A tirozol védőhatásai az L6 izomsejtek oxidatív károsodásával szemben

Koreai Élelmiszer-kutató Intézet

Koreai Élelmiszer-kutató Intézet Élelmiszer-biotechnológiai osztálya, Tudományos és Technológiai Egyetem

Koreai Élelmiszer-kutató Intézet

Koreai Élelmiszer-kutató Intézet Élelmiszer-biotechnológiai osztálya, Tudományos és Technológiai Egyetem

2018, 24. évfolyam, 5. szám, 943–947

Megjelent: 2018 Beérkezett: 2017. november 07. Megjelent a J-STAGE-ban: 2018. október 27. Elfogadva: 2018. június 20. [Előzetes publikáció] Megjelent: - Módosítva: -

(kompatibilis az EndNote-tal, a Reference Manager, a ProCite, a RefWorks szolgáltatással)

(kompatibilis a BibDesk, LaTeX szolgáltatással)

A tirozol (2- (4-hidroxi-fenil) -etanol) az olívaolajban jelen lévő fenil-etanoid, antioxidáns, gyulladáscsökkentő és agykárosító hatású. Ebben a vizsgálatban a tirozol oxidatív károsodás elleni védőhatását mértük az L6 izomsejtekben. A tirozol hatékonyan gátolta a H2O2 által indukált L6 sejtpusztulást részben az ERK, a JNK és a p38 MAP kináz szabályozásával és az ATP termelés fokozásával. Ezenkívül növelte a HO-1 expresszióját a sejtben. Az eredmények alapján a tirozol hatékonyan gátolja az izomsejtek oxidatív károsodását.

"data-html =" true "data-elhelyezés =" bottom "data-toggle =" tooltip "> Ji, 1996). A reaktív oxigénfajok olyan kémiailag reaktív molekulák, amelyek oxigént tartalmaznak, például szuperoxid gyök, hidroxil gyök, hidrogén-peroxid (H2O2) és szingulett oxigén, amelyek normális anyagcsere-folyamatok során keletkeznek és kulcsfontosságú fiziológiai szerepet töltenek be a szervezetben. A túlzottan termelt reaktív oxigénfajok azonban a lipidek - a sejtmembránok fő komponenseinek - peroxidációját indukálják, ami szövetkárosodást vált ki és megzavarja nukleinsavak a sejtben (Djordjevi, VB (2004). Szabad gyökök a sejtbiológiában. Int. Rev. Cytol., 237, 57–89.

"data-html =" true "data-elhelyezés =" bottom "data-toggle =" tooltip "> Djordjevi, 2004). Az emberi testet védik az antioxidáns enzimek előállítása, mint védekező rendszer az ilyen oxidatív károsodások ellen, de a védelmi képesség változó életkorától és egészségi állapotától függően (Irshad, M. és Chaudhuri, PS (2002). Oxidáns-antioxidáns rendszer: szerep és jelentőség az emberi testben. Indiai J. Exp. Biol., 40, 1233-1239.

Az olívaolajban jelen lévő feniletanoidként a tirozol (1. ábra. A tirozol kémiai szerkezete

"data-html =" true "data-elhelyezés =" bottom "data-toggle =" tooltip "> Bu et al., 2007). Az izomsejtek oxidatív károsodása elleni védőhatásról azonban nem végeztek vizsgálatokat. Ebben a tanulmányban megvizsgálták a tirozol reaktív oxigénfajok által okozott károsodások elleni védőhatását az L6 izomsejtekben a sejtek életképességére gyakorolt hatás mérésével a H2O2 kezelés után. A mitogén-aktivált protein kináz (MAPK) jelátviteli útra és az intracelluláris HO-1 termelésre gyakorolt hatásokat is mértük.

A tirozol kémiai szerkezete

Anyagok A tirozolt a Chromadex-től (Irvine, USA) szerezték be. Az Eagle táptalaj (DMEM), a szarvasmarha magzati szérum (FBS) és az Antibiotikum Antibiotikumok (AA) Dulbecco általi módosítását a Gibco-BRL-től (Gaithersburg, USA) szereztük be. A HO-1 antitestet az Enzo Life Science-től (Farmingdale, USA) szereztük be. Hasított kaszpáz-3, p44/42 MAPK (Erk1/2), foszfo-p44/42 MAPK (Erk1/2), p38 MAPK, anti-foszfo-p38 MAPK, anti-JNK, anti-foszfo-JNK és tubulin antitestek Cell Signaling Technology-tól (Danvers, USA) vásároltuk

Sejtkultúra Az L6 izomsejtvonalat a Koreai Cell Line Banktól (Szöul, Korea) szereztük be. A sejteket 37 ° C-on, 5% CO2-ban tenyésztettük 10% FBS-t és 1% AA-t tartalmazó DMEM alkalmazásával.

Az L6 sejteket 1x105 sejt/ml koncentrációban beoltottuk 96 lyukú lemezre, és inkubáltuk. Amint a sejtek összefolynak, a táptalajt DMEM-re cseréljük, amely 2% lószérumot és 1% AA-t tartalmaz a miotubusokba történő differenciálás céljából. A kísérleteket differenciálás után végeztük.

Sejt életképesség A sejtek életképességét MTT [3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolium-bromid] vizsgálattal mértük. A tirozol izomsejtekben kifejtett védőhatásának mérése érdekében a tenyésztett sejteket egyidejűleg a tirozol és 0,5 mM H2O2 koncentrációival kezeltük, és ismét 24 órán át inkubáltuk. A sejteket MTT-vel (0,5 mg/ml PBS-ben) festettük, és az abszorbanciát 540 nm-en mértük. A tirozol protektív hatását százalékban (%) fejeztük ki a gyógyulási arány kiszámításával a sejtek halálozási arányának H2O2 kezeléssel történő kezelésével.

Nyugati immunblottozás A sejteket ezután összegyűjtöttük és lízispuffert (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1% SDS, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,02% nátrium-azid, 10 ng/ml PMSF, 1 ng/ml aprotinin) adtunk hozzá. és a keveréket ultrahanggal kezeltük a sejtekben lévő fehérjék kivonására. A sejtek lízise után a fehérjéket 10% -os SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel elválasztottuk és Hybond ECL nitrocellulóz membránra vittük. A membránokat 5% sovány tejjel blokkoltuk, és különféle primer antitestekkel inkubáltuk: hasított anti-hasított kaszpáz-3 (1: 2 000 hígítás), anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) (1: 2 000 hígítás), anti-foszfo -p44/42 MAPK (Erk1/2) (1: 2000 hígítás), anti-p38 MAPK (1: 1 000 hígítás), anti-foszfo-p38 MAPK (1: 2 000 hígítás), anti-JNK (1: 2 000 hígítás), anti-foszfo-JNK (1: 1 000 hígítás) vagy anti-HO-1 (1: 2 000 hígítás), majd torma-peroxidáz (HRP) konjugált nyúl- vagy egérszekunder antitest. A membránokat továbbfejlesztett kemilumineszcencia detektálással fejlesztettük ki (Bio-Rad, Hercules, USA). A sáv intenzitását a Bio-Rad Image Lab szoftver segítségével elemeztük.

Adenozin-trifoszfát (ATP) termelés Az L6 sejtekben az ATP termelést a HS II ATP biolumineszcens vizsgálati készlet alkalmazásával mértük (Roche, Németország). A tenyésztett sejteket tirozol és 0,5 mM H2O2 minden koncentrációjával egyszerre kezeltük, és ismét 24 órán át inkubáltuk. A sejteket lizizáltuk, és ATP biolumineszcencia vizsgálatot végeztünk. Az abszorbanciát luminométerrel mértük (Tecan, Svájc).

Statisztikai elemzés Az eredményeket átlag ± szórásként fejeztük ki, és a statisztikai szignifikanciát egyirányú ANOVA-val, majd Tukey-val elemeztük. post hoc teszt. P-A 0,05 alatti értékek statisztikailag szignifikánsak voltak.

Védő hatások az izomsejtekben A megerőltető testmozgás túlzott reaktív oxigénfajokat eredményez, ami oxidatív károsodást okoz az izomszövetekben (Morales-Alamo, D. és Calbet, J. A. (2014). Szabad gyökök és sprint edzés emberben. Szabad radikum. Res., 48, 30-42.

"data-html =" true "data-elhelyezés =" bottom "data-toggle =" tooltip "> Morales-Alamo és Calbet, 2014). A tirozol H2O2-indukált oxidatív károsodás elleni védőhatását L6 izomsejtekben mértük, hogy meghatározzuk izomsejt-védő hatás: Miután megerősítette, hogy az L6 sejthalált nem indukálta 100 µM tirozol, az L6 sejteket 24 órán át 1, 30 és 100 µM tirozol mintákkal kezeltük 0,5 mM H2O2-val. A H2O2-val kezelt L6 sejtek a sejtek életképességének 43,2% -át mutatták ki, de a tirozollal végzett kezelés koncentrációfüggő módon csökkentette a sejtpusztulást (2. ábra. A tirozol H2O2 által kiváltott oxidatív károsodás elleni védőhatásai az L6 izomsejtekben. Az L6 sejteket 0,5 mM H2O2 és tirozol 24 órán át. Az adatok három kísérlet átlagát ± SE-t mutatják. *o 2. ábra). A tirozol gátló hatása az L6 sejtpusztulásra 22,3, 33,1 és 58,3% volt 1, 30, illetve 100 µM-nál. Az L6 sejtek képeit a 3. ábra mutatja. Az L6 sejtek mikroszkópos képei. (A) Normál. (B) Differenciálás. (C) H2O2. (D) H2O2 + 100 µM tirozol. Az L6 sejteket 0,5 mM H2O2-val és tirozollal kezeltük 24 órán át. Méretarány = 100 µm.

A tirozol protektív hatása a H2O2 által kiváltott oxidatív károsodások ellen az L6 izomsejtekben. Az L6 sejteket 0,5 mM H2O2-val és tirozollal kezeltük 24 órán át. Az adatok az átlag ± S.E. három kísérletből. *o

L6 sejtek mikroszkópos képei. (A) Normál. (B) Differenciálás. (C) H2O2. (D) H2O2 + 100 µM tirozol. Az L6 sejteket 0,5 mM H2O2-val és tirozollal kezeltük 24 órán át. Méretarány = 100 µm.

A tirozol hatása a H2O2 által indukált kaszpáz-3 aktivációra az izomsejtekben A ciszteintől függő aszpartát proteáz, a Caspase-3 kulcsfontosságú szabályozó a sejthalálban (Nicholson, D. W. (1999). A kaszpáz szerkezete, proteolitikus szubsztrátjai és működése apoptotikus sejthalál során. Cell Death Differ., 6, 1028-1042.

A tirozol hatása a hasított kaszpáz-3 szintre az L6 sejtekben.

(A) A hasított kaszpáz-3 Western immunoblotting elemzése L6 sejtlizátumban. Tubulint alkalmaztunk terhelés kontrollként. (B) A Western immunblot kvantifikálása. Az L6 sejteket 0,5 mM H2O2-val és tirozollal kezeltük 24 órán át. Az adatok az átlag ± S.E. három kísérletből. ***o

A tirozol hatása a H2O2 által indukált ERK1/2, p38 MAPK és JNK 1/2 aktivációra az izomsejtekben Megvizsgáltuk, hogy a MAPK jelátviteli útvonal, beleértve az extra cellás szignál által szabályozott kinázt (ERK), a p38 MAP kinázt (p38 MAPK) és a c-Jun N-terminális kinázt (JNK), részt vett-e a tirozol H2O2-indukálta védőhatásaiban sejthalál, mivel számos tanulmány szerint a ROS aktiválhatja a MAPK jelátviteli utat (McCubrey, JA, Lahair, MM és Franklin, RA (2006). A MAP kináz jelátviteli utak reaktív oxigénfajok által kiváltott aktiválása. Antioxidáns. Redox jel, 8, 1775-1789.

A tirozol hatása a MAPK foszforilációjára H2O2-vel kezelt L6 sejtekben.

(A) Western immunblot analízis jelzett antitestekkel L6 sejtlizátumban. Tubulint alkalmaztunk terhelés kontrollként. (B – D) A Western immunoblotting mennyiségi meghatározása. Az L6 sejteket 0,5 mM H2O2-val és tirozollal kezeltük 24 órán át. Az adatok az átlag ± S.E. négy kísérletből. *o

A tirozol hatása az ATP termelésére.

Miután az L6 sejteket 24 órán át tirozol jelenlétében vagy hiányában H2O2-nak tettük ki, meghatároztuk az ATP-tartalmat. Az adatok az átlag ± S.E. három kísérletből. *o

"data-html =" true "data-elhelyezés =" bottom "data-toggle =" tooltip "> Ogborne et al., 2004). A HO-1 fokozott expressziója a csökkent ROS-szal és az intracelluláris állapotok fenntartásával jár. Ebben a tanulmányban a HO-1 expresszióját Western immunblot segítségével mértük, hogy értékeljük a tirozol HO-1 expressziójára gyakorolt hatását, mint az antioxidációs mechanizmus reprezentatív tényezőjét. Ennek eredményeként az intracelluláris HO-1 fehérje expressziója nőtt a kontrollhoz képest, ha tirozollal kezelték (7. ábra. A tirozol hatása a HO-1 fehérje expressziójára L6 sejtekben. (A) Western immunblot elemzés. (B) Kvantifikáció Az adatok három kísérlet átlagát ± SE-t mutatják. ***o 7. ábra).

A tirozol hatása a HO-1 fehérje expressziójára L6 sejtekben.

(A) Western immunblot elemzés. (B) A Western immunblot kvantifikálása. Az adatok az átlag ± S.E. három kísérletből. ***o

"data-html =" true "data-elhelyezés =" bottom "data-toggle =" tooltip "> Xie et al., 2017). Ebben a tanulmányban a tirozol antioxidáns tulajdonságait vizsgáltuk oxidatív stressz alkalmazásával az L6 izomsejtekben. Számos tanulmány a H2O2-t (az oxidatív stressz által okozott egyik fő ágens) használta sejtkárosodás kiváltására, ennek megfelelően a H2O2-t is használtuk oxidatív stressz induktorként.

Ebben a tanulmányban a tirozol jelentősen gátolta az oxidatív stressz okozta sejthalált a JNK foszforilációjának megszakításával és az HO-1 fehérje expressziójának fokozásával az L6 izomsejtekben. Ezért a tirozol jelentős potenciállal rendelkezik olyan anyagként, amely gátolja a megerőltető testmozgás által kiváltott oxidatív stressz okozta izomkárosodást.

Elismerés Ezt a tanulmányt a Koreai Élelmiszer-kutató Intézet támogatta (E0186701).