A rágcsálók és az emberek képesek kimutatni az L-laktát szagát

Fiziológiai, farmakológiai és idegtudományi tagozat, Bristoli Egyetem, Bristol, Egyesült Királyság

képesek

Jelenlegi cím: Kaliforniai Egyetem, Élettani és Kardiovaszkuláris Kutató Intézet, San Francisco, Amerikai Egyesült Államok

Biokémiai és Howard Hughes Orvosi Intézet, Stanford Egyetem Orvostudományi Kar, Stanford, Amerikai Egyesült Államok

Társulás Max-Delbrück-Molekuláris Orvostudományi Központ (MDC) Berlin-Buch, Berlin, Németország

Fiziológiai, farmakológiai és idegtudományi tagozat, Bristoli Egyetem, Bristol, Egyesült Királyság

Fiziológiai, Farmakológiai és Idegtudományi Egyetem, Bristoli Egyetem, Bristol, Egyesült Királyság, Balti Szövetségi Egyetem, Kalinigrad, Orosz Föderáció

  • Valentina Mosienko,
  • Andy J. Chang,
  • Natalia Alenina,
  • Anja G. Teschemacher,
  • Szergej Kaszparov

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Mosienko V, Chang AJ, Alenina N, Teschemacher AG, Kasparov S (2017) A rágcsálók és az emberek képesek kimutatni az L-laktát szagát. PLoS ONE 12 (5): e0178478. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0178478

Szerkesztő: Johannes Reisert, Monell Chemical Senses Center, EGYESÜLT ÁLLAMOK

Fogadott: 2017. január 16 .; Elfogadott: 2017. május 12 .; Közzétett: 2017. május 25

Adatok elérhetősége: Minden lényeges adat a cikkben található.

Finanszírozás: Ezt a munkát a BBSRC támogatta: BB/L019396/1, BB/K009192/1; és MRC MR/L020661/1. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Az Olfr78 jelenléte a szaglórendszerben és annak érzékenysége az LL-re azt sugallja, hogy a rágcsálóknak és az embereknek képesnek kell lenniük az LL szagának kimutatására. Meglepő módon ezt soha nem dokumentálták meggyőzően. Ezenkívül a PubChem adatbázisban ellentmondásosak az információk arról, hogy az LL-nek van-e szaga, a legutóbbi bejegyzés „szagtalan” (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/612#section=Top).

Jelen tanulmányban felmértük, hogy a rágcsálók és az emberek valóban képesek-e kimutatni az LL szagát, valamint az Olfr78 fontosságát az LL kimutatásában. Megmutatjuk, hogy az egerek, a patkányok és az emberek képesek LL szagot érezni. Mivel az Olfr78 knockout egerek ennek ellenére képesek voltak kimutatni az LL-t, ennél a fajnál több LL-érzékeny OR-nak kell lennie. Alternatív LL jelzőmechanizmusok azonosítása fényt deríthet a szaglórendszeren kívüli LL átviteli útvonalakra.

Anyag és módszerek

Állatok

A vad típusú egerekben végzett összes eljárást a tudományos célokra felhasznált állatok védelméről szóló 2010/63/EU európai parlamenti irányelv irányelveinek megfelelően hajtották végre, és az ebben a tanulmányban elvégzett kísérleteket a berlini etikai bizottság szenátusa ( Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin (LAGESO); tanulmányszám: G0300/13). A patkányokon végzett kísérleteket az Egyesült Királyság Belügyminisztériumának 1986. évi Állatok (tudományos eljárások) törvényének megfelelően hajtották végre, amelyet a Bristoli Egyetem etikai felülvizsgálati bizottsága hagyott jóvá (protokollszám: 30/2875). Az Olfr78 null/reporter egérsorral végzett kísérleteket jóváhagyta a Stanfordi Egyetem Orvostudományi Karának Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága (IACUC) (protokollszám: 19968).

Állattartás

3, illetve 8 hím C57Bl/6 egeret alkalmaztunk-szoktattunk, ill. 7 homozigóta Olfr78 null [23] és 9 vad típusú alomtárs kontroll egeret 129P2/OlaHsd és C57Bl/6J vegyes háttéren alkalmaztunk szagfelderítési feladatra. Minden egér hím volt, 5–9 hónapos, csoportos elhelyezésben volt, és normál fény/sötét ciklus alatt tartották őket, szabad hozzáféréssel az élelemhez és a vízhez.

12 hím Lister Hooded patkányt, melyek súlya 200 és 240 g között volt (Harlan), használtak szag-jutalom asszociatív tanulási feladatban. Valamennyi patkányt naponta kezeltük és lemértük, és megfordított 12 órás világos-sötét ciklusban tartottuk, szabad hozzáféréssel az élelemhez és a vízhez. Az érkezés után 7 nappal az állatokat korlátozott étrendre helyezték 10 napra, amelynek során napi hét-kilenc étkezési pelletet kaptak, hogy fenntartsák testtömegüket.

Szabadon etető súlyuk 85% -a. Az ilyen étrendet az edzés és a tesztnapok alatt is fenntartották. A feladatot a sötét szakaszban hajtották végre.

Szag kimutatási teszt egereken

Annak érdekében, hogy teszteljük a vad típusú egereknek az LL szagának kimutatására való képességét, ezt követően bevezettük a borsmentát (40 μl frissen készített víz (desztillált) borsmenta levelek kivonata), LL (40 μl frissen készített oldat desztillált vízben, 1 M, pH = 7,4, L1750 Sigma, ≥98% -os tisztaság) és vizelet (a teszt napján gyűjtöttük olyan nőstény egerektől, amelyekkel a vizsgált hím egerek soha nem voltak kapcsolatban, 10 μl). Az Olfr78 null egerekhez és a kontrollokhoz szagszekvencia volt víz (40 μl), LL (80 μl frissen készített oldat desztillált vízben, 2 M, pH

7.4, 71718 Sigma, ≥99% tisztaságú), vizelet (a teszt napján gyűjtötték olyan nőstény egerektől, amelyekkel a vizsgált egerek soha nem voltak érintkezésben, 10 μl), vanília kivonat (40 μl 1:10 arányú desztillált vízzel hígítva) desztillált víz (40μl). 2M LL-t választottunk további vizsgálatra Olfr78 null egerekben és alomtársaikban, mivel a 2M LL hasonló viselkedési válaszokat váltott ki kontroll egerekben vegyes háttéren, összehasonlítva az 1M LL által kiváltott válaszokkal C57Bl6/N egerekben. 30 perccel a vizsgálat előtt a hím egeret egy friss tesztketrecbe tették, majd egy szagot adtak egy darab Wattman-papírra (2,5 cm x 2,5 cm) a ketrec sarkában 3 percig, 1 perc intervallummal. különböző szagok. A bevitt szagú papír szippantásával töltött egerek időtartamát egy megfigyelő mérte, aki vak volt a vizsgált anyagokra.

Szagszokás-étvágytalansági teszt egereken

Ezt a szaglási tesztet alkalmazták az LL és más szagok megkülönböztetésének képességének és a megszokás képességének felmérésére. 30 perccel a vizsgálat előtt az egeret friss tesztketrecbe helyeztük. Mindegyik tesztketrecet csak egyszer alkalmazták. A következő 10 perc alatt száraz és tiszta pamutpálcát vezettek a ketrecbe annak érdekében, hogy csökkentse a szaggal nem összefüggő nem specifikus szippantást. Az LL-t (frissen készített oldat desztillált vízben, 1 M, pH = 7,4, L1750 Sigma, ≥98% -os tisztaság) ezt követően borsmentával (frissen készített borsmenta levelekből készült oldat) és vaníliával (desztillált vízben 1: 100 arányú vanília kivonattal hígítva) teszteltük. és desztillált vizet negatív kontrollként. Mindegyik szagot háromszor, 2 percen át, 1 perc próbaidőközzel vattapálcára vezettük, amelyet a vizsgált anyag oldatába mártottunk. Az egerek különböző szagok szippantásával töltött idejét egy kutató mérte meg a tesztelt anyagokra.

Szag-jutalom asszociatív tanulás patkányokban

Szag-jutalom asszociatív tanulási feladatot patkányokban alkalmaztunk annak megállapítására, hogy a patkányok képesek-e felhasználni az LL szagát jutalom megtalálásához. Ezt a tesztet a [24] szerint végezzük módosításokkal.

Alumínium operánsdobozt (80 cm x 80 cm x 50 cm) használtunk. A doboz belsejét matt fekete feketére festették, hogy elkerüljék a vizuális jelek jelenlétét és elegendő kontrasztot biztosítsanak a Biobserve mozgáskövető szoftverhez (Viewer 2 2.2.0.91 verzió, BIOBSERVE GmbH, Bonn, Németország). A szivacsok mindegyike azonos volt, 8,5 cm x 7 cm x 4 cm méretűek, középen 2 cm lyukkal vágva, és csak egy kísérleti napon használták fel egy-egy állattal. A tanulmányban használt Kellogg Froot Loops-ja jó erősítésnek bizonyult az operáns feladatokban [25]. Az összes munkamenetet videokamerával rögzítettük, közvetlenül az operáns doboz fölé helyezve, hogy lehetővé tegyük a megfigyelést a kísérletek során és az azt követő off-line elemzés során.

A kísérletekhez az egyik szivacsot vagy LL tesztillattal (frissen készített desztillált vízzel készített oldat, 1 M, pH = 7,4, L1750 Sigma, ≥98% tisztaságú) vagy kontroll mandulaillattal (1: 100 arányban hígított mandulakivonat desztillált oldattal) impregnáljuk. víz) közvetlenül minden vizsgálat előtt. Mandulát választottak a pozitív kontrollhoz, mivel ismert, hogy a patkányok érzik az illatát, és úgy tűnik, hogy nem preferálják és nem is idegenkednek tőle [26]. A rejtett jutalommal ellátott szivacsot minden kísérlethez az operáns dobozának másik sarkába helyeztük egy véletlenszám-generátor (1, 2 vagy 3) előre meghatározott számsorának megfelelően. A patkányt mindig a doboz ugyanazon sarkában (0) helyezték el, az orr a fal felé nézett a vizsgálat kezdetén, és a fennmaradó két sarkot desztillált vízzel átitatott üres szivacsok foglalták el. Összesen 12 patkányt alkalmaztunk kondicionáló edzéshez, és mindegyik patkányt mindkét szaggal teszteltük. Az állatok felét először mandulaillattal, majd 5 napos szünetet követően LL szaggal kondicionáltuk. A másik felét fordított sorrendben kondicionáltuk.

Az első edzésnapon a patkányokat 5 percig hagyták felfedezni az arénában, mielőtt egyetlen Froot Loop-ot tettek a doboz padlójára, hogy megismertessék a patkányokat az erősítéssel és a kísérleti arénával. A patkányokat hagyták elfogyasztani az ételt, majd visszatértek otthoni ketreceikbe, és az eljárást megismételték (azaz két gyakorló epizódot patkányonként). A második edzésnapon hasonló protokollt követtek, azzal a különbséggel, hogy három (szagtalan) szivacsot tettek a doboz sarkaiba, és a második kísérlet során a Froot Loop-ot egy szivacs lyukába tették, hogy a patkányok normális táplálkozási magatartásuk során megszerezhették a jutalmat.

A teszt napján néhány Froot Hurkot porrá zúztunk, és az egész doboz padlójára szórtuk, hogy megakadályozzuk, hogy a patkányokat a rejtett Froot Loop illata vezérelje a következő vizsgálatok során. Minden foglalkozás 6 próbából állt. Csak az első vizsgálatnál (0. bevezető vizsgálat) az élelmezés jutalmát a szivacs tetejére helyezték, hogy az állatok vizuálisan megtalálhassák, és ez a vizsgálat nem szerepelt az elemzésben. Erre azért volt szükség, mert az előzetes kísérletek során azt tapasztaltuk, hogy amikor összetört Froot Loop-okat terítettek az aréna köré, a patkányok lényegében soha nem találtak rejtett jutalmat 5 percen belül. A következő vizsgálatokban a helyes válasz késleltetését (a patkánynak jutalom megszerzéséhez szükséges időt) és a hibákat rögzítették. A hibákat orrpiszkálásnak számítottuk egy vízzel impregnált szivacsban, vagy orrpiszkálás nélkül utólag szimatoltuk a megfelelő szivacsot a szaggal. Ugyanazokat a szivacsokat használtuk az egyes patkányokkal végzett ismételt vizsgálatokhoz, de a célszivacs helyzetét minden kísérlet után véletlenszerűen megváltoztattuk. A táplálék jutalmának megtalálása után a patkányokat megehették enni, mielőtt kivették a dobozból, és visszatértek háziketrecükbe. 5 perces és 2–5 perces inter-próbaidőszakot tartottak fenn.

Szagfelderítési teszt emberen

A tanulmány protokollját a Bristoli Egyetem Etikai Bizottsága jóváhagyta (jóváhagyás: 47121). Minden résztvevő szóbeli beleegyezést kapott a vizsgálat részeként.

Annak tesztelésére, hogy az emberek képesek-e kimutatni az LL szagát, 94 fiatal női és férfi önkéntest toboroztunk (1. táblázat), és arra kértük őket, hogy jelezzék egy szag jelenlétét négy, különböző vegyszereket vagy vizet tartalmazó edényben. A tesztet három független napon, vegyes nemű csoportokkal végeztük. A szag megjelenítésének sorrendje véletlenszerű volt, és a résztvevőket nem tájékoztatták arról, hogy milyen szagokra számíthatnak. 100 ml 1 M (pH = 7,4) frissen elkészített oldat LL desztillált vízben (L7022 Sigma,

98% -os tisztaságú), piruvátot (P2256 Sigma, ≥99% tisztaság), propionátot (P1880 Sigma, ≥99% tisztaságú) vagy acetátot (S2889 Sigma, ≥99% tisztaságú) széles, szagtalan üvegedényekbe tettünk, amelyeket zárva tartottak tesztek. Desztillált víz szolgált kontrollként. A résztvevők kérdőívet kaptak annak megállapítására, hogy (1) észlelhetnek-e valamilyen szagot az edényben (igen/nem), (2) ha kellemes, kellemetlen vagy semlegesnek érzékelik ezt az illatot, és (3) hogy észlelik-e az illatot illata édes, savanyú/savas, keserű, semleges vagy „nehezen meghatározható”. A résztvevőket arra utasították, hogy miként hajtsák végre a tesztet, majd saját maguk hajtsák végre. Egyszerre csak egy résztvevő volt jelen a tesztteremben.

Statisztikai analízis

Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejezzük ki. A statisztikai elemzést egy- vagy kétirányú ANOVA-val, vagy ismételt ANOVA-mérésekkel Bonferroni-féle korrekcióval, post-hoc tesztként többszörös összehasonlításra, t-tesztre vagy Fisher-pontos tesztre, amelyet egy kontingenciatáblázat alapján számítottunk ki (PRISM, GraphPad, San Diego, Kalifornia). A jutalomhoz kapcsolódó tanulás elemzéséhez patkányokban az összes hibaadatot helyes/helytelen binomiális adatokká alakították át, és kontingencia-elemzéssel értékelték az eloszlások összehasonlítására (akár khi-négyzet teszt a trendre, akár khi-négyzet teszt az illeszkedés jóságára). P 0,05, 1A. Ábra). Az egerek 11-szer hosszabb ideig töltöttek vizeletet tartalmazó papír szippantását a vízhez képest (vizelet 52,12 ± 3,85 mp vs víz 4,84 ± 0,64 mp, p 1. ábra. Az egerek képesek észlelni és megkülönböztetni az L-laktát szagát.

A. Szagfelismerési feladat. Az egerek lényegesen több időt töltöttek az L-laktát (1 M) szippantásával, mint a víz, és ugyanannyi időt töltöttek, mint a borsmenta kivonata. Az adatokat átlag ± SEM-ként mutatjuk be, n = 8. * p # p 0,05, 2B. Ábra). A következő kísérletek (2–5) feltárták a próba számának a késleltetésre gyakorolt ​​hatását a jutalom szag alapján történő megállapításához (F (4,44) = 4,610, P 0,05, 2B. Ábra). Az utolsó vizsgálat során (5) a patkányok sokkal gyorsabban találták meg a jutalmat, mint az elején (1. próba vs 5. próba, p 0,05, 2C ábra), és a helyes választás valószínűsége nagyobb volt, mint amire véletlenül számítani lehet (p 2. ábra A patkányok képesek megkülönböztetni az L-laktát szagát.

A. Patkányok szag-jutalom asszociatív tanulási feladatának sematikus ábrázolása. A kiképzési napok során a patkányokat az arénához szokták, és a jutalom visszaszerzéséhez. A tesztnapi bevezető vizsgálat (0) során (a további elemzésben nem szerepel) a tesztszagú anyaggal átitatott szivacs látható ételjutalmat mutatott. Az ezt követő öt kísérlet során a tesztnapon egy véletlenszerűen elhelyezett szivacs, amelyet a teszt szaga áztatott, rejtett ételjutalmat adott ki. Szag-asszociatív tanulási feladat eredményei patkányokban: B. Az az idő, amelyet a patkányok töltöttek az étel jutalmának megtalálására a szag (latencia) alapján, nem különbözött az L-laktát és a pozitív kontroll, a mandula között. A kísérletek során az élelmiszer-jutalom megtalálásának késleltetése mindkét illatanyag esetében csökkent. Az adatokat átlag ± SEM-ként mutatjuk be, n = 12. * p ### p ## p 3. ábra: Nemtől függő különbségek az emberek L-laktát szagérzékelésében.