A SAMD4A körkörös RNS a miR-138-5p/EZH2 tengelyen keresztül szabályozza az adipogenezist az elhízásban.

Yanjun Liu 1,2 *, Hongtao Liu 2 *, Yi Li 3,5 *, Rui Mao 2 *, Huawu Yang 1, Yuanchuan Zhang 1, Yu Zhang 2, Pengsen Guo 2, Dafang Zhan 1, Tongtong Zhang 4,5

1. Elhízás és anyagcsere-betegségek központja, Chengdu harmadik népi kórháza, Chengdu, 610031, Kína.
2. A délnyugati Jiaotong Egyetem kapcsolt kórháza, Csengdu, 610036, Kína.
3. Radiológiai Osztály, Csengdu Harmadik Népi Kórház, Csengdu, 610031, Kína.
4. Orvosi Kutatóközpont, Csengdu Harmadik Népi Kórház, Csengdu, 610031, Kína.
5. Chengdu második kapcsolt kórháza, Chongqing Orvostudományi Egyetem, Chengdu, 610031, Kína.
* Ezek a szerzők egyformán járultak hozzá ehhez a munkához.

Idézet:
Liu Y, Liu H, Li Y, Mao R, Yang H, Zhang Y, Zhang Y, Guo P, Zhan D, Zhang T. A SAMD4A kör alakú RNS a miR-138-5p/EZH2 tengelyen keresztül szabályozza az adipogenezist az elhízásban. Theranosztika 2020; 10 (10): 4705-4719. doi: 10,7150/thno.42417. Elérhető a https://www.thno.org/v10p4705.htm oldalon

Egyre több bizonyíték azt sugallja, hogy a körkörös RNS-ek (circRNS-ek) kulcsfontosságúak a génexpresszió szabályozásában, és diszregulációjuk számos betegségben érintett. Az circRNS-ek elhízásban betöltött funkciója azonban nagyrészt felderítetlen marad.

Mód: A circRNS expressziós mintázatának globális változásait elhízott és sovány egyedektől származó zsírszövetekben észlelték. Különösen a circSAMD4A-t azonosították szignifikánsan differenciálisan felülszabályozottnak, és funkcionálisan elemezték mind in vitro, mind in vivo, különböző megközelítések alkalmazásával.

Eredmények: A CircSAMD4A túlzott expressziója korrelált az elhízott betegek rossz prognózisával. Ezzel szemben a circSAMD4A knockdown gátolta a differenciálódást az izolált preadipocytákban. A magas zsírtartalmú étrend (HFD) által kiváltott elhízott egereknél a circSAMD4A leütés megfordította a kapcsolódó súlygyarapodást, csökkentett táplálékfelvételt, alacsonyabb testzsírszintet és megnövekedett energiafelhasználást. Ezen egerek fokozott inzulinérzékenységet és glükóz toleranciát mutattak. Továbbá, in vitro kísérletek azt mutatták, hogy a circSAMD4A befolyásolta a differenciálódást azáltal, hogy kötődött a miR-138-5p-hez és szabályozta az EZH2 expresszióját.

Következtetések: A CircSAMD4A szabályozta a preadipocita differenciálódást azáltal, hogy miR-138-5p szivacsként működött, és ezáltal növelte az EZH2 expressziót. Ezek az eredmények arra utaltak, hogy a circSAMD4A potenciális célpontként szolgálhat az elhízás kezelésében és/vagy potenciális prognosztikai markerként az elhízott betegek számára a bariatrikus műtét után.

Kulcsszavak: circSAMD4A, elhízás, adipogenezis, miR-138-5p, EZH2

Az elhízás, amely a világ egyik legnagyobb egészségügyi terhe, számos krónikus betegség, köztük a szív- és érrendszeri betegségek, a 2-es típusú cukorbetegség és a rák fő oka. [1,2] A közelmúlt táplálkozási szokásai miatt az elhízás gyakorisága növekszik [3]. Így az elhízás elleni hatékony küzdelem érdekében meg kell határozni a kapcsolódó molekuláris mechanizmusokat és a kritikus jelátviteli utakat.

Számos tanulmány kiemelte azokat a szabályozási mechanizmusokat, amelyek révén a nem kódoló RNS-ek (ncRNS-ek), beleértve a mikroRNS-eket (miRNS-ek) és a hosszú nem kódoló RNS-ek (lncRNS-ek), számos betegség, például az elhízás kialakulásában vesznek részt [4,5]. Míg a miRNS-eket és az lncRNS-eket az elhízással összefüggésben vizsgálták [6,7], az ncRNS-ek harmadik osztálya, körkörös RNS-ként (circRNS-ekként) ismert, csak a közelmúltban keltette fel a kutatási érdeklődést [8]. A CircRNS-ek sokféle organizmusban részt vesznek a génszabályozásban [9]. Azonban azok a mechanizmusok, amelyek révén ezek az ncRNS-ek a betegség progressziója alatt működnek, nem tisztázottak egyértelműen. Felmerült, hogy a circRNS-ek különböző típusú betegségekben, vagy akár különböző betegségstádiumokban különböző célpontokon keresztül szabályozhatják a génexpressziót [8]. Ezenkívül a feltörekvő bizonyítékok azt sugallják, hogy egyes circRNS-ek miRNS-szivacsokként működnek a géntranszkripció modulálásával és az RNS-kötő fehérjékkel (RBP-k) való kölcsönhatással különféle betegségekben, ideértve a rákot [10,11], a szív- és érrendszeri rendellenességeket [12] és az immunoszenesenciát [13]. A zsírszövetben számos tanulmány kimutatta, hogy a circRNS-ek fontos szabályozóként működnek az adipogenezisben [14], a zsírgyulladásban [15] és a fehér zsírszövet barnulásában [16]. Azonban az circRNS-ek szabályozási mechanizmusai az adipogenezisben nem egyértelműek.

Ebben a tanulmányban circRNS expressziós profilokat állítottak össze elhízott és sovány egyedek zsírszövetmintáinak körkörös DNS-sávjaival. Elhízott egyéneknél a circSAMD4A (hsa_circ_0004846) szignifikánsan felülszabályozott és összefüggésben volt a prognózissal. A funkcionális vizsgálatok azt mutatták, hogy a circSAMD4A leütése gátolta a preadipocita differenciálódást. Ezenkívül a circSAMD4A expresszió pozitívan korrelált az elhízott egyének EZH2 expressziójával. Az itt bemutatott eredmények azt mutatják, hogy a circSAMD4A kötődik a miR-138-5p-hez, és miRNS-szivacsként működik az EZH2 expresszió utólagos szabályozásához. Összességében ezek a megállapítások azt sugallják, hogy a circSAMD4A adipogenezist elősegítő tényezőként is működik, és prognosztikus biomarkerként szolgálhat az elhízás szempontjából.

Klinikai minták

A zsírszövetmintákat prospektív módon gyűjtötték 40 laparoszkópos sérv-javításon átesett páciensről [sovány (Ln) önkénteseknél] és 60 betegről (elhízott (Ob) alanyokban) bariatéri műtéten a csengdui Harmadik Népi Kórházban (Kína) 2016. december és 2017. november között. (S1. Táblázat). A kínai nemzeti táplálkozási és egészségügyi felmérés (CNNHS) adatai szerint a kínai felnőtteknél a ≥28 kg/m 2 BMI elhízásra utal [17]. A mikro szövetek elemzését (megcélzó circRNS-eket) végeztük az ember szövetmintáin. Ezt a tanulmányt a Csengdu Harmadik Népi Kórház intézményi etikai felülvizsgálati tanácsa jóváhagyta (nyilvántartás: 2018S75; Csengdu, Szecsuán, Kína), és az emberi genom/gén kutatás kínai etikai irányelveinek megfelelően készült.

CircRNS mikroszkóp és számítási elemzések

Az összes RNS-t Rnase R-vel (Epicenter Technologies, Madison, WI, USA) emésztettük a lineáris RNS-ek eltávolítása és a körkörös RNS-ek dúsítása érdekében a gyártás protokolljai szerint. A dúsított körkörös RNS-eket véletlenszerű primer módszerrel amplifikálták és fluoreszcens cRNS-be írták át. A jelölt cRNS-eket 4 azonos tömböt tartalmazó humán circRNS tömbre (4x180K, Shanghai Biotechnology Corporation, Shanghai, Kína) hibridizáltuk, kissé 180K alatti próbákkal. A tömböket ezután Agilent szkennerrel mossuk és beolvassuk, és a képeket hajtásváltásos szűréssel és vulkán-parcellákkal elemezzük, a hajtásváltozás ≥1,5 és P-érték 7.

Plazmid konstrukciók

A CircSAMD4A-t humán genomi DNS-ből amplifikáltuk és pCD-ciR vektorba (Geenseed Biotech Co, Guangzhou, Kína) klónoztuk, amely egy elülső kör alakú keretet tartalmaz. A helyszínre irányított mutagenezist egy Fast Site-Directed Mutagenesis Kit (Takara Bio Inc., Dalian, Kína) segítségével hajtottuk végre, hogy a miRNS-kötő helyeket megcélozzuk a circSAMD4A-n. Az összes konstrukciót szekvenálással igazoltuk.

Western blottolás

A fehérjéket egy sejtvonalból, valamint a zsírszövetekből extraháltuk RIPA lízis puffer alkalmazásával, és a fehérje koncentráció meghatározásához a bicinchonininsav protein assay készletet (Sigma) használtuk. Az extraktumokat 12% -os SDS-PAGE-n keresztül oldottuk fel, és PVDF-membránokra helyeztük. 1 órás blokkolás után a membránokat az elsődleges anti-EZH2, C/EBP-α, PPAR-γ vagy AGO2 antitestekkel (1: 000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) inkubáltuk 4 ° C-on, egy éjszakán át, majd 2 órás inkubálás HRP-konjugált szekunder antitesttel szobahőmérsékleten. Az immunreaktív sávokat ECL segítségével vizualizáltuk, és normalizáltuk a GAPDH-ra (a belső kontroll).

Fluoreszkáló in situ hibridizáció

RNS fluoreszkáló in situ a hibridizációt (RNS-FISH) a szondagyártó utasításainak követésével (RiboBio, Guangzhou, Kína; S3. táblázat) követtük. A preadipocitákat egymás után 70%, 85% és abszolút etanollal kezeltük, és 2 ° C-on szárítottuk. A sejteket ezután 0,1% TritonX-100-val permeabilizáltuk, és 0,02 mg/ml circSAMD4A szondával inkubáltuk egy éjszakán át 37 ° C-on. A sejtmagokat DAPI-val festettük, és a circSAMD4A intracelluláris lokalizációját TCS SP8 X lézeres konfokális mikroszkóppal (Leica) figyeltük meg.

In situ hibridizáció (ISH)

A CircSAMD4A expresszióját zsírszövetekben vizsgáltuk ISH alkalmazásával, a Superchip Biotech-től (Shanghai, Kína) kapott specifikus digoxinnal jelzett circSAMD4A próbával (S3. Táblázat). Kiértékeltük a festés és az expresszió szintjét, és kiosztottuk a pontszámokat. A sejtfestési pontszámokat a következőképpen osztottuk be: 10-25% festett, score = 1, 26-50% festett, score = 2, 51-75% festett, score = 3 és 76-100% festett, score = 4. Festés Az intenzitást a következőképpen értékeltük: nem festett 0-t, gyenge festést 1-ig, mérsékeltet 2-nél, az erős festést 3-ig. A végső festési pontszám a festési pontszám és a festés intenzitási pontszámának szorzatát tükrözi alacsony expressziójú (végső pontszám ≤ 6) és magas expressziós csoportba (végeredmény> 7) osztva.

Luciferáz riportervizsgálat

Egy vad típusú circSAMD4A szekvenciát klónoztunk egy pmiR-RB-Report vektorba (Ribobio Co., Guangzhou, Kína), miközben egyidejűleg mutánsokat állítottunk elő a fentiekben leírt hely-irányú mutagenezissel. A mutációkat negatív kontrollként használt mutációs szekvenciát tartalmazó vektorokkal végzett szekvenálás útján igazoltuk. A preadipocitákat 96 lyukú lemezekre oltottuk 4x103 sejt/üreg sűrűségben 24 órával a transzfekció előtt. A sejteket ezután vad típusú vagy mutált riporter vektorokkal transzfektáltuk, a transzfekció után 24 órával nyert lizátumokkal. A Dual-Glo Luciferase Reporter Rendszert (Promega, Madison, WI) alkalmazták a kettős luciferáz vizsgálat elvégzésére a gyártó protokolljai szerint.

Olajvörös O festés

Az intracelluláris lipidlerakódások vizualizálásához Oil Red O festést alkalmaztunk. A vad típus közepes változása után különböző időpontokban a preadipocitákat 60% -os izopropanolos 30% -os olajvörös O-val festettük. Fénymikroszkóppal alkalmaztuk a lipidlerakódásokat és megerősítettük a differenciálódást.

Állatok

A hím C57BL/6J egereket (9 hetesek) kórokozótól mentes létesítményben tartották, és 12 órás világos-sötét ciklus alatt tartották 22 ° C-on. Az egereket etették ad libitum magas zsírtartalmú étrenddel (HFD; TD88137 Harlan Teklad). A szövetminták megszerzéséhez az egereket 16 órán át éheztettük, majd inhalációs érzéstelenítő izofluránnal altattuk és lefejeztük. A kívánt szöveteket kivágtuk, és az elemzésig -80 ° C-on vagy formalinban tartottuk. Az állatgondozást és a kísérleti eljárásokat a Nyugat-Kínai Kórház állatkísérletekkel foglalkozó etikai bizottsága hagyta jóvá, Szecsuán Egyetem, Chengdu, Kína (rekordszám: 2019014A).

Adeno-asszociált víruskészítés és injekció

Az AAV9-et SunBio (Sanghaj, Kína) tervezte megcélozni az mmu_circ_0000529-et, és kontrollként kódolt, nem célzó shRNS-t használtunk. Az mmu_circ_0000529 siRNS szekvencia a következő volt: 5'-GGCGC AAGCA CGAGA AUCAU UdTdT-3 '. Az egereket izofluoránnal (1-4%) altattuk és hajlamos helyzetbe helyeztük. A vírust steril PBS-ben hígítottuk (1x1012 vg/ml), és a többpontos injekciókat intraperitoneálisan vagy szubkután adtuk inzulinfecskendő segítségével.

Glükóz és inzulin tolerancia tesztek

A glükóz- és inzulin-tolerancia teszteket (GTT, ITT) glükóz (2 g/kg, 20 tömeg% d-glükóz [Sigma] 0,9 tömeg% sóoldatban) vagy inzulin (0,75 egység/kg 0,9 tömeg/térfogat% sóoldat) 6 órán át éheztetett egereknek. A vércukorszintet 0, 15, 30, 60 és 120 percnél mértük Infinity glükózmérővel (US Diagnostics).

Testtömeg és összetételmérések

Az egereket elektronikus mérleggel lemértük. A testösszetételt idődomén-magmágneses rezonancia (TD-NMR) alkalmazásával határoztuk meg egy Minispec Analyst AD sovány/zsír analizátoron (Bruker Optics, Silberstreifen, Németország).

Energia kiadások

Az egerek táplálékfelvételének és anyagcsere-sebességének mérésére Oxymax nyílt áramkörű közvetett kalorimetriát (16 kamrás; Columbus Instruments, Columbus, OH, USA) használtunk. Röviden: az egereket külön-külön kaloriméter-kamrákban helyeztük el, amelyeken keresztül ismert O2-koncentrációjú levegő és állandó áramlási sebességgel haladt a levegő. A rendszer automatikusan kivette a gázmintákat, és kiszámította az egerek elfogyasztott O2 és CO2 térfogatát. A hőköltséget mind a világos, mind a sötét ciklus alatt mértük, az élelmiszer-fogyasztás mérése pedig egy vízszintes fotoszár megtörésén alapult.

statisztikai elemzések

A circSAMD4A lebontása gátolja a preadipocita differenciálódást

Elhízott beteg szövetmintáiból izoláltunk preadipocitát, és a back-splice szekvenciát megcélzó siRNS-ek segítségével circSAMD4A leütést hajtottunk végre (3D ábra). A sikeres leütést qRT-PCR alkalmazásával igazoltuk, amely azt mutatta, hogy a hSAMD4A expressziója nem változott (3E. És S1B. Ábra). Továbbá az circSMAD4A knockdown preadipocytákban az Oil Red O festés a differenciálódás gátlását jelezte (S2. Ábra). Ezenkívül a preadipocita differenciálódási biomarkerek, a C/EBP-α és a PPAR-y [21,22] csökkentek a circSAMD4A leütési sejtekben, qRT-PCR és Western blot analízissel számszerűsítve (3F-H ábra).

A CircSAMD4A mint független kockázati tényező, amely megjósolhatja a nem-remissziót az elhízott betegeknél. (A) CircSAMD4A expresszió zsírszövetekben 40 elhízott és 20 sovány beteg esetén. (B) Pearson-korreláció a circSAMD4A expresszió és a BMI között 60 elhízott beteg zsírszövetében. (C) ROC görbe a circSAMD4A-ra, jelezve annak diagnosztikai értékét elhízott betegeknél. (D) A CircSAMD4A back-splice csomópontjára jellemző siRNS helyek sematikus ábrázolása. (E) A circSAMD4A expressziója siRNS kezelést követően qRT-PCR alkalmazásával. (F-G) A C/EBP-a és a PPAR-y expresszióját qRT-PCR alkalmazásával számszerűsítettük a circSAMD4A kopogtatása után a preadipocyták differenciálása során. (H) A C/EBP-a és a PPAR-y expresszióját Western blot assay alkalmazásával számszerűsítettük a circSAMD4A kopogtatása után a preadipocita differenciálás során. Az adatok átlag ± SD; szignifikáns különbséget a Student t teszttel azonosítottunk. * P

Megkapta 2019.11.24
Elfogadva 2020-3-1
Megjelent 2020-3-26