A tiopurin gyógyszer gátolja a nyugat-nílusi vírustermelést a sejtkultúrában, egereknél azonban nem

Társadalmi Klinika Pathobiológiai Tudományok, Állatorvos-tudományi Egyetem, University of Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok, New York Állami Egészségügyi Minisztérium, Wadsworth Center, Albany, New York, Amerikai Egyesült Államok

Tagsági Orvostudományi Tanszék, Wisconsini Egyetem, Madison, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok

Jelenlegi cím: EraGen Biosciences, Madison, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok

Tagsági Orvostudományi Tanszék, Wisconsini Egyetem, Madison, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok

Társulások William S. Middleton Memorial Veteran's Hospital, Madison, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok, Orvostudományi Tanszék, Wisconsini Egyetem, Madison, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok

Pei-Yin Lim,
Julie A. Keating,
Spencer Hoover,
Rob Striker,
Kristen A. Bernard

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Lim P-Y, Keating JA, Hoover S, Striker R, Bernard KA (2011) A tiopurin gyógyszer a sejttenyészetben gátolja a nyugat-nílusi vírustermelést, de az egerekben nem. PLoS ONE 6 (10): e26697. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0026697

Szerkesztő: Volker Thiel, Kantonal Hospital, St. Gallen, Svájc

Fogadott: 2011. július 27 .; Elfogadott: 2011. október 3 .; Közzétett: 2011. október 24

Finanszírozás: Ezt a munkát részben az Országos Allergiai és Fertőző Betegségek Intézetének szövetségi alapjai támogatták, és az 1U01-AI061193 alatt az Országos Egészségügyi Intézet (NIH). A BSL-3 állati magot, amelyet részben az Északkeleti Biodefence Center (U54-AI057158) finanszírozott, használták a Wadsworth Centerben végzett állatkísérletekhez. A JAK-ot az NIH által finanszírozott Celluláris és Molekuláris Parazitológiai Képzési Program (2T32AI007414) támogatta. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A Flaviviridae család három nemzetségből áll - Flavivirus, Pestivirus és Hepacivirus. A Flavivirus nemzetség az emberi morbiditás és mortalitás számos fontos vírusos okát tartalmazza. Például a dengue vírus négy szerotípusa (DENV-1, -2, -3 és -4) évente több mint 50 millió embert fertőz meg [1], és a nyugat-nílusi vírus (WNV) súlyos neurológiai betegségeket okozhat encephalitikus esettel halálozási arány 18% [2]. Továbbá a flavivírusok ellen sem léteznek hatékony vírusellenes szerek.

Eredmények

A 6MMPr több sejtvonalban gátolja a flavivírus termelését

Korábban kimutattuk, hogy a 6MMPr a HCV replikon és a BVDV hatékony inhibitora a Huh7 sejtekben [8]. Kiterjesztettük ezeket az eredményeket a 6MMPr vírusnövekedésre gyakorolt hatásának vizsgálatával a Flavivirus nemzetség (DENV, YFV és WNV) tagjai számára több sejtvonalban. Az emberi máj- és vesesejt-vonalakat DENV-2-vel vagy YFV-vel oltottuk be különböző koncentrációjú 6MMPr jelenlétében, és a vírustermelést az oltás után 48 órával (hpi) mértük. A BVDV-vel kapcsolatos korábbi eredményeinkhez hasonlóan a 6MMPr is körülbelül 10-szeres mértékben gátolta a DENV-2 és az YFV vírustermelését a Huh7 sejtekben (1A. Ábra). Ezenkívül a 6MMPr 10-szeresére csökkentette a vírustermelést a Huh6 sejtekben (1B. Ábra), 100-szorosát a HepG2 sejtekben (1C. Ábra) és 10 000-szeresét a HEK293T sejtekben (1D ábra). A HEK293T sejtekben a vírustermelés nagyobb mértékű gátlása nem az ezekben a sejtekben található gyógyszer citotoxicitásának volt köszönhető (az adatokat nem mutatjuk be), ami összhangban áll korábbi eredményeinkkel, amelyek azt mutatják, hogy a 6MMPr 500 µM-ig nem okoz citotoxicitást a Madin-Darby szarvasmarha-vese sejtekben [ 8].

Az (A) Huh7, (B) Huh6, (C) HepG2 és (D) HEK293T sejteket DENV-2 (16681) vagy YFV-vel oltottuk 6MMPr különböző koncentrációinak jelenlétében. A táptalajt 48 hpi sebességgel gyűjtöttük, és a vírustitereket fluoreszcens fókuszvizsgálatokkal határoztuk meg. Legalább két független kísérletet hajtottunk végre, és bemutatjuk az átlagtól és a három párhuzamosan elvégzett kísérlettől kapott standard eltéréseket.

Összehasonlítottuk a 6MMPr antivirális hatását a DENV-2 és a WNV - két távoli rokonságban lévő flavivírus - ellen. A 6MMPr dózistól függően gátolta a DENV-2 és a WNV vírustermelését 48 hpi sebességgel Vero sejtekben (2A. Ábra). A maximális gátlásnál (20-50 µM 6MMPr) a DENV-2-et 1000-szer, a WNV-t pedig 100-szor gátolták. Valamennyi vizsgált koncentrációnál a 6MMPr körülbelül 10-szer nagyobb mértékben gátolta a DENV-2 vírustermelését, mint a WNV (p 2. ábra. A 6MMPr nagyobb mértékben gátolta a DENV-termelést, mint a WNV-termelés.

A Vero sejteket WNV-vel vagy DENV-2-vel (C-Új-Guinea) oltottuk 6MMPr jelenlétében (A) különböző koncentrációkban vagy (B) 10 uM-ban. A táptalajt (A) 48 hpi vagy (B) hőmérsékleten különféle időpontokban pi-en gyűjtöttük, és a vírustitereket plakk-vizsgálatokkal határoztuk meg. Legalább két egymástól független kísérletet hajtottak végre, és bemutatják az (A) sextuplettekben vagy (B) triplikátokban végrehajtott egy kísérlet átlagainak ± standard eltéréseit. A WNV-re és a DENV-2-re kifejtett antivirális hatásokat összehasonlítottuk minden 6MMPr koncentrációban (A), és a P értékek minden vizsgált koncentrációnál ≤0,005 voltak (1-50 µM).

Az egerek kezelése 6MMPr-rel

Meghatároztuk a 6MMPr hatását a morbiditásra és a mortalitásra, miután szubkután (SC) oltást végeztünk 103 PFU WNV-vel, közvetlenül a vírus beoltása előtt kezdődő kezeléssel. Az egereket naponta egyszer kezeltük vivőanyag-kontrollal vagy 0,5 mg 6MMPr-rel nyolc egymást követő napon keresztül (0–7. Nap a WNV-oltáshoz viszonyítva). Valamennyi WNV-vel oltott egér (hordozóval kezelt és 6MMPr-kezelt) a betegség klinikai tüneteit mutatta, és a hordozóval kezelt és a 6MMPr-vel kezelt egerek között nem volt szignifikáns különbség a betegség kialakulásában vagy mortalitásában (1. táblázat). Ezenkívül a 6MMPr kezelés nem volt szignifikáns hatással a WNV-vel beoltott egerek túlélésére (P = 0,75) (3A. Ábra). A 6MMPr kezelés súlycsökkenést eredményezett mind az oltott, mind a WNV-vel oltott egerekben, napi 8 kezelés után átlagosan 10% -os súlyvesztéssel, a 6MMPr kezelés pedig súlyosbította a nyugat-nílusi betegség miatti fogyást, a 8. pi naptól kezdve (3B. Ábra). . Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a 6MMPr kezelés nem csökkentette a nyugat-nílusi betegség miatti morbiditást vagy mortalitást, és enyhe toxicitást eredményezett, amely súlycsökkenésként nyilvánult meg.

A felnőtt, nőstény C3H egereket vivőanyaggal vagy 0,5 mg 6 MMPr-vel kezeltük naponta egyszer, nyolc egymást követő napon (0. és 7. pi között). Közvetlenül az első kezelés után az egereket SC-vel oltottuk be a bal hátsó lábra csak hígítóval (modell; n = 4 csoportonként) vagy 103 PFU WNV-vel (n = 8 csoportonként), és naponta ellenőriztük a súlycsökkenést és a klinikai tüneteket. . (A) Megjelennek a túlélési adatok. A vírusfertőzést a WNV-vel oltott összes túlélőben megerősítették a WNV-re történő szerokonverzióval. (B) A kezdeti tömeg százalékos átlagának ± szórása látható. Jelentős P-értékeket a beoltott, 6MMPr-kezelt egerek és a WNV-vel oltott, 6MMPr-kezelt egerek között a következőképpen mutatunk be: *, P 1. táblázat: A 6MMPr-vel végzett kezelés nem befolyásolta a WNV-vel oltott egerek morbiditását vagy mortalitását.

A nyugat-nílusi betegség elleni hatékonyság hiányának 6MMPr lehetséges magyarázata a korai WNV-fertőzés alatti alacsony gyógyszerkoncentráció és/vagy a központi idegrendszer (CNS) gyenge biohasznosulása. Így elvégeztünk egy vizsgálatot a 6MMPr előkezelés hatásának vizsgálatára a periféria és a központi idegrendszer vírusterhelésére. Az egereket vivőanyaggal vagy 0,5 mg 6 MMPr-vel előkezeltük naponta egyszer, hét egymást követő napon, a vírus beoltása előtt egy nappal kezdve, és a vírustitereket sorozatos vérzésben határoztuk meg az 1., 2., 3. és 4. pi naptól kezdve, valamint a napon gyűjtött szövetekben. 6 pi. A 6MMPr-kezelt csoport kétszer alacsonyabb geometriai átlagos titer volt a virémia csúcsán (2 nap pi), mint a hordozóval kezelt csoport, de a különbség nem volt szignifikáns (P = 0,085) (4A. Ábra). A 6MMPr-vel végzett kezelés szignifikánsan nagyobb vírusterhelést eredményezett az agyban (P = 0,013), de a gerincvelőben, az oltás helyén lévő bőrben, a lefolyó nyirokcsomókban és a lépben nem (4B. Ábra). A 6MMPr-vel kezelt egereknél ismét súlycsökkenést figyeltünk meg, a WNV-vel oltott egerekben a 3–6 pi napon szignifikánsan nagyobb veszteség volt, mint az ál-oltott egerekben (P 4. ábra. Az egerek 6MMPr kezelésének hatása a WNV fertőzés során szövetfüggő.

A 6MMPr hatása a vírusnövekedésre a sejttenyészetben

Körülbelül 4x104 sejtet/lyuk adtunk a 24-lyukú lemezekre és 24 órán át 37 ° C-on inkubáltuk. A sejteket PBS-sel öblítettük és 104 PFU vagy FFU vírussal oltottuk be (a Vero sejteken végzett titrálás alapján a fertőzés sokasága körülbelül 0,25). Közvetlenül a vírus hozzáadása után 6MMPr-t (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) adtunk a tenyészetekhez a megfelelő táptalajban, FBS nélkül. 1 órán át 37 ° C-on végzett inkubálás után FBS-t adtunk hozzá, hogy 2% végső FBS-koncentrációt kapjunk, és a sejteket 37 ° C-on inkubáltuk. A pi különböző időpontjaiban a felülúszókat összegyűjtöttük és -80 ° C-on tároltuk. A vírustermelést fluoreszcens fókuszvizsgálatokkal vagy Vero sejteken végzett plakkvizsgálatokkal határoztuk meg.

Vírusellenes vizsgálatok egereken

Öt hetes, nőstény C3H egereket vásároltak a Taconic-tól (Germantown, NY), legalább 1 hétig akklimatizálták a 3. biológiai biztonság szintjén működő állaton, és ad libitum táplálékot és vizet kaptak. A 6MMPr-t steril PBS-ben (szöveti tenyésztési fokozat; Invitrogen) oldottuk fel közvetlenül az egerek kezelése előtt az összes vizsgálatban. Az egerekbe IP-t oltottunk be 100 µl steril PBS-sel (vivőanyag-kontroll) vagy 100 µl 6 MMPr-rel naponta egyszer vagy kétszer a megadott dózisban. Az egereket naponta lemértük és klinikailag értékeltük. A kezdeti súly százalékát kiszámítottuk a súlycsökkenés értékelésére, és 10% -os súlyvesztést tekintettünk jelentősnek. A gyógyszer toxicitásának klinikai tüneteit, mint például a fodros szőrzet, görnyedés, gyengeség, nehézlégzés, ascites vagy hasi irritáció, egyik vizsgálatban sem figyelték meg.

A morbiditás és mortalitás vizsgálatához hat-hét hetes C3H egereket (14,7–19,7 g, átlagos súlya 17,4 g) kezeltünk PBS-sel (vivőanyag-kontroll) vagy 6MMPr-vel (0,5 mg/egér) naponta egyszer, nyolc egymást követő napon. napok. Közvetlenül az első kezelés után az egereket SC-vel oltottuk be a bal hátsó lábtérbe, csak hígítóval (modell; n = 4 csoportonként) vagy 103 PFU WNV-vel (n = 8 csoportonként), az előzőekben leírtak szerint [18]. Az egereket naponta ellenőriztük súlycsökkenés és klinikai tünetek szempontjából, és súlyos betegségben szenvedő egereket eutanizáltuk. A klinikai tünetek közé tartozik a fodros szőr, a görnyedés, a gyengeség és az ataxia. Az egeret akkor tekintették klinikai nyugat-nílusi betegségnek, ha a következő kritériumok legalább egyike teljesült: 1) ≥10% súlycsökkenés; 2) klinikai tünetek legalább két napig. A WNV-fertőzést minden WNV-beoltott túlélőnél megerősítettük a WNV elleni antitestek kimutatásával, a korábban leírtak szerint [18].

A szérumok és szövetek vírusterhelésének értékeléséhez hat-hét hetes C3H egereket (16,6–19,8 g, átlagtömeg 18,3 g) kezeltünk PBS-sel vagy 6MMPr-vel (0,5 mg/egér) hét egymást követő napon, és a kezelést egy nappal a vírus beoltása előtt kezdték meg. Az egereket hígítóval (csoportonként n = 3-4) vagy WNV-vel (csoportonként n = 8) oltottuk be a fent leírtak szerint, naponta lemértük őket, és a maxilláris véna szúrásával háromszor sorozatosan elvéreztettük. Az egyes csoportok egereinek felét az 1., 2. és 3. pi napon, a másik felét pedig a 2., 3. és 4. pi napon véreztük meg, így az 1. és 4. napon csoportonként 4 egér és csoportonként 8 egér volt. 2. és 3. nap. A 6. pi napon az egereket elpusztítottuk, a szöveteket összegyűjtöttük és -70 ° C-on tároltuk. A szöveteket a korábban leírtak szerint dolgoztuk fel [18], és a szérumokban és a szövetekben a vírusterhelést Vero sejteken végzett plakk-vizsgálatokkal határoztuk meg. Az ál-oltott egereknél nem találtak fertőző vírust.

statisztikai elemzések

Kétfarkú Mann-Whitney U tesztet (GraphPad, San Diego, Kalifornia) alkalmaztunk a 6MMPr DENV- és WNV-növekedésre gyakorolt hatása sejttenyészetben, a vírusterhelésnek a szérumban és a szövetekben, valamint a súlycsökkenés között. 333 PFU/ml értéket a szérumban és a perifériás szövetekben, valamint 100 PFU/g értéket az agyban és a gerincvelőben használtunk a plakkvizsgálatok kimutatási határa alatti minták geometriai átlagának és szórásának kiszámításához. Log-rank túlélési elemzést (GraphPad) használtunk a kezelés túlélésre gyakorolt hatásának tesztelésére. Valamennyi elemzés során a P értéket <0,05 tekintették szignifikánsnak.

Köszönetnyilvánítás

Szeretnénk köszönetet mondani Dr. April Davisnek és Chrystal Chadwick asszonynak az egérkutatásban nyújtott segítségért és Dr. Pei-Yong Shi-nek a klónból származó WNV biztosításáért. Ezenkívül elismerjük a Wadsworth Center sejtkultúra-magját az ott végzett vizsgálatok során.

Szerző közreműködései

A kísérletek megtervezése és megtervezése: RS KAB. Végezte a kísérleteket: PYL JAK SH. Elemezte az adatokat: PYL JAK KAB. Írta az írást: PYL RS JAK KAB.