A táplálkozási programozás javítja az étrendi növényi fehérje felhasználását a zebrafish-ban Danio rerio

Szerepek konceptualizálás, adatkezelés, formális elemzés, finanszírozás megszerzése, vizsgálat, módszertan, projekt adminisztráció, erőforrások, szoftver, felügyelet, ellenőrzés, vizualizáció, írás - eredeti vázlat, írás - ellenőrzés és szerkesztés

Halászati, akvakultúra- és víztudományi tagsági központ, Biológiai Tudományok Iskola, Southern Illinois University-Carbondale, Carbondale, Illinois, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Konceptualizálás, vizsgálat, módszertan, projekt adminisztráció, írás - áttekintés és szerkesztés

Halászati, akvakultúra- és víztudományi tagsági központ, Biológiai Tudományok Iskola, Southern Illinois University-Carbondale, Carbondale, Illinois, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Formális elemzés

Biotechnológiai és Élettudományi Tanszék, Insubria Egyetem, Varese, Olaszország

Szerepek Adatkúra, formális elemzés, írás - áttekintés és szerkesztés

Biológiai Tudományok Tanszéke, Southern Illinois University-Edwardsville, Edwardsville, Illinois, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Adatkúra, formális elemzés, írás - áttekintés és szerkesztés

Halászati, akvakultúra- és víztudományi tagsági központ, Biológiai Tudományok Iskola, Southern Illinois University-Carbondale, Carbondale, Illinois, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Adatkúra, formális elemzés, írás - áttekintés és szerkesztés

Biológiai és Élettudományi Tanszék, Insubria Egyetem, Varese, Olaszország

Karolina Kwasek,
Michal Wojno,
Federica Iannini,
Vance J. McCracken,
Giovanni S. Molinari,
Genciana Terova

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Kwasek K, Wojno M, Iannini F, McCracken VJ, Molinari GS, Terova G (2020) A táplálkozási programozás javítja az étrendi növényi fehérje felhasználást a zebrafish Danio rerio. PLoS ONE 15 (3): e0225917. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0225917

Szerkesztő: Juan J. Loor, Illinoisi Egyetem, AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

Fogadott: 2019. november 12 .; Elfogadott: 2020. február 20 .; Közzétett: 2020. március 6

Adatok elérhetősége: Minden lényeges adat a kéziratban és az azt alátámasztó információs fájlokban található.

Finanszírozás: A szerzők nem kaptak külön támogatást ehhez a munkához.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A halételekben a halliszt (FM) pótlása növényi fehérjével (PP) folyamatos kihívást jelent az akvakultúra területén. Kiváló minőségű PP forrásokat, például szója- vagy borsófehérje-koncentrátumokat, valamint búza- vagy kukoricaglutént széles körben használt a takarmányipar, mivel emészthetőségük egyes fajokban összehasonlítható az FM-vel. Áruk azonban gyakran meghaladhatja a tengeri nyersanyagok költségeit. Bár némi előrelépés történt a gyengébb minőségű PP, például a szójabab liszt felhasználása terén, még mindig számos problémát le kell küszöbölni, beleértve a bélgyulladás kiváltásáért felelős táplálkozásellenes tényezők jelenlétét az elfogadható növekedési sebesség és a takarmány hatékonyságának fenntartása érdekében értékek magas FM helyettesítési szinteken.

Anyagok és metódusok

Az etetési próbát a Halászati, Akvakultúra- és Víztudományi Központban végezték a Illinois Southern Illinois Egyetem Carbondale-ben (SIUC), IL. Valamennyi kísérletet szigorúan a SIUC laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutatóban foglalt ajánlásoknak megfelelően hajtottuk végre. A SIUC Intézményi Állattartás és -használat jóváhagyta az összes végrehajtott protokollt (18-187. Protokoll). A halkezelés során az érzéstelenítést tricaine-metánszulfonát (MS222) vízfürdőbe merítésével hajtották végre ajánlott koncentrációban, és minden erőfeszítést megtettünk az állatok fájdalmának, stresszének és kellemetlenségének minimalizálására.

Kísérleti halak

A kísérletet zebrafish-lal végezték, mivel a különböző kutatási területek bevett modellfajának tekintik, beleértve a genetikát, a táplálkozást, a biomedicinát és a toxikológiát; emellett népszerűsége mára növekszik az akvakultúra-kutatási területen [16]. Mindenevő teleoszt faj, amely mind a növényi, mind az állati fehérjeforrásokat hatékonyan felhasználhatja a növekedéshez, és kiváló modell a húsevő és növényevő akvakultúra fajok táplálkozási útvonalainak értékelésére [16].

Valamennyi kísérletet recirkulált akvakultúra-rendszerrel (Pentair Aquatic Eco-systems, Cary, NC) végeztük, amely biofiltert, szénszűrőt, UV fényt és a pH/vezetőképesség automatikus beállítás funkciót tartalmazott. A kísérleti tenyésztési rendszer fordított ozmózist használt fő vízforrásként, ahol a pH és a vezetőképesség optimális szinten, 6,9 ± 0,2, illetve 1584 ± 27 μS volt. A táplálási kísérlet során az átlagos vízhőmérséklet 27,1 ± 0,2 ° C volt. A fotoperiódus 14 órás sötétségből és 10 órás fényből állt, a felső lámpák 8: 00–18: 00 óra között világítottak.

A zebrafish tenyészállományt egy helyi állatkereskedésből (Petco, Carbondale, IL) szerezték be. A hímeket és nőstényeket külön tartályokban tartották, és a tenyésztés előtt két hétig napi 2-3 alkalommal etették kereskedelmi takarmánnyal (Otohime, Japán) és Artemia nauplii-val. A halakat tenyésztés céljából a nőstények és a férfiak 2: 1 arányában kombináltuk. 1,5 mm-es hálóval ellátott dróthálót mesterséges növényekkel rendelkező tenyésztartályba helyeztünk az ívás kiváltására. A halakat 24 órán át hagytuk szaporodni. A tenyészállományt ezután másnapi ívás után eltávolították. A dróthálót kivették, és a petesejtek körülbelül 48 órán át kikeltek 27 ° C-on. 3 nappal a kikelés után (dph) a szájnyitás után, és amikor a lárvák aktívan úszni kezdtek, véletlenszerűen elosztották őket kísérleti tartályokba.

A zebrafish-t a Brachionus plicatilis rotifterekkel csak az első két napban etették a felúszási szakasz után (3–4 dph). A rotiferseket kereskedelmi forgalmazótól (Brine Shrimp Direct, Ogden, Utah) vásárolt cisztákból nyertük. 5 dph-tól kezdődően minden hal kereskedelmi eredetű (GSL sós garnélarák, Ogden, Utah) ciszták kikeléséből származó Artemia naupliust kapott rotiforral (5–7 dph), majd csak az Artemia nauplii-t 8–13 dph-mal. A vizsgálat során az összes csoportot ad libitum-mal etették.

Kísérleti diéták

Az összes kísérleti takarmányt megfogalmaztuk és előállítottuk a SIUC-nál. Két kísérleti étrendet teszteltek: a szójabab-liszten alapuló étrendet és a szójafehérje-koncentrátumot, mint fő fehérjeforrást, amely a tengeri állati fehérje 80% -át helyettesíti (PP-étrend; a szójakoncentrátumot az étrendi nyersfehérje beállításához adták, miközben helyet hagyott a készítmény egyéb összetevőinek), beleértve a minimális keményítőszintet, hogy lehetővé tegye a kísérleti étrend bővülését és lebegtethetőségét); valamint a halliszten, mint fő fehérjeforráson alapuló étrend (FM diéta). Mindkét étrendet izonitrogénnek (49% nyersfehérje) és izolipidikusnak (10% lipid) állították össze (1. táblázat).

Az összes száraz fehérje-összetevőt (halliszt, krillliszt és szójaliszt) hozzáadtuk egy centrifugális malomhoz (Retsch Haan, Németország), és 0,5 mikrométerre őröltük. Az őrlési folyamat után az összes összetevőt manuálisan 0,25 mikrométeres szitán szitáltuk, hogy az összes részecske megfelelő és egyenletes méretű legyen. Az összes száraz összetevőt (a szójalecitin és a kolin-klorid kivételével) hozzáadtuk és 15 percig kevertük, majd a halolajat hozzáadtuk az olajban oldott szója-lecitinhez. Az olajat és a száraz összetevőket ismét 15 percig keverjük. Végül víz (

A takarmány össztömegének 10–15% -át) oldott kolin-kloriddal adtuk hozzá. Ezután az etetőanyagokat lassan adagoltuk az extruderbe (Caleva Extruder 20, Sturminster Newton Dorset, Anglia) 20–24 fordulat/perc között, hogy megfelelő extrudátumméretet és szilárdságot kapjunk. Az extrudátumokat ezután szferonizátorral (Caleva, Sturminster Newton Dorset, Anglia) dolgoztuk fel 600 fordulat/perc sebességgel 3 percig, 1800 fordulat/perc sebességgel 30 másodpercig, majd 600 fordulat/perc sebességgel 2–5 percig a folyamat befejezéséhez. Végül az extrudátumokat fagyasztva szárítóval szárítottuk (Labconco, Kansas City, MO). Az összes szárított pelletet megfelelő méretűre szitáltuk vibrációs szitarázógéppel (Retsch Hann, Németország). Az összes kész takarmányt -20 ° C-os tasakokban tároltuk. Amíg a takarmányokat kísérletekben használták, 4 ° C-on tartották őket.

Kísérleti terv

3 dph-nál a zebrafish lárvákat véletlenszerűen 12 (3 L) tartályba osztottuk, tankonként 100 lárvát. A vizsgálat addig tartott, amíg a halak elérték a 66 dph-ot. Négy különböző táplálkozási rendszert vizsgáltak: 1) Az első csoport FM alapú étrendet kapott az élő táplálkozási időszak után 13–36 dph-ból, és 36–66 dph/óra közötti PP-alapú étrenddel kezelték (kontroll, NP-FM); 2) A második csoport táplálékkal kapott PP-t kapott a korai lárva stádiumában élő táplálékkal dúsítva 3–13 dph alatt, amelyet halliszt (FM) alapú étrend követett 13–36 dph és PP-alapú étrend 36–66 dph alatt (NP). -PP); 3) A harmadik csoport étrendi PP-vel kapta az étrendi PP-t 13–23 dph között az élelmezési időszak után, amelyet FM-alapú étrend követett 23–36 dph-ban és PP-alapú étrend 36–66 dph-ban (T-NP); és 4) A negyedik csoport PP-alapú étrendet kapott 13–66 dph-os élő táplálék-periódus után (negatív kontroll; PP) (1. ábra).

NP – táplálkozási programozás, FM – halliszt, PP – növényi fehérje, SBM – szójaliszt.

Az NP-PP csoport NP-jéhez az élő táplálékot szójababbal készítettük. Mind a rotiferseket, mind az Artemia nauplii-t úgy dúsítottuk, hogy korábban szitált, finomra őrölt szójabab-lisztet adtunk hozzá (2. ábra. Rotifers 2 órán át Spirulinával vagy őrölt, kevert és szitált szójabab-liszt után dúsítottuk).

Mért válaszok

Az etetési kísérlet végén az egyes tartályokban lévő halakat megszámoltuk és megmértük. A következő számszerűsített növekedési teljesítményparamétereket értékelték:

Túlélés (%) = 100 × (halak végső száma/halak kezdeti száma)
Végsúly (g) = Végső testsúly – kezdeti testsúly
Súlygyarapodás (a kezdeti tömeg% -a) = 100 × (végső testsúly – kezdeti testtömeg)/kezdeti testtömeg.

Az elején (NP fázis), a közepén (kontroll fázis) és a vizsgálat végén (PP provokáció) a takarmányfelvételt úgy értékeltük, hogy minden tartályban egy étkezés során elfogyasztott takarmány mennyiségét mértük (az etetés leállt amikor a halak a takarmány elutasításának jeleit mutatták).

A vizsgálat végén a halmintákat 3 órával (étkezés utáni szintek) és 24 órával (fiziológiai alapvonal) vettük az egyes csoportok etetése után, és az RNALater®-ben (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) tartósítottuk a emésztési hormonok. Ezenkívül mindegyik tartályból három halat vettünk mintából, emésztőrendszerüket boncoltuk és 10% -os pufferelt formalinban tartósítottuk a bélbolyhok szövettani értékeléséhez.

Emésztési hormon elemzés

Az emésztési hormonok génexpressziós elemzését az Insubria Egyetem, Varese, Olaszország állati biotechnológia és akvakultúra laboratóriumában végezték.

Teljes RNS extrakció és cDNS szintézis.

A teljes RNS-t automatikus rendszerrel (Maxwell® 16 Instrument, Promega) extraháltuk a zebrafish agy- és bélmintákból. A kivont RNS-t NanoDrop ™ 2000c spektrofotométerrel (Thermo Scientific) számszerűsítettük, és reverz transzkripcióval cDNS-be írtuk át a SuperScript III Reverse Transcriptase kitben (Invitrogen, Milánó, Olaszország) leírt protokoll szerint.

Öt célgén alapozójának megtervezése és amplifikálása, molekuláris klónozása és szekvenálása.

A ghrelin, a leptin, a kolecisztokinin (CCK), az orexin és a neuropeptid Y (NPY) gének amplifikálására szolgáló primereket ezen gének cDNS-szekvenciái alapján terveztük meg a GenBank adatbázisban elérhető Danio rerio-ban. A szekvenciák belépési számai: AM055940.1 a ghrelin, BN000830.1 a leptin, XM_001346104.6 a CCK, NM_001077392 az orexin és a BC162071.1 az NPY gén esetében. A primer szekvenciákat a 2. táblázat tartalmazza.

A reverz transzkripcióval kapott cDNS alikvot részét a tervezett primerkészletek felhasználásával PCR-rel amplifikáltuk. A plazmidot végül a NucleoSpin ® plazmidkészlettel (Macherey-Nagel, Milánó, Olaszország) tisztítottuk, majd mindkét irányban szekvenáltuk (T7 és SP6).

Kvantitatív valós idejű RT-PCR

In vitro átírt mRNS-ek előállítása a célgének számára.

A zebrafish ghrelin, a leptin, a CCK, az orexin és az NPY gének cDNS-szekvenciái alapján, a fentiek szerint szekvenálva, minden génhez előre- és reverz primereket terveztünk (3. táblázat). Az előremenő primereket úgy terveztük, hogy az 5 ’végén tartalmazzák a T3 RNS polimeráz promoter azon szekvenciáját, amely szükséges az egyes célgének mRNS-einek in vitro transzkripciójához. A T3 előremenő primereket és a megfelelő reverz primereket egy hagyományos PCR reakcióban alkalmaztuk, plazmidból kiindulva. Ezután a PCR-terméket agarózgélen ellenőriztük, megtisztítottuk, majd szekvenáltuk.

Szekvenálásra volt szükség mind a T7 promóter jelenlétének igazolásához, mind a jelen lévő nukleotidok számának megszámolásához az egyes standardok molekulatömegének (MW - molekulatömege) utólagos kiszámításához, amelyet a következő képlet segítségével határoztak meg: MW = [(n ° bázisok A x 329,2) + (bázisok száma U x 306,2) + (bázisok száma C x 305,2) + (bázisok száma G x 345,2)] + 159.

Az in vitro transzkripciót T3 RNS-polimeráz és más, a RiboProbe In Vitro Transcription System készletben (Promega, Olaszország) szállított reagensek felhasználásával végeztük a gyártó protokollja szerint. Az így kapott mRNS-ek koncentrációját az abszorbancia leolvasásával 260 nm-en mértük a NanoDrop ™ 2000c (Thermo Scientific) segítségével. Az egyes mRNS-ek molekulatömegének és koncentrációjának ismeretében meg lehetett határozni az egyes célgének molekuláinak számát/μL.

Standard görbék és valós idejű RT-PCR előállítása a számszerűsítéshez.

Az egyes gének szintetikus mRNS-ét használták kvantitatív standardként a biológiai minták elemzéséhez. Ehhez száz nanogramm halmintákból kivont összes RNS-t amplifikáltunk egylépéses SYBR® Green kvantitatív valós idejű RT-PCR-en keresztül, ugyanazon a lemezen meghatározott mennyiségű szintetikus mRNS-sel, tízszeres hígítással, az iTaq ™ Universal alkalmazásával. SYBR ® zöld egylépéses készlet (Bio-Rad, Olaszország). A célgén amplifikálásához használt primerek szekvenciáját a 4. táblázat mutatja. A SYBR® Green PCR reakciókat Bio-Rad® CFX96 ™ rendszeren hajtottuk végre.

A valós idejű PCR-futtatások adatait CFX ™ szoftverrel gyűjtöttük össze. A standard mRNS-amplifikáció Ct-értékeit használtuk fel standard görbék létrehozásához, amelyeket aztán a biológiai minták mRNS-kópiáinak kiszámításához használtunk.

Szövettani elemzések

A korábban 10% -os semleges pufferelt formalinban rögzített beleket parafinná dolgoztuk fel Sakura zárt automatizált szövetfeldolgozóval (Hollandia). A zebrafish belek három reprezentatív területét azonos blokkba ágyazott keresztmetszetekre orientáltuk. Öt mikrométeres sorozatmetszetet vágtunk Leica kézi mikrotommal (Buffalo Grove, IL), és 44 ° C-on vízfürdőre helyeztük. A metszeteket pozitív töltésű tárgylemezekre helyeztük. Szárítás után a tárgylemezeket hematoxilinnal és eozinnal festettük, és akril rögzítő közeggel fedjük le. A hal emésztőrendszerének bélközépi részeinek szövettani elemzése a közepes átmérőjű szövetszakaszokra összpontosított. A mintákról készült képeket 100-szoros nagyítással készítettük mikroszkóp (Nikon SMZ1500, Japán) és fényképezőgép (Nikon Digital Sight, Japán) segítségével.

A villus hosszúságának és szélességének megszerzéséhez az egyes tárgylemezekről mikroszkóp (Leica DMI 300B) és kamera (Leica DMC 290) kombinációval készített képeket készítettünk a LAS V4.4 szoftverrel (Leica Camera, Wetzler, Németország). Ezekből a képekből az ImageJ (NIH, Betheseda, MD, USA) alkalmazásával az intakt villákat egyedi hosszúsággal és szélességgel készítettük. A hossz- és szélességadatokat Karimi és Zhandi [17] szerint mértük a bél három különböző szegmensében; proximális, középső és disztális. A villi hosszát a villus hegyétől a luminális felületig mértük, és a villus szélességét a villus tövén át a luminális felületen. Az egyes villák hosszának és szélességének arányát úgy határoztuk meg, hogy a hosszúságot elosztottuk a szélességgel.

statisztikai elemzések

Az eredményeket átlag ± szórásként adjuk meg. Egyirányú ANOVA-t alkalmaztunk, amelyet Tukey-teszt követett, az R. szoftver segítségével. Különbségek p értékekkel 5. táblázat. Az étrendi kezelés hatása a növekedési teljesítményre.

Az értékeket átlagként (± std. Dev) mutatjuk be. A felső indexű betűk a csoportok közötti statisztikai szignifikanciát jelzik. A szignifikanciát egyirányú ANOVA és Tukey teszt segítségével határoztuk meg, p értékkel. 3. ábra. Ghrelin expresszió az agyban és a bélben.

A ghrelin expressziója a ghrelin transzkriptum példányszám/ng teljes RNS mennyisége a zebrafish agyban és a bélben az etetés után 3 órával (B) és 24 órával (A). A hajtásváltozás megmutatja a ghrelin transzkriptum másolatait a 3 és 24 órás minták között. Különböző betűk mutatják a statisztikai különbséget a 4. ábrán. CCK expresszió az agyban és a bélben.

A CCK kifejezése a CCK transzkriptum példányszám/ng teljes RNS-re vonatkoztatva a zebrafish agyban és a bélben az etetés után 3 órával (B) és 24 órával (A). A hajtásváltozás megmutatja a CCK transzkriptum másolatait a 3 és 24 órás minták között. Különböző betűk mutatják a statisztikai különbséget az 5. ábrán. Leptin expresszió az agyban és a bélben.

A leptin expressziója a leptin transzkriptum példányok számaként értendő a teljes RNS ng-jében a zebrafish agyban és a bélben az etetés után 3 órával (B) és 24 órával (A). A hajtásváltozás megmutatja a leptin transzkriptum másolatait a 3 és 24 órás minták között. Különböző betűk mutatják a statisztikai különbséget p 0,05-nél). Hasonló tendencia volt megfigyelhető a bélben is, de valójában nem észleltek jelentős különbségeket (6. ábra).

Az orexin expressziója az orexin transzkriptum példányszám/ng teljes RNS mennyisége a zebrafish agyban és a bélben a táplálás után 3 órával (B) és 24 órával (A). A hajtásváltozás megmutatja az orexin transzkriptum másolatait a 3 és 24 órás minták között. Különböző betűk mutatják a statisztikai különbséget a 7. ábrán. NPY expresszió az agyban.

Az NPY expressziója NPY transzkriptum példányszám/ng RNS formájában jelenik meg a zebrafish agyban 3 órával (B) és 24 órával (A) az etetés után. A hajtásváltozás megmutatja az NPY transzkriptum másolatait a 3 és 24 órás minták között. Különböző betűk mutatják a statisztikai különbséget a 6. táblázatban.