A kínai savanyú káposztából izolált purin-nukleozidokat lebontó tejsavbaktériumok szűrése és jellemzése, valamint a szérum húgysavcsökkentő hatásának értékelése hiperurikémiás patkányokban

Egyformán járult hozzá ehhez a munkához: Ming Li, Dianbin Yang

Dalian Orvostudományi Egyetem Mikroökológiai Tanszéke, Dalian Orvostudományi Egyetem, Dalian, Liaoning, Kína

Egyformán járult hozzá ehhez a munkához: Ming Li, Dianbin Yang

Dalian Orvostudományi Egyetem Mikroökológiai Tanszéke, Dalian Orvostudományi Egyetem, Dalian, Liaoning, Kína

Dalian Mikroökológiai Tanszék, Általános Orvostudományi Iskola, Dalian Orvostudományi Egyetem, Dalian, Liaoning, Kína, Gasztroenterológiai Tanszék, Zhengzhou Egyetem második kapcsolt kórháza, Zhengzhou, Henan, Kína

Tartományi Agrár-, Élet- és Környezettudományi Kar, Alberta Egyetem, Edmonton, Alberta, Kanada

Dalian Orvostudományi Egyetem Mikroökológiai Tanszéke, Dalian Orvostudományi Egyetem, Dalian, Liaoning, Kína

Ming Li,
Dianbin Yang,
Lu Mei,
Lin Yuan,
Ao Xie,
Jieli Yuan

Ábrák

Absztrakt

A guanozin és inozint lebontó LAB törzsek szűrése

Az inozin és a guanozin egyidejű kimutatásához HPLC oldat rendszert alkalmaztunk. Az eljárás a következő: 33,7 mg inozint és 35,7 mg guanozint oldunk 100 ml K3PO4-oldatban (100 mmol/l, pH = 7,0), hogy inozin-guanozin oldatot kapjunk. Szűrés után (0,22 µm) 5, 10, 15 és 20 µl inozin-guanozin oldatokat injektáltunk egy változó hullámhosszú detektorral és egy Cosmosil-5C18-AR- HPLC eszközbe (LC-20A, Shinadzu Corporation, Japán). II. Oszlop (4,6 × 250 mm, Cosmosil, Japán). Az izokratikus eluálást NaCl04-H3PO4 oldattal (0,1 umol/l NaCl04 és 0,187 mol/l H3PO4 dH20-ban) végeztük 1 ml/perc áramlási sebességgel. Az inozin és a guanozin tartalmát 254 nm-en 14,906, illetve 10,889 perc retenciós idővel azonosítottuk, és a kalibrációs görbék interpolációjával számszerűsítettük. A levezetett standard görbék Aino = 5 × 107 Cino + 22844, R = 0,9999 és Agua = 5 × 107 Cgua-10822, R = 0,9999 voltak. A: csúcsterület, C: koncentráció (g/L).

Az inozin és guanozin asszimilációs képességének értékeléséhez a LAB törzset MRS-be oltottuk, és 48 órán át tenyésztettük 37 ° C-on anaerob körülmények között. 2 ml táptalajt 4000 x g-vel, 4 ° C-on 10 percig centrifugáltunk. A sejteket ezután kétszer mostuk 1 ml 0,85% -os NaCl-oldattal, 750 µl inozin-guanozin oldattal szuszpendáltuk és 37 ° C-on 60 percig rázással (120 fordulat/perc) inkubáltuk. Ezt követően az oldatot 4000 x g-vel, 4 ° C-on 10 percig centrifugáltuk. 270 µl felülúszót eltávolítottunk. 30 µl HClO4-et (0,1 mol/l) adunk a felülúszóhoz, alaposan összekeverjük a további lebomlás megakadályozása érdekében. Szűrés után 20 ul keveréket injektáltunk a HPLC készülékbe. A fennmaradó inozin- és guanozintartalmat a fent leírt képlettel számítottuk. Az inozin vagy a guanozin lebomlási sebességét és sebességét a különböző LAB törzsek a következő képlet szerint számolták: V = (0,9C-X)/60, a = [(0,9C-X) /0,9C] • 100%. V: bomlási sebesség (g/L/min), X: az inozin vagy guanozin maradék tartalma (g/L).

A purinvegyületek LAB sejtszerű kivonataival történő lebomlásának értékeléséhez 2 ml tenyészlevet centrifugáltunk 4000 x g-vel, 4 ° C-on 10 percig. A sejteket ezután kétszer mostuk 1 ml 0,85% NaCl-dal, 750 µl inozin-guanozin oldattal újraszuszpendáltuk, és ultrahanggal kezeltük Feliu és munkatársai [21] leírása szerint. Ezt követően az extraktumokat 37 ° C-on 60 percig és 120 percig inkubáltuk rázással (120 fordulat/perc). Az inozin és a guanozin tartalmát HPLC-vel elemeztük a fentiek szerint.

A jelölt törzsek mint potenciális probiotikumok jellemzése

Savtűrés.

A savas körülményeknek való ellenállást 10 8 CFU/ml (végső baktériumkoncentráció) LAB oltásával oltottuk be különböző pH-értékű MRS táptalajba [22]. Az MRS pH-ját 2,0, 3,0 és 4,0 értékre állítottuk 0,1 N sósavoldattal. 4 órán át 37 ° C-on történő tenyésztés után soros hígításokat hajtottunk végre, és a baktériumtörzsek növekedését életképes lemezszámlálással rögzítettük. Ezt a vizsgálatot három példányban hajtottuk végre.

Epe tolerancia.

Az epesó-oldatokat oxi gallpor (Sigma, St. Louis, Mo, USA) felhasználásával állítottuk elő 0,1%, 0,2% és 0,3% végkoncentrációban [23]. 108 CFU/ml (végső baktériumkoncentráció) frissen elkészített LAB-ot oltottunk be 10 ml autoklávos oldatba, és inkubáltuk 37 ° C-on 4 órán át, mielőtt az életképes lemezszámlálást elvégeztük. Ezt a vizsgálatot három példányban hajtottuk végre.

A pepszin és a tripszin toleranciája.

108 CFU/ml (végső baktériumkoncentráció) frissen elkészített LAB-tenyészetet oltottunk be MRS táptalajba, különböző koncentrációban pepszinnel (0,59 µg/ml, 0,72 µg/ml és 1,48 µg/ml) és tripszinnel (0,336 µg/ml (0,592 ug/ml és 0,723 ug/ml). A törzsek növekedését 4 órával felsoroltuk 37 ° C-on történő inkubálás után. Ezt a vizsgálatot három példányban hajtottuk végre.

Antimikrobiális aktivitás vizsgálata.

Az izolátumok antimikrobiális képességének értékeléséhez agar folt tesztet hajtottunk végre [22]. Az ebben a vizsgálatban alkalmazott patogén baktériumok az Escherichia coli ATCC 8739, a Staphyloccocus aureus ATCC 6538P, a Micrococcus luteus MTCC 2470, a Salmonella typhi ATCC 786, a Pseudominas aeruginosa ATCC 25619 és a Staphylococcus epidermidis ATCC12228. Röviden, 2,5 µl friss LAB-tenyészetet észleltünk az MRS agar lemezeken, és 24 órán át 37 ° C-on inkubáltuk. Ezt követően az agar felületét 15 ml LB agarral borítottuk be, amelyet 106 CFU/ml koncentrációban oltottunk be a patogén törzsekkel. Ezután a lemezeket 37 ° C-on inkubáltuk. A növekedés gátlását 24 óra múlva detektáltuk a gátlási zónák átmérőinek mérésével. A tesztet három példányban hajtottuk végre.

A H2O2 termelés mérése.

A LAB-törzsek frissen tenyésztett sejtjeit 10 000 fordulat/perc sebességgel, 10 percig 0 ° C-on végzett centrifugálással gyűjtöttük össze. 2 g sejtpelletet 20 ml hideg, steril foszfátpufferban szuszpendáltunk (pH-ját 6,5-re állítottuk). A sejteket ezután 5 ° C-on inkubáltuk 5 napig anaerob körülmények között. A H2O2 mérése Villegas és Gilliland módszereivel történt [24].

Sejttapadási képesség.

A jelölt törzsek humán enterocita-szerű Caco-2 sejtekhez való tapadóképességét a korábban leírt módszerrel értékeltük [29]. Röviden, a sejteket Dulbecco minimális esszenciális táptalajában (DMEM) (Invitrogen, Németország) tenyésztettük 100 E/ml penicillinnel és 100 mg/ml sztreptomicinnel. A tapadási vizsgálatok előtt a Caco-2 sejteket 2 ml antibiotikum nélküli táptalajban tenyésztettük 10 napig. A körülmények standardizálása és egyrétegű (1x105 sejt/üreg) sejtvonalak előállítása után 1 ml táptalajt 1 ml LAB szuszpenzióval (108 CFU/ml DMEM-ben) helyettesítettünk. Az oltott tenyészetet ezután 3 órán át 37 ° C-on inkubáltuk 5% CO2-ban. A fertőzött sejteket háromszor mossuk steril PBS-sel (pH 7,8), 2 órán át 10% formaldehiddel rögzítjük, Grammal festjük, és mikroszkóppal (1500x nagyítás, olajmerítés) figyeljük meg őket. 20 véletlenszerűen kiválasztott mikroszkopikus mezőből tapadt baktériumokat számláltuk. Az összes mintát három példányban elemeztük.

A törzsek érzékenysége az antibiotikumokkal szemben.

Lemezdiffúziós érzékenységi vizsgálatokat a Klinikai és Laboratóriumi Szabványügyi Intézet (CLSI) szabványos eljárása szerint végeztünk [25]. A laboratóriumi törzseket MRS-be oltottuk és 24 órán át 37 ° C-on inkubáltuk. A tenyészlevest ezután 6x108 CFU/ml koncentrációra hígítottuk, és steril vattapamacs segítségével egy szárított MRS agarlemez teljes felületére terítettük. Antibiotikumlemezeket (lásd az antibiotikumok tartalmát a 3. táblázatban) minden MRS lemez felületére helyeztünk. 48 órán át 37 ° C-on végzett inkubálás után az egyes lemezek körüli gátlási zóna átmérőjét (mm-ben) mértük, hogy osztályozzuk az egyes izolátumok antibiotikum-érzékenységét. Az összes mintát három példányban elemeztük.