A sovány testtömeg és a metformin nem elegendő az endometrium hiperpláziájának megelőzésére a PTEN-ben inaktiváló mutációkat hordozó egereknél

Dr. Rosemarie E. Schmandt

Nőgyógyászati Onkológiai és Reproduktív Orvosi Osztály, 1362

Texasi Egyetem, MD Anderson Rákközpont, PO Box 301439

Houston, TX 77230-1439 (USA)

Kapcsolódó cikkek a következőhöz: "

Facebook
Twitter
LinkedIn
Email

Absztrakt

Bevezetés

Az endometrium rák (EC) a leggyakoribb nőgyógyászati malignus daganat az Egyesült Államokban, 2014-ben becslések szerint 52 630 új esetet diagnosztizáltak [1]. Az endometrium tumorokat hagyományosan két típusba sorolták [2,3,4]. Az I. típusú vagy endometrioid endometrium karcinómák, amelyek az összes EK-eset több mint 80% -át képviselik, elhízással, hiperinsulinémiával és a nem ellenálló ösztrogén tartós kitettségével társulnak. Úgy gondolják, hogy ezek a daganatok az endometrium hiperplázia (EH) progressziójából komplex atipikus hiperpláziává válnak jól differenciált endometrium carcinomákká (EC). A II. Típusú vagy nonendometrioid endometrium karcinómák magukban foglalják a méh serózus karcinómáit, és jellemzően agresszívebbek és ösztrogénfüggetlenebbek. A közelmúltban mind az I., mind a II. Típusú daganatok átfogó genomikai elemzése alapján az EC-ket tovább osztályozták több altípusba [2,5,6,7,8]. Valójában az EC különböző szövettanainak patogenezisében rejlő molekuláris változások részletes jellemzése megalapozza a racionális betegségmegelőzési stratégiákat és a terápiás gyógyszertervezést [2,5,6,7,8].

Az I. típusú EC leggyakrabban megfigyelt genetikai mutációi a foszfatáz és a tenzin homológ (PTEN) tumorszuppresszor génben fordulnak elő. Úgy gondolják, hogy a PTEN mutáció korai esemény az EC patogenezisében, és előfordulása a betegség előrehaladtával növekszik [9]. Az EH eseteinek akár 20% -a hordoz mutációt a PTEN-ben, míg az I. típusú EC-k több mint 80% -a rendelkezik inaktiváló mutációkkal a PTEN-ben [10]. A PTEN fehérjeként és lipid-foszfatázként is működik [11,12]. Előnyösen defoszforilálja a foszfatidil-inozitol-3,4,5-triszfoszfátot (PIP3), ezzel szemben a foszfatidil-inozitol-4,5-biszfoszfát-3-kinázzal (PI3K) szemben. A PTEN fehérje funkciójának vagy expressziójának elvesztését eredményező mutációk a PI3K/AKT/mTOR út hiperaktivitásával társulnak, ezáltal fokozzák a sejtek proliferációját és túlélését, metasztázisokat és angiogenezist, az anyagcsere változását és a kemoterápiás szerekkel szembeni ellenállást [11,12, 13].

A géntechnológiával módosított PTEN „knockout” egerek jól jellemzett állatmodellt képviselnek az EH I. típusú EC-vé történő progressziójának vizsgálatához. A PTEN inaktiváló mutációinak minden heterozigóta nőstény egere 26 hetes korára kifejti az EH-t, az egerek 20% -a 40 héttel alacsony fokú EC-re fejlődik [14,15,16]. Ezt a hatást a PTEN szisztémás heterozigóta megszakadásával (PTEN +/-) és az endometrium heterozigóta megzavarását célzó modellekben figyeljük meg Cre-Lox rendszer segítségével (PR Cre/+ PTEN flox/+). Korábban kimutattuk, hogy az everolimusz (RAD001), egy mTOR inhibitor, megakadályozta az EH progresszióját ezekben az állatokban [17], jelezve, hogy ez az állatmodell hasznos lehet az EH kemoprevenciájának vizsgálatához.

Az elhízás nagymértékben növeli az EC kockázatát [3]. Az Amerikai Rákkutató Intézet becslései szerint az EK 59% -a megelőzhető egészséges testsúly fenntartásával és fizikailag aktív tevékenységgel [18]. A C57BL/6 háttérrel tenyésztett PR Cre/+ PTEN flox/+ egerek hajlamosak a diéta okozta elhízásra, kísérő enyhe vagy mérsékelt hiperglikémia és hiperinsulinémia, amelyek utánozzák az emberi állapotot [19,20,21]. Figyelembe véve az elhízás szerepét az 1-es típusú EK-kockázatban, arra kerestük a választ, hogy az elhízás felgyorsítja-e az EH megjelenését és annak EC-re való előrehaladását a PR Cre/+ PTEN flox/+ egér modellben.

A metforminról, a biguanid gyógyszerről, amelyet általában a 2-es típusú cukorbetegség kezelésére használnak, a közelmúltban kimutatták, hogy növekedésgátló hatást gyakorol különféle rákos megbetegedésekre, beleértve az EC-t in vitro és in vivo egyaránt [22,23,24,25]. Saját csoportunk legújabb tanulmányai patkánymodellben igazolták az endometrium válaszát a metformin terápiára [24,26]. A metformin több mechanizmus révén csökkenti a sejtek proliferációját. A metformin növeli az inzulinreceptor érzékenységet és csökkenti a keringő inzulinszintet, ezáltal modulálva az inzulinreceptor által közvetített növekedést. A metformin aktiválja a növekedést gátló AMP-függő kináz (AMPK) útvonalat is, amely ellensúlyozza a PI3K/AKT és a MAPK útvonalon keresztüli jelátvitelt a növekedési faktorok különféle receptoraitól lefelé [22,27]. Ezért az elhízás EH patogenezisére gyakorolt hatásainak vizsgálata mellett azt is megvizsgáltuk, hogy a metformin képes-e kemoprevenciós ágensként működni a PR Cre/+ PTEN flox/+ egerekben, legyenek azok soványak vagy elhízottak.

Anyagok és metódusok

Állatok

Pontozás az EH számára

Az endometrium szöveteinek immunhisztokémiai festése

Az elhízás és a metformin hatását az egér endometrium proliferációjára formalinnal rögzített, paraffinba ágyazott szövetben Ki67 festéssel (BD Biosciences, San Diego, Kalifornia, USA) értékeltük a gyártó utasításait követve. Az endometrium szövetekben az apoptózis mértékét immunhisztokémiai (IHC) festéssel határoztuk meg a hasított kaszpáz-3-on (Asp175; Cell Signaling, Danvers, MA, USA). A metszeteket Mayer hematoxylinnel festették be. Az 5-10 nagy teljesítményű mikroszkópos mezőben pozitívan festett Ki67 vagy kaszpáz-3 sejtek átlagos számát tárgylemezenként megszámoltuk, és a következőképpen számítottuk: 200 × (pozitívan festett endometrium sejtek száma/összes endometrium sejt). Szöveteket festettek az inzulin és az IGF-1 receptor szignáljának lefelé mutató markereire is, beleértve a foszfo-S6 riboszomális fehérjét (Ser235/236), a foszfo-AKT (Ser473), a foszfo-p44/42 MAPK (Thr202/Tyr204) és a foszfo- acetil-CoA karboxiláz (Ser79) (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) és a pontozás a korábban közzétett eljárások szerint [24].

Szérumelemzések

A szérum adiponektin szintjét az egér Adiponectin ELISA Kit (Millipore, Billerica, MA, USA) alkalmazásával értékeltük. A szérummintákat három példányban teszteltük.

Statisztikai analízis

A következő szövet- és szérummarkerek mindegyikéhez: Ki67, pS6rp (foszfo-S6 riboszomális fehérje), pACC (foszfo-acetil-CoA karboxiláz), kaszpáz 3, pERK (foszfo-p44/42 ERK), pAKT (foszfo-AKT) és az adiponektin esetében kiszámítottuk az egyirányú varianciaanalízist. Dunnett-tesztet alkalmaztak az LFD-csoport (kontroll) post-hoc összehasonlítására a kísérleti csoportokkal (diéta és metformin). Az összes teszt kétoldalas volt, és p Cre /+ PTEN flox /+ Egerek

A kezelési csoportok és a kontrollcsoportok közötti szövettani pontszámok statisztikailag nem különböztek egymástól (1. ábra; 1. táblázat). Az átlagos hiperplázia pontszám 4,7, 5,9, 5,9 és 6,1 volt a kontroll sovány egereknél, az elhízott egereknél, illetve a metforminnal kezelt sovány és elhízott egereknél, az egerek többségének 2. fokú hiperpláziája volt, amint azt 26-os pontozási rendszerünk meghatározta hétig, függetlenül a kezelési csoporttól. A metformin és a diéta/elhízás endometrium proliferációra gyakorolt hatását összehasonlítottuk a Ki67 IHC festésével. A HFD és az LFD csoportok közötti szignifikáns súlykülönbség ellenére (1a. Ábra), az EH-ban nem figyeltünk meg szignifikáns különbséget a 26. héten (1b. Ábra). Ezenkívül a metformin sem elhízott, sem sovány állatoknál nem eredményezett lényeges változásokat az állatok tömegében vagy az EH fejlődésében. Összességében nem figyeltünk meg szignifikáns különbséget a hiperplázia pontszámban vagy az endometrium proliferációjában a négy kezelési csoport egyikében sem (1. ábra; 1. táblázat).

Asztal 1

Az elhízás és a metformin hatása az endometrium hyperplasia fokára és a proliferatív jelzésre elhízott és sovány PR Cre/+ PTEN f/f egerekben

1. ábra

Az elhízás és a metformin kezelésnek nincs kimutatható hatása az EH mértékére a PR Cre/+ PTEN flox/+ egér modellben. a A PR Cre/+ PTEN flox/+ egereket HFD-vel vagy LFD-vel etették, és kezeletlenül vagy metforminnal (1000 mg/kg) kezelték ivóvízben. Az állatokat lemértük és eutanizáltuk a 26. héten. Szérumot és reproduktív szerveket gyűjtöttünk elemzés céljából. A metforminnal kezelt vagy kezeletlen LFD-vel táplált egér súlya szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a HFD-vel táplált egerek súlya. A metforminra adott válaszban sem HFD-vel, sem LFD-vel táplált állatokban nem volt szignifikáns változás. b A méhnyálkahártya szövetben a HE festést követően megvizsgáltuk a hiperplázia jelenlétét, és a sejtek proliferációját IH67 festéssel elemeztük Ki67-re. c Nem figyeltünk meg szignifikáns különbséget a sejtproliferációban a kezelési csoportok között, amelyet az endometrium Ki67-pozitív sejtjeinek százalékos aránya határoz meg.

A sejtszaporodás és az inzulin/IGF-1 jelzés markereit nem befolyásolja sem a diéta okozta elhízás, sem a metformin a PR endometriumában Cre /+ PTEN flox /+ Egerek

Az elhízás és a metformin általánosan befolyásolt jelátviteli utak változását az endometriumban IHC festéssel értékeltük aktivációs specifikus antitestek alkalmazásával. A megállapításokat az 1. táblázat foglalja össze. A pS6rp (Ser235/236), a pAKT (Ser473), a pERK (Thr202/Tyr204) és a pACC (Ser79) IHC festési pontszámaiban nem figyeltünk meg szignifikáns különbséget a három közül az endometrium szövetei között. kezelési csoportok az LFD kontroll csoporthoz képest. Ezenkívül a kaszpáz 3 IHC festéssel mért apoptózis különbségeket nem észleltünk a kontroll sovány egerek, az elhízott egerek és a metforminnal kezelt sovány és elhízott egerek között.

A metformin elnyomja az adiponektin expressziót mind elhízott, mind sovány PR esetén Cre /+ PTEN flox /+ Egerek

Csoportunk legújabb tanulmányai patkánymodellben igazolták az endometrium válaszát a metformin terápiára [24]. A nyilvánvaló hatás hiánya a jelátvitelre a PR Cre/+ PTEN flox/+ egerek endometriumában arra késztetett minket, hogy megvizsgáljuk, hogy ez az állatmodell szisztémásan ellenáll-e a metformin hatásainak.

Az inzulinszinteket nem lehetett használni a metformin-válasz markerként, mivel az állatok ebben a vizsgálatban nem voltak koplalva; Huypens és mtsai. [32] megfigyelte, hogy a metformin csökkenti az adiponektin expresszióját és felszabadulását az egér (3T3-L1) adipocytákban. Ezért teszteltük az adiponektin szérumszintjét a metforminra adott válasz helyettesítő markerjeként (1. táblázat). A kontroll sovány egerekhez (14,5 ng/ml) képest az adiponektin szintje szignifikánsan csökkent a metformin kezeléssel mind a sovány (10,5 ng/ml, p = 0,002), mind az elhízott (10,9 ng/ml, p = 0,007) egerekben. Ezek a megállapítások megerősítik, hogy a PR Cre/+ PTEN flox/+ egerek szisztémásan reagálnak a metforminra, annak ellenére, hogy a méhnyálkahártya szövetében nyilvánvalóan nincs válasz erre a gyógyszerre.

Vita

A PTEN tumor szuppresszor gén inaktiváló mutációit általában az I. típusú EC-ben figyelik meg, és úgy gondolják, hogy a betegség patogenezisének korai eseményét jelentik. Ennek a hipotézisnek az alátámasztásaként a PTEN inaktiváló mutációinak heterozigóta nőstény nőstény egereinek 100% -a 26 hetes életkorára fejleszti az EH-t, ezen egerek 20% -a 40 hetes korára az 1. fokozatba fejlődik. Korábbi tanulmányaink kimutatták, hogy a PTEN heterozigóta egerek hasznos modellt képviselnek a kemoterápiás gyógyszerek, például az everolimusz preklinikai értékelésében, amely megakadályozhatja az EH-ból az EC-be történő progressziót. A jelenlegi tanulmányban bemutatott eredmények azonban arra utalnak, hogy ez a modell kevésbé lehet hasznos a viselkedési terápiák, például az étrend és a testmozgás, vagy az olyan gyógyszerek, mint a metformin értékelésében, amelyek célja a legkorábbi átalakulás normálisból hiperplasztikus endometrium.

A PR Cre/+ PTEN flox/+ egér modellben az étrend okozta elhízás nem növelte az EH mértékét az LFD-vel táplált sovány állatokhoz képest. Nem volt szignifikáns különbség a Ki67 festésben, amely a proliferáció szöveti markere. A PI3K/AKT és MAPK útvonalon keresztüli jelzést a PTEN genetikai mutációval rendelkező endometrium szövetekben az elhízás nem befolyásolta. Továbbá, annak ellenére, hogy befolyásolta az adiponektin szisztémás szintjét, a metformin antidiabetikus gyógyszer nem volt nyilvánvaló hatással az EH-ra sem elhízott, sem sovány PR Cre/+ PTEN flox/+ egerekben. Összességében ezek az adatok azt sugallják, hogy az endometriumban genetikailag megszerzett PTEN mutáció elegendő volt az EH kialakulásának elősegítésére, és hogy ezek az elváltozások ellenállnak az elhízás és a metformin hatásainak.

Arra a következtetésre jutunk, hogy bár a PTEN heterozigóta knockout egér modell továbbra is hasznos a Cowden-betegséggel összefüggő EC beavatkozásainak preklinikai értékelésében és a PTEN mutációk által vezérelt sporadikus EC kezelésében, ez nem alkalmas a korai EC kemoprevenciójára irányuló összes vizsgálatra.

Köszönetnyilvánítás

Köszönetet mondunk Dr. Franco DeMayo-nak az endometrium rák PR Cre/+ PTEN flox/+ egérmodelljének használatáért. Köszönetet mondunk Dr. Russell Broaddusnak az egerek endometrium hiperpláziájának értékelésében nyújtott segítségéért. Ezt a projektet részben a Nemzeti Rákkutató Intézet P50CA098258 számú támogatása, részben pedig a Nemzeti Egészségügyi Intézet támogatta MD Anderson rákközpont támogatási támogatásával a CA016672 sz. Ez a cikk Dr. Mike Milam emlékének szenteltetett, akinek az endometrium hiperplázia PTEN modelljét használó tanulmányai továbbra is táplálják a laboratóriumunkban folyó kutatásokat.

Közzétételi nyilatkozat

A szerzők összeférhetetlenségről nem számolnak be.