A vanillin enyhíti a magas zsírtartalmú étrend okozta elhízást és javítja a bél mikrobiota összetételét

Absztrakt

A vanillin, egy egyszerű fenolos vegyület, kevés növényben létezik, és mikrobák előállíthatják. Ez a tanulmány magas zsírtartalmú étrend (HFD) által kiváltott elhízott egereket használ a vanillin elhízásra gyakorolt hatásának tanulmányozására és pozitív eredmények elérésére. Először a test és a zsírszövet súlya is csökken. Másodszor, bizonyos rendellenességeket, például ALT, LDH, glükóz, koleszterin, LDL-C, TG és HDL-C jelző vér tulajdonságok enyhülnek, és mind az inzulinérzékenység, mind a glükóz tolerancia javul. Harmadszor, a vanillin csökkentette az elhízás következtében fellépő gyulladásos faktorok, köztük az LPS, az IL-6 és a TNF-α szintjét a plazmában és a májszövetben. Végül fokozódik a rövid láncú zsírsavak (SCFA) termelése. Ezenkívül a tanulmány eredményei azt mutatják, hogy a vanillin jelentősen enyhíti az elhízással kapcsolatos bél mikrobiota (GM) rendellenességeket, beleértve az alfa- és béta-diverzitás csökkenését. Ezenkívül a vanillin csökkenti a Firmicutes phylum mennyiségét, növeli a Bacteroidetes és a Verrucomicrobiota phyla gazdagságát, és gátolja a lipopoliszacharidot (LPS) termelő Bilophila nemzetség és a H2S-t termelő baktériumok Desulfovibrio nemzetségének terjeszkedését.

Bevezetés

Kísérleti

Vegyszerek

A vanillint és más kémiai reagenseket a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, Egyesült Államok) vásároltuk, hacsak másképp nem jelöljük meg.

Mód

Állatok és diéták

A 21 napos korban megvásárolt hím C57BL/6J egereket (Vital River Laboratory Animal Technology. Co. Ltd., Kína) egyenként, standard körülmények között (12/12 órás világos-sötét ciklus, 50 ± 15% páratartalom) tartottuk. hőmérsékleten 22 ± 2 ° C) és standard laboratóriumi chow-vel etettük 1 hétig. 7 napos adaptációs periódus után az egereket véletlenszerűen három csoportba sorolták (n = 7–8), beleértve (1) a CHOW csoportot standard rágcsáló-chow-étrenddel (3,85 kcal/g, 10% zsírtartalmú energia), (2) A HFD csoport HFD étrendet táplált (4,73 kcal/g, 60% zsírtartalmú energia) és (3) Va csoport HFD étrendet táplált (4,7 kcal/g, 60% zsírtartalmú energia, 0,1% vanillint, m/m) . A vanillin adagolására Liao kutatásai utalnak, akik koffeinsavat használtak az elhízás kezelésére (Liao et al., 2013).

Az ebben a vizsgálatban használt ételt (Huangfukang, Kína) sugárzással (25,0 kGy) sterilizáltuk. Az ételt és a vizet ad libitum szolgáltatták, és az ételt 3 naponta rögzítették. A testtömeget hetente regisztráltuk. 14 hetes kísérleti időszak után az egerek 12 órán át éheztek, és a plazmát szemgolyó extirpációval gyűjtötték össze. A vastagbél, a végbél és a vakbél tartalmát összegyűjtöttük, összegyűjtöttük és -80 ° C-on tároltuk további elemzés céljából. A máj, az inguinalis fehér zsírszövet (iWAT) és az epididymális fehér zsírszövet (eWAT) tömegét mértük. A szöveteket -80 ° C alatt tartósítottuk a génexpresszióhoz, és a májat alkalmaztuk Oil Red-O festéshez.

Az intézet laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó irányelveit követték. Ezt a tanulmányt a Kínai Mezőgazdasági Egyetem Élelmiszertudományi és Táplálkozástechnikai Főiskolájának állatkísérleti bizottsága hagyta jóvá.

Glükóz és inzulin tolerancia tesztek (GTT és ITT)

GTT-t végeztünk 12 hetes egereken (9 hét múlva a HFD és Va csoport egerei HFD-re váltottak) 16 órás böjt után. A glükózkoncentrációt a farokvénából származó vénás vérzéssel összegyűjtött vérben mértük 1,5 g/ttkg glükóz intraperitoneális injekció előtt és 15, 30, 45, 60, 90 és 120 perccel, Roche Diabetes Care glükométerrel (Roche, Németország). ITT-t végeztek 13 hetes egereken 6 órás böjt után. A glükózkoncentrációt a vénás vérzéssel összegyűjtött vérben mértük az inzulin injekció beadása előtt és 15, 30, 45 és 60 perccel (Novolin, 30 R, 1,0 E/testtömeg-kg).

Mágneses rezonancia képalkotás (MRI)

Az MRI-t 11 hetes kezelés után hajtották végre a laboratóriumi állattudományi intézetben (CAMS & PUMC, Kína). Az egereket 2% izofluránnal altattuk a kísérlet előtt és alatt. Az MRI képeket Argus szoftver segítségével elemeztük.

Kvantitatív valós idejű PCR (qPCR) elemzés

A teljes RNS-t a TRIzol TM Regent (Invitrogen) alkalmazásával extraháltuk a gyártó utasításainak megfelelően. A teljes RNS (2,5 μg) reverz transzkripcióját nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós készlettel (Promega Biotech Co., Ltd) végeztük. A qPCR reakciókat minden példányban két példányban futtattuk, és LightCycler 480 valós idejű PCR rendszerben (Roche) elemeztük. Az adatokat a belső kontroll aktinnal normalizáltuk és ΔΔCT módszerrel elemeztük (Aguilera et al., 2009). A gyulladásos faktor gének expresszióját, beleértve a tumor nekrózis faktort (TNF-α) és az interleukin 6 (IL-6) expresszióját a májban és az adipocita szövetekben, valamint a baktériumok terhelését qPCR segítségével határoztuk meg (az alkalmazott primereket az 1. táblázat mutatja 1 ).

Asztal 1

A vizsgálatban használt kvantitatív PCR primerek.

GeneForwardReverse

IL-6	5′-AGACAAAG CCAGAGTCCTTCAG	5 ′ -GCCACTCC TTCTGTGACTCCAG
TNF-a	5′-CCAACAAG GAGAAGT	5′-GTATGAAGT GGCAAATCG
16-os évek univerzális	5′-ACTGGGTA TAAAGNG	5′-TACCAGGG TCTCTAATCC
16s rRNS (V3-V4)	5′-AATGATAC GGCGACCACCGAG ATCTACACTATGG TAATTGTGTGCCA GCMGCCGCGGTAA	5 ′ -CAAGCAGA AGACGGCATAC GAGATXXXXXX XXXXXXAGTCAGTC AGCCGGACTACHVG GGTWTCTAAT

A baktériumterhelés számszerűsítéséhez a kimért összesített mintákból a teljes baktérium DNS-t izoláltuk QIAamp DNS Stool Mini Kit (Qiagen) alkalmazásával. Ezután a DNS-t qPCR-nek vetettük alá QuantiFast SYBR Green PCR kit (Biorad) alkalmazásával univerzális 16SrRNS primerekkel (1. táblázat (1. táblázat) 1) (Cho és mtsai, 2012). Az eredményeket baktériumszámként fejeztük ki minták g-jában, egy standard görbét használva, amelyet a Bifidobacterium longum felhasználásával készítettünk.

Olajvörös-O festés

Az olajvörös-O festést Ross és mtsai. (1999). Röviden, a májszeleteket foszfáttal pufferolt sóoldattal mossuk, 3,7% formaldehidben rögzítjük 2 percig, vízzel mossuk, Oil Red-O oldattal inkubáljuk 1 órán át szobahőmérsékleten, majd vízzel mossuk.

Plazma paraméterek

A plazma biokémiai paramétereket, beleértve az alanin-transzaminázt (ALT), a glükózt, a koleszterint, a trigliceridet (TG), a nagy sűrűségű lipoprotein koleszterint (HDL-C), az alacsony sűrűségű lipoprotein koleszterint (LDL-C) és a laktát dehidrogenázt (LDH), meghatározta egy 3100 klinikai elemző (Hitachi High-Technologies Corporation, Japán). A plazma gyulladásos faktorokat, beleértve az IL-6-ot, a TNF-α-t és az LPS-t, enzimhez kapcsolt immunszorbens assay (ELISA) készletekkel (ThermoFisher, Egyesült Államok) határoztuk meg, a kezelési utasításoknak megfelelően.

Az SCFA-k koncentrációjának meghatározása

GM elemzés

Az összesített mintákból a teljes genom DNS-t CTAB/SDS módszerrel extraháltuk. A DNS-koncentrációt és tisztaságot 1% -os garózgélen ellenőriztük, és steril vízzel 1 ng/μl-re hígítottuk. A 16S rRNS géneket a specifikus primer segítségével (1. táblázat (1. táblázat) 1) vonalkóddal amplifikáltuk. Valamennyi PCR-reakciót 30 μl oldatban hajtottuk végre, 15 μl Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix-szel (New England Biolabs, Egyesült Államok), 0,2 μM előre és reverz primerekkel és kb. 10 ng templát DNS-sel. A termikus ciklus a kezdeti denaturációból állt 98 ° C-on 1 percig, majd 30 ciklus denaturálással 98 ° C-on 10 másodpercig, 50 ° C-on 30 percig hőkezeléssel, és 30 másodpercig 72 ° C-os megnyúlásként, végül ° C-on 5 percig. A PCR-termékeket egyenlő részekben kevertük össze. Az elegyet a GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific, Egyesült Államok) segítségével tisztítottuk. A szekvenáló könyvtárakat a TruSeq ® DNS PCR-mentes minta előkészítő készlet felhasználásával állítottuk elő, a gyártó ajánlásait követve. Indexkódokat adtak hozzá. A könyvtár minőségét a Qubit @ 2.0 fluorométeren (Thermo Scientific) és az Agilent Bioanalyzer 2100 rendszeren értékeltük. Végül a könyvtárat Illumina HiSeq 2500-on szekvenálták, és 250 bp páros végű olvasásokat generáltak.

Az eredeti DNS-fragmensek párosított olvasatait a FLASH (Magoč és Salzberg, 2011) nagysebességű és pontos elemző eszköz segítségével egyesítették, amelyet arra terveztek, hogy egyesítsék a páros végű olvasmányokat, ha átfedések vannak az 1. és 2. olvasás között. az egyes vonalakhoz az egyedi vonalkódok szerint beolvasást rendeltek. A szekvenciákat a QIIME (Caporaso és mtsai, 2010) (Quantitative Insights Into Microbial Ecology) szoftvercsomag segítségével elemeztük. A házon belüli Perl-szkripteket használtuk az alfa- (mintán belüli) és a béta- (a minták között) változatosság elemzésére. Először az olvasmányokat QIIME minőségi szűrőkkel szűrtük. Ezután a pick_de_novo_otus.py-t használták az operatív taxonómiai egységek (OTU-k) kiválasztásához egy OTU-tábla létrehozásával. ≥97% hasonlóságú szekvenciákat azonos OTU-khoz rendeltünk. A kutatók kiválasztottak egy reprezentatív szekvenciát minden OTU-ra, és az RDP osztályozóval (Wang és mtsai, 2007) feljegyezték az egyes reprezentatív szekvenciák taxonómiai információit.

Statisztika

Az ebben a cikkben közölt összes adat átlag ± SD. Az adatokat egyirányú ANOVA-val értékeltük, majd Duncan szignifikáns különbségtesztje következett. Az összes statisztikát SPSS szoftverrel elemeztük, és a GraphPad Prism 7 programmal végeztük.

Eredmények

A vanillin enyhíti a HFD által okozott metabolikus szindrómákat

A vanillin enyhíti a HFD által kiváltott elhízást

A vanillin enyhíti az egerek elhízással kapcsolatos glükóz-intoleranciáját és IR-jét. (A, C) A vércukor-koncentráció változásai a GTT során (A) és az ITT (C). ∗ P # P ∗∗ P ∗∗∗∗ P ábrák2G 2G - Megmutatom, hogy a CHOW csoportba tartozó egerekhez képest a HFD csoportban az LPS, TNF-α és IL-6 plazmakoncentrációja szignifikánsan megemelkedett. Egyidejűleg ezek a paraméterek lényegesen megemelkedtek a Va-csoport egereiben, összehasonlítva a HFD-csoportéval. Ezekkel az eredményekkel összhangban a TNF-a és az IL-6 expressziója a vastagbélben és a májban a HFD csoportban jelentősen magasabb volt, mint a Va és a CHOW csoportokban (2J, K ábra).

A Vanillin fokozza az SCFA-k termelését

A bél SCFA-kat a poliszacharidok anaerob fermentációjával állítják elő, és döntő fontosságúak a bél egészsége szempontjából. A HFD csoporthoz képest a 4. ábra mutatja, hogy a vanillin lényegesen megnövelte az acetát, a propionát és a butirát koncentrációját, amelyet korábban a HFD csökkentett. Ezzel szemben az étrend nem befolyásolta szignifikánsan az n-valerinsavat.

Az SCFA-k koncentrációja a vakbél tartalmában. AA, acetát sav; PA, propionát sav; BA, butirát-sav és VA, valerinsav. ∗ P ∗∗ P ∗∗∗ P ∗∗∗∗ P Az 5C 5C ábra azt mutatja, hogy a talált fajok száma kezdetben kitágul, de a szekvenálás mélységének növekedésével lassul. Többnyire változatlan marad, amikor a mélység elér egy bizonyos szintet. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a szekvenálás mélysége elegendő a későbbi elemzéshez. A Firmicutes fylum száma a HFD egerekben GM-összetételben szignifikánsan magasabb (P = 0,02 mind a CHOW, mind a Va csoportban), mint a CHOW és Va csoportokban (5A, B ábra). A fakultatív anaerob baktériumok, például a Proteobacteria phylum magasabbak a HFD csoportban, mint a CHOW (P = 0,07) és Va (P = 0,29) csoportokban. A HFD csoport Verrucomicrobia családja azonban alulreprezentált a CHOW-hoz képest (P 5E, I). A GM gazdagságát tükröző egyéb paraméterek, beleértve az ász indexet és a megfigyelt fajokat, hasonló eredményeket mutatnak (5D, F ábra). A gazdagság mellett a GM homogenitása sem különbözik szignifikánsan a csoportok között, amint azt Shannon és Simpson mutatói mutatják (5G, H ábra).

A vanillin részben visszaállítja a GM normál állapotát. (A, B) A menedékkérő GM fő komponens elemzése (PCA) (A) és OUT (B) szintek, ill. (C) A GM főkoordinátanalízise (PCoA) súlyozott UniFrac távolság alapján. (D) Közös OTU-csoportok. (E, F) Biomarker (LEfSe) elemzés a HFD és a CHOW között (E) és Va (F), illetőleg. Az LDA küszöbértéke három.

Vita

A javított GM és a vanillinnel kezelt rezisztens elhízás közötti kapcsolat ellenére az összefüggést vezérlő mechanizmus továbbra sem tisztázott. Például vajon a GM javulása a vanillinnek kitett rezisztens elhízás oka vagy eredménye? Továbbá eredménynek kell lennie, mi a mechanizmus? Ezért további kutatásokra van szükség a kérdések megválaszolásához.

Szerző közreműködései

Az összes felsorolt szerző jelentős, közvetlen és szellemi hozzájárulást adott a műhöz, és jóváhagyta közzététel céljából.

Összeférhetetlenségi nyilatkozat

A szerzők kijelentik, hogy a kutatást bármilyen kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolat hiányában végezték, amely potenciális összeférhetetlenségként értelmezhető.

Lábjegyzetek

Finanszírozás. Ezt a munkát Kína Nemzeti Kulcsfontosságú Kutatási és Fejlesztési Programja (2017YFD0401202) és Kína Nemzeti Kulcsfontosságú K + F Programja (2016YFD0400500) támogatta.