ECL) módszerrel (Bio-Rad, USA) detektáltuk és kemilumineszcencia rendszerrel rögzítettük (New Life Science Products, Boston, MA, USA).

Hisztopatológia

A májszövetet 10% -os formalinban rögzítettük, paraffinba ágyazottuk, metszettük, és hematoxilinnal és eozinnal (H&E) festettük egy szokásos eljárás szerint. A májelváltozások szövettani pontozását szövettanilag a NASH aktivitási pontszám (NAS) alapján értékeltük, a leírtak szerint [26]. A NAS három szövettani jellemző értékelését tartalmazta: steatosis (0-3), hepatocelluláris ballonozás (0-2) és lobularis gyulladás (0-3). Az 5-nél magasabb pontszámú mintákat „NASH” -nak, a -ΔΔCt) ponttal rendelkező mintákat jelöljük. GAPDH-t használtunk belső kontrollként. A PCR-primerek szekvenciáját az 1. táblázatban foglaltuk össze.

Az apoptózis áramlási citometriai elemzése

Fluoreszcein-izotiocianát (FITC) Annexin-V apoptózis detektáló készletet (Keygentec, Kína) használtunk a gyártó utasításainak megfelelően az apoptózis értékelésére. A HepG2 sejteket 6 lyukú lemezeken tenyésztettük 24 órán át, majd vivőanyaggal, PA-val vagy polidatinnal inkubáltuk. 24 óra elteltével a HepG2 sejteket összegyűjtöttük és hideg PBS-sel mostuk. A sejteket 1 ml 1 x kötőpufferben szuszpendáltuk. Az újraszuszpendált sejteket (100 μl) egy 5 ml-es tenyésztőcsőbe helyeztük, és az Annexin V-FITC-t (5 μl) és a propídium-jodidot (PI, 5 μl) adtuk hozzá. A sejteket vortexeljük és 15 percig sötétben inkubáljuk. Megkötő puffert (400 μl) adtunk minden csőhöz. Az áramlási citometriás elemzést közvetlenül a festés után végeztük. Az adatgyűjtést és -elemzést fluoreszcenciával aktivált sejtszkenner (FACS) áramlási citométerrel (Becton Dickinson, San Jose, Kalifornia, USA) végeztük. Az apoptózis korai stádiumában lévő sejtek Annexin V-pozitív és PI-negatívak voltak, míg az apoptózis késői szakaszában lévő sejtek pozitívak mind az Annexin V-re, mind a PI-re. PI megfestette a nekrotikus sejteket.

Statisztikai analízis

Valamennyi kísérletet legalább három példányban hajtottuk végre, és az eredményeket átlag ± standard eltérésként (SD) fejezzük ki. Két csoport közötti statisztikai különbségeket a páros nélküli hallgatók elemezték t tesztet és a több adatcsoport közötti különbségeket egyirányú ANOVA-val elemeztük Bonferroni korrekcióval (GraphPad Prism 5.0). P ## o ### o #### o * o ** o **** o # o ### o #### o * o ** o # o #### o * o ** o *** o # o ## o #### o * o ** o *** o # o ## o ### o #### o * o ** o *** o # o ## o ### o #### o * o ** o *** o ### o #### o * o **** o # o ## o ### o #### o * o ** o *** o * o *** o **** o

Megkapta 2018-3-15
Elfogadva 2018-7-8
Megjelent 2018-7-30