American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine

Absztrakt

Cisztás fibrózisban (CF) a cisztás fibrózis transzmembrán vezetőképesség-szabályozó (CFTR) hibás működése a légúti hámsejtekben és a nyálkahártya mirigyekben krónikus légúti megbetegedést eredményez, amely a légutak elzáródásával és a tüdő és az orrmelléküregek visszatérő fertőzéseivel jár (1). ), amely az élet elején kezdődik (2). A CF tüdő különösen érzékeny a Pseudomonas aeruginosa, és ez a szervezet kritikus szerepet játszik a tüdőbetegség kialakulásában és progressziójában CF-ben (1). A CF-ben szenvedők endobronchialis fertőzést kapnak, amely intenzív gyulladásos választ vált ki, amely túlzottnak tűnik (3). Az endobronchialis fertőzés állatmodelljei Pseudomonas aeruginosa hasonló hisztopatológiai jellemzőkkel rendelkeznek, mint a CF-ben szenvedő betegek tüdejében (4, 5), és ezeket a betegségre jellemző tüdőgyulladás tanulmányozására használták (6-8).

Ezenkívül számos kutató megjegyezte, hogy az állatok beoltottak Pseudomonas-megrakott agaróz gyöngyök lényegesen nagyobb súlyt vesztettek, mint a steril gyöngyökkel kezelt kontroll állatok (6, 7). A súlycsökkenés mechanizmusa ebben az állatmodellben azonban bizonytalan. A növekedési kudarc továbbra is jelentős probléma a CF-ben, és a krónikus alultápláltság is társult a tüdőbetegség progressziójával (9, 10). A pulmonalis exacerbációkkal járó tényezők, például fertőzés, gyulladás és a fokozott légzési munka megnövekedett energiafogyasztáshoz és csökkent kalóriabevitelhez vezethetnek. Valójában azt javasolták, hogy az ilyen exacerbációk a táplálkozási állapot és a tüdőfunkció további romlását eredményezzék CF-ben szenvedő betegeknél (11, 12). Mivel ugyanazok a tényezők, amelyek ezekben az állatokban a cachexiát okozzák, szintén hozzájárulhatnak a CF-ben szenvedő betegek pulmonalis exacerbációi során megfigyelt súlycsökkenéshez, értékeltük a fertőzés, a gyulladás és a megváltozott tüdőrezisztencia összefüggését a súlyvesztés során. bronchopulmonáris fertőzés Pseudomonas egerekben.

A Charles River Laboratories-tól (Bar Harbor, ME) vásárolt hím C57BL/6 egereket (6-8 hét), autoklávozott Purina Mouse Chow 5010-vel etettük, és mindig steril víz állt rendelkezésre. Az összes egeret statikus mikroizolátor egységekben tartottuk fenn.

A krónikus agarózgyöngy modellje Pseudomonas endobronchialis fertőzést Cash és munkatársai fejlesztették ki (4), egerekre Starke és munkatársai módosították (5). Ezt a modellt alkalmazták krónikus tüdőfertőzés létrehozására egerekben, több variációval. Röviden, az agarózt triptikus szójalevessel (TSB) kevertük steril gyöngyökért, vagy TSB-vel, amely mukoidot tartalmaz P. aeruginosa az M57-15 törzs, egy CF-ben szenvedő beteg klinikai izolátuma, késői log fázisig nőtt. Az agaróz-húsleves elegyet ásványi olajhoz adtuk, amelyet 50 ° C-on egyensúlyba hoztunk, szobahőmérsékleten gyorsan 6 percig keverjük, majd 10 perc alatt lehűtjük. Az agaróz gyöngyöket egyszer 0,5% dezoxi-kolsavval, nátrium-sóval (SDC) mossuk foszfáttal pufferolt sóoldatban, pH 7,4 (PBS), egyszer 0,25% SDC-vel PBS-ben, és négyszer PBS-sel. A gyöngyöket fénymikroszkóppal 93–166 μm átmérőjűnek mértük. A kvantitatív bakteriológiát homogenizált gyöngyszuszpenzió alikvot részén végeztük, hogy meghatározzuk a kolóniaképző egységek (CFU)/milliliter számát (körülbelül 1,3 × 107 CFU/ml iszap). A steril gyöngykészítmények sterilnek bizonyultak.

Összesen nyolc kísérletet hajtottak végre a fogyás, a bakteriológia és a gyulladásos paraméterek értékelésére. E kísérletek eredményeit egyesítettük. Nem minden kimenetel mértéke volt azonos minden kísérlet esetében. Összesen 18 kezeletlen egeret öltek meg. Hetvenhét egeret steril gyöngyökkel oltottak be, ebből hárman posztoperatív szövődmények miatt haltak meg. 96 egeret oltottunk be Pseudomonas-megrakott agaróz gyöngyök. Ezek közül hat posztoperatív szövődményben halt meg, hét technikai nehézségek miatt nem megfelelő módon fertőzött meg, kettőt a fertőzés után 4 nappal a folyamatos fogyás és a rossz klinikai tünetek miatt öltek meg, hármat pedig 6-7 nappal holtan találtak a fertőzés után a masszív tömeg következtében tüdő érintettség.

Tüdőmechanikában 12 kezeletlen egeret vizsgáltak, amelyek közül 10 túlélte az eljárást. A steril gyöngyökkel sikeresen beoltott 33 egérből 26-ot sikeresen teszteltünk, és a 38 egérből, P. aeruginosa-terhelt agaróz gyöngyök, 33 kielégítően teljesítették a tesztet. Azok az egerek, amelyek nem élték túl a vizsgálati eljárást, elpusztultak vagy az érzéstelenítés problémái miatt, vagy azért, mert technikai nehézségek miatt képtelenek voltak kanülálni a légcsövet. Ezeket az egereket nem vették fel az elemzésbe.

A BAL után a tüdőt 2% paraformaldehidben PBS-ben legalább 48 órán át infláció-rögzítéssel rögzítettük, majd egyszer középsagittálisan felvágtuk és paraffinba ágyazottuk. A szöveti metszeteket a teljes szövetblokkban levágtuk úgy, hogy 5 μm-es metszeteket vettünk rendszeres időközönként, amely felölelte a metszetek teljes craniocaudalis tartományát. A metszeteket standard technikák alkalmazásával hematoxilin-eozinnal festettük, és megvizsgáltuk hisztopatológiai változásokat.

A beágyazott agarózgyöngyökkel beoltott egerek tüdeje P. aeruginosa aszeptikus úton kivágtuk és 40 ml normál sóoldatban pH = 7,4-en homogenizáltuk, és a tüdő- és BAL-homogenizátumok mintáit kvantitatív tenyésztéssel kezeltük soros hígítással MacConkey-agar lemezeken. A lépeket eltávolítottuk és 1,0 ml steril PBS-ben homogenizáltuk. A lép homogenizátum 10 μl-es alikvot részét triptikus szója agar (TSA) lemezekre vittük fel. A vért is összegyűjtötték és TSA lemezekre csíkozták. A steril gyöngyökkel beoltott egerek tüdejét aszeptikusan kivágtuk, 20 ml steril PBS-ben (7,4 pH-értéken) homogenizáltuk és TSA lemezekre helyeztük két példányban. A lemezeket 37 ° C-on inkubáltuk és megvizsgáltuk P. aeruginosa telepek legalább 24 óra elteltével.

1. ábra A kezdeti testtömeg százalékos változása. A C57BL/6 egereket csak altatással oltottuk be (zárt gyémántok) (n = 6–7), steril agaróz gyöngyök (zárt körök) (n = 11-34) vagy P. aeruginosa-megrakott agaróz gyöngyök (zárt háromszögek) (n = 7-34) és lemértük. Az egerek lefogytak az intratracheális beoltás után Pseudomonas-megrakott agaróz gyöngyök, amelyek az oltás után 3 napot értek el (-13,7 ± 1,3%). A steril gyöngyökkel kezelt egerek az oltás után szintén 3 nappal lefogytak (-4,6 ± 0,7%). Az önmagában anesztéziával kezelt kontroll egerek az injekció beadása után 1 nappal lefogytak (-1,5 ± 0,5%), de ezt követően híztak. A szignifikancia meghatározásához egyirányú ANOVA-t alkalmaztunk (p ‡ Jelentősen különbözik a steril agarózgyöngyökkel kezelt egerektől.

A tüdőbaktériumok száma maximum 3 nap volt az egerek beoltása után P. aeruginosa (2. ábra) és 4 d-nél csökkent, de Pseudomonas fertőzött gyöngyökkel történő beoltás után még 7 nappal elkülönítettük. Csak három, steril gyöngyökkel kezelt egernél volt egyetlen baktériumtelep a tenyészeten; a többi kultúrnegatív volt. Hét kezeletlen állatból származó BAL tenyészet-negatív volt. Egyetlen egérnek sem volt pozitív tenyészete P. aeruginosa (n = 11). Csak egy egérben volt pozitív homogén lép lép Pseudomonas 3 nappal fertőzött gyöngyökkel történő oltás után.

5. ábra: Az egér tüdejének hisztopatológiája intratracheális inokuláció után Pseudomonas-megrakott gyöngyök. A mikroszkópos felvételek a C57BL/6 egerek reprezentatív tüdőszekcióit mutatják, amelyeket steril oltással (A és B) vagy P. aeruginosa-terhelt (C és D) agaróz gyöngyöket és megölt 3 (A és C ) vagy 10 nap (B és D) a későbbiekben. Az egerekből tüdőt gyűjtöttünk, és a hematoxilin-eozinnal festett metszetek mikroszkópos vizsgálatával megvizsgáltuk a hisztopatológia bizonyítékát. Steril gyöngyök (zárt nyilak) enyhe, lokális mononukleáris beszivárgással jártak a légutakban, míg P. aeruginosa-terhelt gyöngyök (nyitott nyilak) kiterjedtebb peribronchialis és endobronchialis gyulladást, valamint neutrofil infiltrációt eredményezett a szomszédos parenchymában.

Nem volt különbség a kiindulási teljes tüdőrezisztenciában a kezeletlen egerek (1,23 ± 0,06 cm H2O/ml/s) vagy a steril vagy P. aeruginosa-terhelt agaróz gyöngyök 2 nappal a kezelés után (1,13 ± 0,08 cm H2O/ml/s és 2,95 ± 1,32 cm H2O/ml/s), vagy bármely más vizsgált időpontban. A karbachol intravénás beadásának hatását a tüdő 2., 7., 14. vagy 21. d tüdőreaktivitására a 6. A., 6B., 6C. És 6D. Ábra szemlélteti, az állatok steril oltása után (n = 12, 4, 8, 3., ill Pseudomonas-megrakott (n = 10, 10, 8, 6, illetve) agaróz gyöngyök. Nem volt szignifikáns különbség az Rl vagy a Cdyn között a kezelt egerek között Pseudomonas-terhelt agarózgyöngyök és steril agarózgyöngyökkel kezelt egerek a vizsgált időpontok bármelyikében. A beadott karbachol legmagasabb koncentrációja (1 μg/testtömeg-g) kezeletlen egerekben mérsékelt Rl-növekedést és Cdyn-csökkenést váltott ki, és nem volt különbség a kezeletlen egerek és a steril agarózgyöngyökkel oltott egerek között (az adatokat nem mutatjuk be).

6. ábra: Pulmonalis túlérzékenység a karbachollal szemben. A karbachol intravénás alkalmazásának a tüdőrezisztenciára gyakorolt hatásait egerek beoltása után értékelték (A) 2 d, (B) 7 nap, (C ) 14 d, vagy (D) 21 nappal steril oltás után (zárt körök) (n = 12, 4, 8, 3, ill Pseudomonas-terhelt (zárt háromszögek) (n = 10, 10, 8, illetve 6) agaróz gyöngy. A karbacholra adott válaszban nem volt különbség P. aeruginosa-fertőzött egerekkel összehasonlítva a steril gyöngyökkel kezelt egerekkel. Nem volt különbség a kezeletlen és steril gyöngyöket kapott egerek között (az adatokat nem közöljük).

Lineáris regressziós analízist (1. táblázat) hajtottunk végre, összehasonlítva a testtömeg változását a gyulladásos mediátorok koncentrációjával és az abszolút neutrofil számmal az egerek BAL folyadékában 3 nappal a P. aeruginosa-megrakott gyöngyök. A súlycsökkenés közvetlenül korrelált az mTNF-α (R = −0,678), mIL-1β (R = −0,774), mip-2 (R = −0,902), KC (R = −0,835) és abszolút neutrofilszám szintjével (R = -0,752) BAL-ban. Közvetlen összefüggés volt az abszolút neutrofilszám és az mIL-1β (R = 0,825), a mip-2 (R = 0,781) és a KC (R = 0,779) koncentrációi között is a BAL folyadékban. Nem volt összefüggés a BAL-folyadék citokinkoncentrációja és az intravénásan adott 0,75 mg/kg karbachol közötti tüdőválasz között (p

1. táblázat: A PEARSON TERMÉKPILLANAT-KORRELÁCIÓJÁNAK R-ÉRTÉKEIT FOGLALÓ SÚLYFOGÁS, ABSZOLUT NEUTROFILSZÁM ÉS PRONFLAMMATIKUS MEDIÁTOROK Lineáris regresszió-elemzése *

A rövidítések meghatározása: mTNF-α = egér tumor nekrózis faktor-alfa; mIL-1β = egér interleukin-1 béta; mIL-6 = egér interleukin-6; mip-2 = makrofág gyulladásos fehérje-2; KC = KC/N51.

* Az egereket beoltottuk Pseudomonas-megrakott agaróz gyöngyökkel és 3 nappal később megölték. Pozitív összefüggés volt a kezdeti testtömeg százalékos változása és az mTNF-α, mIL-1β, mip-2 és KC proinflammatorikus mediátorok között a bronchoalveoláris mosófolyadékban. Közvetlen összefüggés volt az abszolút neutrofilszám és az mIL-1β, mip-2 és KC BAL-koncentrációi között.

† Jelentős összefüggést mutat, p

2. táblázat: Gyulladásos közvetítők és a tüdőrezisztenciával való összefüggés *

A rövidítések meghatározásához, lát Asztal 1.

* A tüdőrezisztenciát nyolc egérben mértük 2 nappal az oltás után P. aeruginosa-megrakott agaróz gyöngyök. Ezután az egereket leöltük és a BAL folyadékot összegyűjtöttük a leírtak szerint. Nem volt összefüggés a proinflammatorikus mediátorok szintje között a BAL folyadékban és a tüdő rezisztenciájában, függetlenül a karbachol dózisától. Az értékek átlagként ± SEM jelennek meg.

7. ábra Páros táplálású egerek. (A) Étel és (B) a steril oltott egerek vízfogyasztása (zárt körök) vagy fertőzött (zárt háromszögek) gyöngyöket úgy számoltuk, hogy a ketrecenként 24 órán át elfogyasztott élelmiszer (g) vagy víz (ml) mennyiségét elosztjuk az egerek számával, majd meghatározzuk a kezdeti fogyasztás százalékát. Mindkét egércsoport kevesebbet evett és ivott az oltást követő első napon, majd ezt követően rendesen evett. A fertőzött egerek azonban továbbra is kevesebb vizet ittak, mint a normál egerek. (C ) A fertőzött egerek lényegesen nagyobb súlyt vesztettek, mint a párosan táplált kontroll egerek (nyitott háromszögek). * A jelentőséget Mann-Whitney rangösszeg teszt segítségével értékeltük (p

3. táblázat: A test felépítésének elemzése *

* Az egereket beoltottuk steril (n = 8) vagy P. aeruginosa-megrakott (n = 7) gyöngy. A kontroll egereket nem kezeltük (n = 8) vagy párosan etettük. A páros táplálású egereknek 24 órás periódus alatt ugyanannyi ételt adtak, mint a fertőzött egereknek az előző 24 órában. Három nappal a kezelés után az egereket leöltük. A tetemek lemérésével meghatároztuk a nedves súlyt, és a tetemek kiszáradása után a száraz tömeget mértük. A víz tömegét a nedves és a száraz tömeg (g) közötti különbségként számoltuk. A száraz és a víz tömegszázaléka a tetem nedves tömegéhez viszonyítva. Az izomtömeget a gastrocnemius és a sartorius lábizmok szárított súlyából határoztuk meg. A relatív izomtömeg az izomtömegben van kifejezve a száraz hasított test tömegéhez viszonyítva (gramm izomtömeg/gramm száraz tömeg). A fertőzött egereknek kisebb volt a nedves testtömegük, nagyobb volt a vízmennyiségük és kevesebb volt az izomtömegük a kontroll állatokhoz képest. Az értékek átlag ± SEM.

† p = 0,024 a kezeletlen egerekhez viszonyítva.

‡ p ⩽ 0,007 összehasonlítva a beoltott egerekkel P. aeruginosa-megrakott gyöngyök.

§ p ⩽ 0,05, szemben a steril gyöngyökkel kezelt egerekkel.

‖ P = 0,013 a páros táplálású egerekhez képest.

¶ p ⩽ 0,027, szemben a steril gyöngyökkel kezelt egerekkel.

** p ⩽ 0,002 a kezeletlen egerekhez képest.

F3-164 p = 0,027 páros táplálású egerekhez viszonyítva.

Az akut pulmonalis exacerbáció közepette CF-ben szenvedő betegek gyakran jelentősen fogynak. Számos kutató kimutatta, hogy az akut pulmonalis exacerbációk során bekövetkező súlycsökkenés nagyobb nyugalmi energiafogyasztás következménye (11, 12, 14), ugyanakkor nem világos, hogy a nyugalmi energiafogyasztás ezen változását a megváltozott tüdőfunkció, a rendellenes testösszetétel okozza-e. zsír felszívódási abszorpció, krónikus vagy akut fertőzés vagy gyulladás, amely a tüdőben lévő gyulladásos mediátorok jelenlétéhez kapcsolódik. A krónikus bronchopulmonáris fertőzés állatmodelljével végzett kísérletek során, amelyek nagyon hasonlítanak a CF-ben szenvedő betegek tüdőkórjához, a nyálkahártyával fertőzött egerek P. aeruginosa szignifikáns súlycsökkenést okozott 3 nappal az oltás után, összehasonlítva a kontroll állatokkal (7). Ebben a vizsgálatban a testtömeg változása korrelált az mTNF, mIL-1β, mip-2 és KC BAL-koncentrációival, és az abszolút neutrofilszám 3 d P. aeruginosa-megrakott agaróz gyöngyök. Sőt, a fogyás közvetlenül korrelált a tüdőgyulladás mértékével, és nem a tüdőfunkció változásával.

Ebben a tanulmányban a C57BL/6 egerek gyorsan válaszul tüdőgyulladást fejlesztettek ki P. aeruginosa. Ez az intenzív gyulladásos reakció, amelyet a citokinkoncentrációk és az abszolút neutrofil számok alapján mértek a bronchoalveoláris mosófolyadékban (BAL) átmenetiek voltak, és az oltás után 7-10 nappal elérték a kiindulási szintet. 3 nap múlva egyetlen egeret sem teszteltek Pseudomonas az oltásnak klinikai bizonyítékai voltak a szeptikémiára, bár egy egér léphomogenátja eredményezett P. aeruginosa. A fertőzés után 10 nappal az egereknél még mindig gyulladás volt jelen, amit a pulmonalis hisztopatológia és a BAL-folyadékban megváltozott leukocita-különbség jelez. A neutrofil kemokin, a mip-2 koncentrációja a BAL folyadékban tükrözte a BAL folyadékban található neutrofilek számát. Mind a neutrofilszám, mind a mip-2 koncentráció 3 nap múlva tetőzött a fertőzés után Pseudomonas. Az abszolút neutrofilszám és a mip-2 koncentráció a BAL folyadékban pozitívan korrelált (R = 0,791, p Khan T. Z., Wagener J. S., Bost T., Martinez J., Accurso F. J., Riches D. W. Korai tüdőgyulladás cisztás fibrózisban szenvedő csecsemőknél. Am. J. Respir. Crit. Care Med.151 1995 1075 1082