A szungit antioxidáns és gyulladáscsökkentő hatása az ultraibolya B besugárzás okozta bőrkárosodás ellen szőrtelen egerekben

Ma. Húsvéti öröm Sajo

1 Környezet-orvosi Biológiai Tanszék, Wonju Orvostudományi Főiskola, Yonsei Egyetem, Wonju, Gangwon 220-701, Koreai Köztársaság

Cheol-Su Kim

2 Mikrobiológiai Tanszék, Wonju Orvostudományi Főiskola, Yonsei Egyetem, Wonju, Gangwon 26426, Koreai Köztársaság

Soo-Ki Kim

2 Mikrobiológiai Tanszék, Wonju Orvostudományi Főiskola, Yonsei Egyetem, Wonju, Gangwon 26426, Koreai Köztársaság

Kwang Yong Shim

3 Belgyógyászati Klinika, Wonju Orvostudományi Főiskola, Yonsei Egyetem, Wonju, Gangwon 26426, Koreai Köztársaság

Tae-Young Kang

4 Reumatológiai Osztály, Wonju College of Medicine, Yonsei University, Wonju, Gangwon 26426, Koreai Köztársaság

Kyu-Jae Lee

1 Környezet-orvosi Biológiai Tanszék, Wonju Orvostudományi Főiskola, Yonsei Egyetem, Wonju, Gangwon 220-701, Koreai Köztársaság

5 A szegénység enyhítésének és a nemzetközi fejlődés intézete (IPAID), Yonsei Egyetem, Wonju Campus, Wonju, Gangwon 220-710, Koreai Köztársaság

Absztrakt

1. Bemutatkozás

Ebben a tanulmányban a shungit terápiás hatásait vizsgáltuk az UVB által kiváltott bőrkárosodások ellen, összehasonlítva az ásványi anyagokban gazdag shungit és az ásványi anyagokat nem tartalmazó shungit antioxidáns hatását a kereskedelemben kapható fullerén C60-mal. Feltételezzük, hogy a szungitnak antioxidáns és gyulladáscsökkentő hatása lehet az ultraibolya B- (UVB-) által kiváltott bőrkárosodás ellen a szőrtelen egerekben. Ennek a hipotézisnek az igazolására az ásványi anyagokban gazdag és ásványianyag nélküli shungittal kezelt szőrtelen egerek fiziológiai bőrparamétereit, immun-redox profilozását és oxidatív stresszel kapcsolatos jelzését vizsgáltuk.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Egerek

Nyolc hetes szőrtelen egereket az Orient Bio Inc.-től (Seongnam, Koreai Köztársaság) szereztünk be, és 12: 12 órás világos sötétben 22 ± 2 ° C-on és 40–60% páratartalom mellett tartottuk. Az egereket egy hétig akklimatizáltuk, és véletlenszerűen hat csoportba soroltuk: a nem UVB-besugárzott normál kontrollcsoportot (NC) és az öt UVB-besugárzott csoportot: nincs kezelési csoport (UV), fullerénnel kezelt csoport (PC), olívaolajjal kezelt csoport (OIL), ásványi anyagokban gazdag shungittal kezelt csoport (MRS) és ásványianyag nélküli shungit kezelt csoport (MLS). Körülbelül 200 μl kezelési vegyületet (200 μg/ml) adtak helyileg a kezét kesztyűben, ugyanazon nyomást gyakorolva az egér hátsó oldalán. A kísérlet végén az egereket inhalációs érzéstelenítőkkel, CO2 gázzal 20 másodpercig eutanizáltuk, majd az egereket lefejeztük. A kísérlet állatkísérleteit és protokollját a Yonsei University Wonju Campus (YWC-151113-1) intézményi állatgondozási és felhasználási bizottsága (IACUC) hagyta jóvá.

2.2. UVB-expozíció

A kísérleti egereket műanyag ketrecbe helyeztük, és besugároztuk a TL 40 W/12RS Philips, egy szűretlen fluoreszkáló naplámpák (Amszterdam, Hollandia) segítségével, amelyek 290–320 nm sugarakat bocsátottak ki. Az egerek hátsó bőrfelületének távolsága a lámpáktól 20 cm volt. Az UVB-lámpa intenzitása 0,75 ± 0,10 mW/cm 2 volt a Lutron Electronics Inc. (Tajpej, Tajvan) YK-34 UV ultraibolya fénymérőjével, az UVB besugárzott összesített dózisenergiája 2700 mJ/cm2 volt. Az egereket 15 percig besugároztuk 2 egymást követő napon.

2.3. Vegyi és szungit szuszpenzió készítés

A gyártott buckminsterfullerene C60-at a Vaughter Wellness-től (London, Egyesült Királyság) vásárolták 99,8% -os tisztasággal. Az ásványi anyagokban gazdag shungitot magas hőmérsékleten alkalikus kezelésként KOH-val kezelték. Az ásványianyag-tartalmú shungitot HNO3-mal és az ásványi anyagokban gazdag shungit magas hőmérsékletű (3000 ° C) kezelésével kezelték. Ezeket az elegyeket örvény és szonikátor segítségével ultrahanggal kezeltük, amíg az összes oldatot erőteljesen összekevertük.

2.4. Az ásványianyag nélküli shungit jellemzése

A shungit ásványi anyag-mentes összetételét és vizualizációját energia-diszperzív röntgen (EDX) spektroszkópiával elemeztük. Az ásványi anyag százalékos összetétele 86,43% szenet, 0,18% nátriumot, 1,33% magnéziumot, 3,17% szilíciumot, 1,09% ként, 0,22% klórt, 0,95% káliumot, 5,33% kalciumot, 1,06% vasat és 0,2% rézet tartalmaz.

2.5. A bőrfelület fiziológiai elemzése

Az egerek bőrállapotát 7 napos kezelés előtt és után értékeltük bőr diagnosztikai eszközzel, Aramo TS Device (Seongnam, Koreai Köztársaság). Az eszköz egy átfogó rendszer a bőr számos dimenzió nélküli paraméterének noninvazív, optikai elemzéséhez: nedvesség, rugalmasság, faggyúporozitás, simaság (egyenletesség), elszíneződések (pigmentáció) és ráncok. A méréseket az egerek hátsó oldalán található, nagyon specifikus pontokon végezték, és az eredmények a kezelés előtti és utáni különbségeket mutatták a javulás értékeléséhez.

2.6. Immunprofil

2.6.1. Fehérvérsejt (WBC) és differenciálszámának elemzése

Vért vettünk a retro-orbitális plexusból antikoagulánssal bevont csövekbe, és automatikus keverővel 5 percig kevertük. Ezt követően a WBC-t és annak differenciális tagjait, például limfocitákat, monocitákat, neutrofileket, eozinofileket és bazofileket automatikus véranalizátorral mértük a HEMAVET HV950 FS, Drew Scientific Inc. (Texas, USA) segítségével.

2.6.2. Szérum és bőr lizátum gyulladásos citokinek

A szérum és a bőr lizátum gyulladásos citokinjeit, köztük az IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, IL-KC és TNF-a elemzését Bio-Rad (Kalifornia, USA) Bio-Plex citokin vizsgálattal végeztük. a gyártó utasításait. Az egyes adipokinek és citokinek standard görbéit a kitekben megadott referencia-koncentrációk felhasználásával állítottuk elő. Az átlagos fluoreszcencia intenzitást Bio-Rad Bio-Plex 200 rendszerével, a Bio-Plex 200 Multiplex Bead Array System ™ (Kalifornia, USA) segítségével szereztük be egy Luminex technológiával, és egy kapcsolódó paraméterrel elemeztük 5 paraméteres logisztikai módszerrel.

2.7. Redox profil

2.7.1. Intracelluláris reaktív oxigénfajok (ROS) detektálása

Az Enzo Life Sciences Inc. (New York, USA) ROS/RNS detektálókészletét a gyártó utasításainak megfelelően használtuk a szungitvegyületek oxidatív stresszre és szuperoxidra gyakorolt hatásának meghatározására a szérumban és a bőr lizátumaiban. Huszonöt (25) μL mintát töltöttünk be, és minden egyes üregbe detektáló oldatot adtunk. A lemezt a DTX-800 multimódusú mikrolemez-olvasóban olvasta fel a Beckman Counter Inc. (Kalifornia, USA) 485/20 gerjesztésű és 528/20 emissziós szűrőkészlet segítségével az oxidatív fajok kimutatására.

2.7.2. NO assay

Az egerek vérszérumában és bőr lizátumaiban lévő nitritet (NO2 -) a Griess reagens segítségével mutattuk ki a Promega Corp. (Madison, USA). Röviden: 50 μl szérumot összekevertünk azonos térfogatú Griess-reagenssel egy 96 üregű mikrotiterlemezen, és szobahőmérsékleten 15 percig inkubáltuk. Az abszorbancia leolvasása 540 nm-en történt, Beckman Counter Inc. (Kalifornia, USA) DTX-880 multimódusú mikrolemez-olvasóval. Az NO2-koncentrációt a reprezentatív NO2-standard görbe összehasonlításával számítottuk, amelyet nátrium-nitrát kétszeres hígításával generáltunk.

2.7.3. Antioxidáns endogén enzimaktivitások

A szuperoxid-diszmutáz (SOD), a glutation-peroxidáz (GPx) és a mieloperoxidáz (MPO) aktivitását a szérumban és a bőr lizátumokban a Biovision kit (Kalifornia, USA) segítségével mértük. A nyers bőr lizátumot 14 000 fordulat/perc sebességgel 15 percig centrifugáltuk. 4 ° C-on, és a törmeléket eldobták. Ezután a bőr lizátumának fehérje koncentrációját ellenőrizzük a Pierce ™ BCA Protein Assay Kit segítségével a Thermo Scientific (Illinois, USA) részéről. Végül a sejtlizáták normalizált koncentrációit használtuk a különböző antioxidáns enzimek (SOD, GPx és MPO) aktivitásának mérésére a gyártó utasításai szerint.

2.8. Western Blot elemzés

Röviden, a normalizált fehérjekoncentrációval készített előkészített bőrlizátumot egyenletesen terheltük és szeparáltuk elektroforézissel SDS-poliakrilamid géleken. Tíz (10) százalékos elválasztó gélt és 5% halmozó gélt készítettünk a következő komponensekkel. A 10% -os elválasztó gél (10 ml) 4,0 ml dH2O-ból, 3,3 ml 30% akrilamid-keverékből, 2,5 ml 1,5 M Tris-ből (pH 8,8), 100 μl 10% SDS-ből, 100 μl 10% APS-ből és 4 μl TEMED-ből állt. A 4% -os halmozó gél (5 ml) 2,7 ml dH2O-ból, 670 μl 30% akrilamid keverékből, 500 μl 1,0 M Tris-ből (pH 6,8), 40 μl 10% SDS-ből, 40 μl 10% APS-ből és 4 μl TEMED-ből áll. A 15 μl

20 μL mintát töltöttünk be optimalizált koncentrációjú mintatöltő pufferrel a gélbe. Ezután 30 mA-ben, 70-80 v-ban fog működni. A PVDF membránokat 5% zsírmentes sovány tejjel blokkoltuk szobahőmérsékleten 2 órán át, és a következő primer antitestekkel inkubáltuk: foszfo-JNK és foszfo-p38, ERK, Nrf2 és β-aktin (hígítás: 1: 2000; Cell Signaling Technology, Massachusetts, USA) Tris-pufferolt sóoldatban/tween 20-ban (1X TBST), 5% szarvasmarha-szérum albumint tartalmazó éjszakán át, 4 ° C-on. A használt másodlagos antitest nyúlellenes volt (hígítás: 1: 2000; Cell Signaling Technology), majd szobahőmérsékleten 2 órán át inkubáltuk. A specifikus fehérje sávokat a fokozott kemilumineszcenciával (ECL Pierce Biotechnology) tettük láthatóvá UVP Biospectrum 600 képalkotó rendszer (UVP, LLC, Upland, CA, USA) alkalmazásával. β-Actint (hígítás: 1: 2000, Cell Signaling Technology) használtunk terhelés kontrollként a teljes fehérjetartalomra.

2.9. Adatkezelés és elemzés

A statisztikai elemzést varianciaanalízissel (ANOVA) végeztük, majd ezt követõ többszörös összehasonlító teszt (Dunnett többszörös összehasonlító tesztje), a GraphPad Prism 7.0 verziójú szoftvercsomagok (Kalifornia, USA) felhasználásával. A különbségeket szignifikánsnak tekintettük ∗ p at p ∗∗∗ p ∗∗∗∗ p 1. ábrán). Ezenkívül az érdesség, a pigmentáció és a ránc jelentősen csökkent, és javulást mutatott a shungit 7 napos helyi alkalmazása után. Az MRS és az MLS csoportok pórusmérete nem mutatott szignifikáns csökkenést, de javult a PC-hez képest. Ezek az eredmények klinikai bizonyítékokat mutatnak az MRS és az MLS antioxidáns és gyulladáscsökkentő hatásairól a külső bőrfelületen.