A szén-dioxid antropogén növekedése veszélyezteti a növények védelmét az invazív rovarok ellen

  • Keresse meg ezt a szerzőt a Google Tudósban
  • Keresse meg ezt a szerzőt a PubMed oldalon
  • Keresse meg ezt a szerzőt ezen a webhelyen
  • Levelezés céljából: talá[email protected]

Hozzájárult: R. R. Berenbaum, 2008. január 22. (beérkezett felülvizsgálatra 2007. december 19.)

antropogén

Ez a cikk rendelkezik Javítással. Lásd:

Absztrakt

Az antropogén emisszió jelenlegi arányában az előrejelzések szerint a 381 μmol mol-1 légköri szén-dioxid (CO2) koncentráció 2050-re 550 μmol mol-1-re emelkedik (1). A CO2-növekedés az előrejelzések szerint növeli az agroökoszisztémák termelékenységét a fotoszintézis és a vízfelhasználás hatékonyságának javításával, különösen a C3 növényeknél (2), bár a fokozás nagyságának pontos becslése kísérleti megközelítéstől függően változik (3). Az ilyen előrejelzések azonban általában nem veszik figyelembe a növények és a növényevő rovarok közötti kölcsönhatások lehetőségét az emelkedett CO2 növénytermesztésre gyakorolt ​​megtermékenyítő hatásának módosítására (4). A növényevő növények hatása a megnövekedett szén-dioxidra adott válaszokra azonban könnyen mérhető a szabad levegő gázkoncentráció-gazdagítás (FACE) kísérleteiben, ahol a rovarok mozgása a mezei parcellákra korlátlan.

Jellemzően a megemelkedett CO2 csökkenti a növény gazdanövekedését a levél C: N arányának, a levél fajlagos tömegének és vastagságának, a nem strukturális szénhidrátok arányának és a fenolos vegyületeknek való megoszlásának növelésével (5 ⇓ – 7). Azonban más vegyületek, például a proteináz inhibitorok (PI), szerepet játszhatnak a növényvédelemben, befolyásolva a fehérjék emészthetőségét és csökkentve a rovarok által a növekedéshez, fejlődéshez és szaporodáshoz szükséges szabad aminosavak elérhetőségét (8). A cisztein-proteinázok gyakoriak sok koleoptera (9, 10) enyhén savas középbélében (pH 5–7), a növényi szövetekben pedig a cisztein PI-k (CystPI-k) csökkentik a növekedést és fejlődést azáltal, hogy gátolják ezeket a proteinázokat (10, 11). A növényekben a jázmonát jelátviteli út indukálása növényevők károsodásával a CystPI-k fokozott szintéziséhez vezet (12).

A szójababnak (Glycine max), a világ legterjedtebb termésű hüvelyesének egy konstitutív CystPI génje (L1) és két indukálható CystPI génje van (N2 és R1) (13, 14). A szójabab CystPI-k, valamint a szintetikus CystPI, a transzepoxiszukcin-l-leucil-amido (4-guanidino) bután (E-64) gátolják a bél cisztein (katepszin L-szerű) aktivitását, a lárva és a kifejlett nyugati kukorica növekedését és túlélését. gyökérféreg (WCR; Diabrotica virgifera virgifera LeConte: Coleoptera) (10, 13, 15, 16). Bár a WCR általában gazdasági sérülést okoz a kukorica gyökereinek károsításával (Zea mays), a WCR egy változata a szója lombjaival táplálkozik, és tojást rak a szójaföldekre (17). A japán bogár (JB; Popillia japonica Newman: Coleoptera), széles körben polifág faj, amelyet 1916-ban hoztak be az Egyesült Államokba, és mára kiterjesztette elterjedési területét a Közép-Nyugat egész területén, és mintegy 800 vadon termesztett és termesztett növényfaj táplálkozik 79 családban; a szójabab számos gazdanövénye között található (18). A FACE-kísérletek során termesztett szójababokban a megnövekedett CO2 növelte mind a JB, mind a WCR növényzetét és petesejtjét (19 ⇓ –21). Bár a cukrok stimulálhatják a táplálkozást a JB-ben (18), a levelek magasabb szénhidrátszintje nem számolt e faj preferenciájának vagy termékenységének változásával (21), nyitva hagyva annak lehetőségét, hogy a növényi kémiai védekezés, például a CystPI, közvetíthesse ezeket a változásokat.

A cisztein-proteinázok szerepének vizsgálatához a koleoptera növényevőkkel szembeni megváltozott rezisztenciában szójababot termesztettek az Illinois-i Egyetemen, Urbana – Champaign-ban létrehozott SoyFACE létesítményben. A SoyFACE létesítmény, amely akadályok nélkül, teljesen szabadtéri körülmények között emeli a CO2-t, lehetővé tette számunkra, hogy megvizsgáljuk azt a mechanizmust, amelyben az emelkedett CO2 növeli a szójabab fogékonyságát a természetben előforduló növényevőkre. Konkrétan megvizsgáltuk, hogy az emelkedett CO2 növekedése szabályozza-e a CystPI-t és más védekező géneket szabályozó jelátviteli hormonokkal társuló gének expresszióját, csökkent-e a szójabab lombozatában a CystPI aktivitás az emelkedett CO2 alatt, és hogy a JB és a WCR magasabb emésztési szintet mutat-e. cisztein proteináz aktivitás a belükben, ha megemelkedett CO2 alatt termesztett szójabab leveleket fogyasztanak. A növényvédő szerek hatására a védekező képességek mozgósításának csökkenése potenciális mechanizmus lehet az elszámolt szén-dioxid alatt termesztett szója lombozatát fogyasztó bogarak fokozott teljesítményének és a szójababnövények által megnövekedett szén-dioxid mellett terepi körülmények között elszenvedett károk megnövekedett teljesítményének a figyelembe vétele.

Eredmények

A megemelkedett CO2 hatásának meghatározására a szójabab védekező génjeinek expressziójára félig mennyiségi RT-PCR-rel elemeztünk öt, teljesen környezeti vagy megnövekedett szén-dioxid mellett termesztett levelekből származó gént. Elemeztük az 1-aminociklopropán-1-karboxilát-szintáz (acc) expresszióját, amely az etilén jelző hormon, a jezmoninsav (JA) jelző hormonhoz kapcsolódó két gén, a lipoxigenáz 7 (lox7) bioszintézisének legfontosabb szabályozási pontja. és 8 (lox8), valamint a vegetatív lipoxigenázt 6 kódoló gén (lox6), amely nem kapcsolódik a növényi jelátvitelhez és belső kontrollként szolgált (22 ⇓ –24).

Az emelkedett CO2 nem gyakorolt ​​fő hatást az acc expressziójára (P = 0,92). Azonban a JB által megnövekedett CO2 és a növényevő növények közötti jelentős kölcsönhatás (P ≤ 0,01) azt jelzi, hogy az emelkedett CO2 alatt termesztett levelekben a növényi eredetű acc indukciója csökkent a környezeti CO2-hez képest (1. ábra). Egy nappal a JB általi károsodás után az acc 86% -ban indukálódott a környezeti CO2-ben termesztett levelekben, de ez az indukció csak 54% volt az emelkedett CO2-ben termesztett levelekben. Az acc indukciója 3 nappal a támadás után 222% -ra nőtt a környező levelekben, de az emelkedett CO2-ban termesztett levelekben 3 nap után csak 155% -ra nőtt. Hasonló eredményeket találtunk a WCR-ek által okozott károkra reagálva (az adatokat nem közöljük).

JA és etilén bioszintézissel kapcsolatos gének expressziós elemzése. Magas [CO2] (CO2) vagy környezeti [CO2] (A) hőmérsékleten termesztett szójabab teljesen kitágult leveleiből származó öt gén kvantitatív RT-PCR-je: 1-aminociklopropán-1-karboxilát-szintáz (acc), lipoxigenáz 7 (lox7), 8 (lox8) és 6 (lox6). Az RNS-t 1 vagy 3 napig vagy nem támadott (C), vagy megtámadott levelek négy ismétléséből (telkenként egy ismétlésből) kivonták japán bogarak (B), és reverz átírással cDNS-be. A PCR reakciókat négy független cDNS mintából replikáltuk az összes primer esetében. A statisztikai elemzés előtt a képelemző szoftver által generált spot intenzitási értékeket minden génre az aktin intenzitására normalizáltuk, hogy korrigáljuk a cDNS amplifikációjában mutatkozó különbségeket. Az ábra több kísérletből áll, és a helyükre illesztett képeket tartalmaz.

Az emelkedett CO2 30% -kal, illetve 28% -kal gátolta a lox7 és a lox8 konstitutív szintjét (P ≤ 0,01). Akárcsak az acc-nál, a bogártámadás utáni indukció nagysága alacsonyabb volt azoknál a növényeknél, amelyeket magasabb, mint környezeti CO2 mellett termesztettek (1. ábra). Mindkét időpontban átlagolva a növényevő után a lox7 expressziója a környezeti CO2 alatt 98% -kal, de emelkedett CO2 esetén csak 77% -kal nőtt. Hasonlóképpen, a lox8 expressziója növényevők után 49% -kal nőtt környezeti CO2 alatt, de csak 5% -kal emelkedett megemelkedett CO2 esetén. A növényi eredetű indukció után mindkét gén expressziós szintje az idővel nőtt (P ≤ 0,01). Ahogy az várható volt, a lox6 expressziójában sem a megnövekedett CO2, sem a bogárkárosodás (P = 0,5) nem következett be (1. ábra).

Eredményeink azt mutatják, hogy az emelkedett CO2 nemcsak csökkenti a JA és az etilén jelző hormonokkal kapcsolatos gének expresszióját, hanem csökkenti a bogárkárosodás utáni indukciójukat is. A JA és az etilén közötti pozitív kölcsönhatás szinergetikusan megsebesülve indukálja a PI géneket, például a szójabab CystPI génjeit (14). A JA szintézisének megemelkedett CO2-szint általi változásai azonban befolyásolhatják a konstitutív és indukálható CystPI aktivitási szinteket.

A jázmonsav (JA), a mindenütt jelenlévő sebhormon, amelyről ismert, hogy fokozza a különböző védekezéssel kapcsolatos metabolitok szintézisét, erősen szerepet játszik a CystPI szintézis aktiválásában (12). A JA endogén szintje (növényenként 5–500 ng) a kár mértékével arányosan 90 percen belül növekszik (25, 26). A JA és metil-észterének, a metil-jazmonátnak (MeJA) a levelekhez való hozzáadása utánozza a levelek károsodását a CystPI-k szintézisének fokozásával (12).

A CystPI befolyásolhatja a felnőtt koleopterák viselkedését és teljesítményét. A felnőtt nőstény WCR étrendjében a CystPI E-64 csökkentette a petesejtek számát a fehérje emésztés közvetlen gátlásának és a postesztesztív negatív visszacsatolás kombinációjának eredményeként, ami csökkentette a táplálékfelvételt és a rovarok tömegét (10). A szójabab CystPI aktivitásának a természetben előforduló növényevőkben bekövetkező változásainak következményeinek meghatározásához becsültük a teljes és a cisztein proteináz aktivitást a JB és WCR bélben, amelyek környezeti vagy magas CO2 alatt termesztett növényekkel táplálkoztak. A cisztein-proteináz aktivitás 50% -kal (P = 0,03) nőtt a JB-ben és 37% -kal (P = 0,01) a WCR-ben, az összes proteináz-aktivitás pedig 41% -kal (P = 0,006) nőtt a JB-ben és 41% -kal (P = 0,01) az etető WCR-ben a környezeti CO2-hez képest megemelkedetten kifejlődött leveleken (4. ábra). Eredményeink azt sugallják, hogy az emelkedett CO2 alatt termesztett növényekben termelt CystPI aktivitás változásai fokozták az emésztési proteináz aktivitást a növényevők belében azáltal, hogy javították a felnőtt JB és WCR lombok emészthetőségét és javították teljesítményüket (19 ⇓ –21).

Összes proteináz és cisztein proteináz aktivitás a bogarak bélében. (A és B) JB (A) vagy WCR (B) 3 napig táplált szójabab leveleken, amelyeket környezeti vagy megnövekedett szén-dioxid mellett termesztettek. Az értékek négy független minta átlagát képviselik (FACE-ábránként egy ismétlés). Az azocaseinolitikus és cisztein proteináz aktivitások különböző egységekben vannak ábrázolva. A csillagok jelzik a szignifikáns különbségek szintjét a környezeti és az emelkedett CO2-kezelések között (*, P −1, és az egyik ábrát 550 μmol mol −1 cél CO2-ra fumigálták. A kísérleti parcellákat legalább 100 m választotta el egymástól a keresztszennyeződés elkerülése érdekében A gáz felszabadulásának sebességét és helyzetét automatikusan és folyamatosan változtatták a szél sebességével és irányával, hogy a kívánt dúsulás megmaradjon a parcellán belül. Az egy perces átlagos CO2 a cél ± 20% -a volt,> 95% -ban. az antropogén kibocsátás jelenlegi aránya, a CO2-célértékek a 2050-re várható légköri szinteket képviselik (1).

Minden FACE-ábrán 38 nappal a megjelenés után 38 vegetatív stádiumban lévő sértetlen szójababnövényt szelektáltunk, és a nyolc növény mindegyikének legfelső, teljesen kitágult háromlevelű levelét 150 μg MeJA-val (Sigma – Aldrich) 20 μl lanolinban kezeltük. paszta. További 10 növényt megfertőztek öt felnőtt JB-vel; 10 növényt fertőztek öt felnőtt WCR-rel, és 10 növény szolgált kontrollként. A kezelt és kontroll levelek felét a fertőzés után 1 nappal, a másik felét pedig 3 nappal a fertőzés után gyűjtöttük be elemzés céljából. Annak biztosítására, hogy a kontroll levelek sértetlenek maradjanak, és hogy a rovarok ott maradjanak, ahol elhelyezték, a leveleket 1 × 4 mm-es műanyag hálóba zártuk. Felnőtt JB-t és WCR-t gyűjtöttünk a SoyFACE helyről a gyűrűkön kívüli növényekből 24 órával a fertőzés előtt.

Három napos etetés után környezeti vagy megnövekedett szén-dioxid alatt termesztett levelekkel JB-t és WCR-t eltávolítottunk a teljes bél-proteináz aktivitás és a cisztein-proteináz aktivitás elemzéséhez. Minden faj esetében a beleket eltávolítottuk az egyes levelek öt bogarából, és egyesítettük az öt ismétlődő levélen található bogarakból származó közepes bélekkel, így minden egyes FACE-ábrához egy összetett minta jött létre. A közepes béleket -20 ° C-on tároltuk.

A szintetikus cisztein inhibitor hatását a bél proteináz aktivitására külön kísérletben vizsgálták. A JB-t és a WCR-t mesterséges kazein- és búzacsíra-táplálékkal etették a ref. 40 szintetikus cisztein inhibitor E-64 (50 nmol) nélkül vagy anélkül. 15 JB vagy WCR csoportot etettek a kontroll étrenddel vagy a mesterséges étrenddel E-64-gyel. A beleket eltávolítottuk, egyesítettük, így minden egyes fajhoz és kezeléshez összesített mintát kaptunk, és -20 ° C-on tároltuk. A kísérletet háromszor megismételtük, hogy három összetett mintát állítsunk elő a kontroll és a kezelési étrendhez.

Az egyes szántóföldi parcellákból vagy a mesterséges táplálkozási kísérletből származó bogarak közepes részének összetett mintáit folyékony nitrogénben mozsárral és mozsárral porítottuk. A belek fehérjéit a szövet homogenizálásával extraháltuk 30 mM Tri-K citráttal (pH 6,0) 1: 1 arányban, és jégen inkubáltuk 30 percig. A szuszpenziót 12 000 x g-vel 15 percig 4 ° C-on centrifugáltuk, és a kapott felülúszót JB- vagy WCR-bél proteináz-aktivitás forrásaként alkalmaztuk.

Az azocaseint használtuk szubsztrátként a teljes proteáz aktivitás becsléséhez. Röviden: 10 μl 2x hígított enzimet [bél proteináz 30 mM Tri-K citrátban és 125 μM ditioeritrititolban (pH 6,0)] hozzáadtunk 180 μl 1% -os azocaseinhez [30 mM Tri-K citrátban (pH 6,0)]. és 37 ° C-on inkubáljuk 2,5 órán át. A reakciót 300 μl 10% -os triklór-ecetsav hozzáadásával állítottuk le. 10 000 × g sebességgel 10 percig végzett centrifugálás után azonos térfogatú 1 M NaOH-ot adunk a felülúszóhoz, és az abszorbanciát mind a mintákban, mind a kontrollokban 450 nm-en mérjük. Az egyik proteáz egységet úgy határoztuk meg, mint az enzim mennyiségét, amely 1 OD/perc-rel növeli az abszorbancát.

A cisztein-proteináz aktivitást a p-Glu-Phe-Leu-pNA kromogén szubsztrát (36) alkalmazásával becsültük meg. Ezután 10 μl 18x hígított enzimet adtunk 20 μl 0,38 mM p-Glu-Phe-Leu-pNA-hoz [0,1 M NaPhosphate, 0,3 M KCl, 0,1 mM EDTA és 3 mM dithioeritreit (pH 6,0)] és inkubáljuk 37 ° C-on. A mikrotiterlemez mélyedéseiből 410 nm-en mért abszorpciót 20 másodpercenként, 20 percig JB enzimekkel és> 30 percig WRC enzimekkel mértük. A hidrolízis kezdeti sebességét a kapott abszorbancia/idő grafikon meredekségéből becsültük. A vizsgálatok lineárisak voltak a vizsgálati periódus alatt. Az egyik cisztein aktivitási egységet az az enzimmennyiség határozta meg, amely szükséges 1 mM 4-nitroanilin percenkénti előállításához 37 ° C-on, p-Glu-Phe-Leu-pNS szubsztrátként adott vizsgálati körülmények között.

Az adatokat a Stat View 5.0-s verziójával (SAS Institute) elemeztük. A szemikvantitatív RT-PCR és CystPI aktivitási értékekből származó foltok intenzitási értékeit 2 × 2 (idő × kezelés) ismételt ANOVA mérésekkel elemeztük, majd Fisher védett LSD post hoc összehasonlításait követtük minden kísérletben. A cisztein proteináz aktivitás értékeit ANOVA-val elemeztük, majd Fisher által védett LSD post hoc összehasonlításokat követtünk minden kísérletben.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük F. Xu-nak és D. Bilgin-nek a laboratóriumi technikai segítséget, B. O'Neill-nek és T. Mies-nek a terepi kísérletekhez nyújtott segítséget, Richard Lindroth-nak és Gary Felton-nak a kézirat gondos és konstruktív felülvizsgálatát. Ezt a munkát a Tudományos Hivatal (Biológiai és Környezetvédelmi Kutatások) és az Egyesült Államok Energetikai Minisztériuma támogatta DE-FG02-04ER63849.

Lábjegyzetek

  • ↵ ¶ Kihez kell címezni a levelezést. E-mail: maybeuiuc.edu