A renális GLUT2 modulációja a kannabinoid-1 receptor által: következmények a diabéteszes nephropathia kezelésére

Vizuális áttekintés

Absztrakt

A cukorbetegség megváltozott glükóz-újrafelszívódása a könnyítő glükóztranszporter 2 (GLUT2) útján vese proximális tubulussejt (RPTC) sérüléshez, gyulladáshoz és interstitialis fibrosishoz vezethet. Ezeket a kórképeket a kannabinoid-1 receptor (CB1R) aktiválása is kiváltja, amely hozzájárul a diabéteszes nephropathia (DN) kialakulásához. A CB1R és a GLUT2 közötti kapcsolatot azonban még meg kell határozni. Itt megmutatjuk, hogy a krónikus perifériás CB1R blokád vagy genetikailag inaktiváló CB1R az RPTC-kben enyhítette a cukorbetegség által kiváltott vese strukturális és funkcionális változásokat, vese gyulladást és tubulointerstitialis fibrózist egerekben. A CB1R gátlása szintén csökkentette a GLUT2 expressziót, befolyásolta a GLUT2 dinamikus transzlokációját az RPTC-k kefe határmembránjára, és csökkentette a glükóz újrafelszívódását. Így a perifériás CB1R célzása vagy a GLUT2 dinamikájának gátlása RPTC-kben potenciálisan képes kezelni és enyhíteni a DN-t. Ezek az eredmények alátámasztják a perifériásan korlátozott CB1R antagonisták klinikai tesztelésének indokoltságát, vagy új vese-specifikus GLUT2 inhibitorok kifejlesztését DN.

A cukorbetegséget, egy krónikus betegséget, amely mostanra eléri a járvány mértékét, 1 számos betegség katalizátorként írták le, amelyek közül az egyik a diabéteszes nephropathia (DN). A DN, amelyet csökkent GFR, glomeruláris és tubuláris hipertrófia, albuminuria, vese gyulladás és tubulointerstitialis fibrosis jellemez, 2 a leggyakoribb oka az 1. és 2. típusú cukorbetegségben szenvedő betegek fokozott morbiditásának és halálozásának. 3 Ezért kritikus szükség van a megfelelő terápiás célok meghatározására és az új kezelési stratégiák tesztelésére a DN kezelésére és enyhítésére.

A legújabb bizonyítékok azt mutatják, hogy a glükóztranszport változásai a könnyítő transzporter glükóztranszporter 2 (GLUT2) révén a hiperglikémia során negatívan befolyásolhatják a vesefunkciót és a kapcsolódó tubulointerstitialis változásokat, amelyek a DN-ben láthatók. A 4–8 GLUT2, amely a vese proximális tubulussejtjeiben (RPTC) lokalizálódik, általában befolyásolja a visszaszívódott vagy újonnan szintetizált glükóz bazolaterális kiáramlását a tubuláris sejtből a keringésbe. 9,10 Kifejezése RPTC-kben drámai módon megnő a cukorbetegségben szenvedő emberekben 11, valamint a cukorbetegség és az elhízás egérmodelljeiben. 6,7,12 Ezenkívül a lokalizáció elmozdulásáról is beszámoltak az RPTC bazolaterális membránjától (BLM) az apikális/kefés határmembránig (BBM), ami hozzájárul a fokozott glükóz-visszaszívódáshoz. Kimutatták, hogy 6,13 plazma vagy luminalis glükózkoncentráció szabályozza a GLUT2 expresszióját és/vagy transzlokációját, 10 ami a hiperglikémia káros hatásait okozza a proximális tubulusra. Bár a GLUT2 transzkripciós szabályozásáról szóló jelentések feltártak néhány transzkripciós tényezőt, amelyek közvetlenül szabályozhatják a GLUT2 expresszióját diabéteszes körülmények között, 14–16 még nem határozták meg a folyamatok alapjául szolgáló upstream molekuláris mechanizmust.

A kannabinoid-1 receptoron (CB1R) keresztül ható endokannabinoidok (eCB-k) közvetítik a DN káros következményeit. 17–22 A CB1R renális expressziója fokozódik cukorbeteg egerekben, 18,22 és genetikai/farmakológiai aktivációja fokozza a proteinuriát és a podocita diszfunkciót, 23 míg krónikus blokádja javítja a veseműködést. 18,20,24–26 Mivel a káros neuropszichiátriai hatásokkal kapcsolatos aggodalmak 27 korlátozzák a globálisan ható CB1R antagonisták terápiás potenciálját, nemrégiben 28 perifériásan korlátozott blokkolót fejlesztettek ki és preklinikailag teszteltek. 29–33

A DN során megnövekedett vese eCB „tónus” arra késztetett bennünket, hogy feltételezzük, hogy az RPTC-kben a GLUT2 upreguláció oka lehet az eCB/CB1R rendszer aktiválása. Itt egy új sejtmechanizmust írunk le, amellyel a CB1R szabályozza a GLUT2 expresszióját és transzlokációját az RPTC-kben. Eredményeink azt mutatják, hogy a cukorbetegség által kiváltott upreguláció a vese GLUT2 expressziójában és dinamikájában a CB1R perifériás blokáddal vagy genetikai ablációjával csökkenthető az RPTC-kben a glükóz visszaszívódásának csökkentése és a DN kialakulásának megakadályozása érdekében.

Eredmények

A perifériás CB1R blokád megfordítja a cukorbetegség által kiváltott veseműködési rendellenességet

A globálisan ható és perifériásan korlátozott CB1R antagonisták összehasonlítására a DN enyhítésében a diabéteszes egereket 16 hétig naponta SLV319-rel vagy JD5037-gyel kezeltük (1. kiegészítő ábra). A csökkent testtömeg-gyarapodást, amelyet a csökkent zsír (de nem sovány) testtömegnek tulajdonítottak, minden cukorbeteg csoportban észleltünk (1. ábra, A – C). A várakozásoknak megfelelően a szérum glükózszintje drámaian felemelkedett, míg a szérum inzulinszint és a Langerhans-szigetek száma jelentősen csökkent (1. ábra, D – F). Összehasonlítva a vivőanyaggal kezelt kontroll egerekkel, amelyek konzerváltan kerek-hosszúkás szigetekkel rendelkeznek, a cukorbeteg állatok kicsi, torzított szigetekkel rendelkeznek, sejtstruktúrájuk és elrendezésük jelentős veszteséggel jár (1G ábra).

Az ACEA káros hatásának értékelése hRPTC-kben feltárta, hogy a sejtek önmagában magas glükózszint jelenlétében történő inkubálása jelentős emelkedést okozott a TNFα és IL-18 szintekben (3. ábra, O – Q), amelyet enyhítettek a sejtek JD5037 előkezelésével. (3. ábra, P és Q). A CB1R aktiválása ugyanazon diabéteszes körülmények között hatalmas növekedést váltott ki a génexpressziójában, valamint az IL-18 és a TNFα-ban, mely hatásokat a JD5037 teljesen gyengítette. Továbbá mind a CB1R aktiválása, mind a hiperglikémiás állapotok jelentősen csökkentették a hRPTC életképességét, míg a hRPTC-k JD5037-sel történő előkezelése visszaállította azt (3R. Ábra). Összességében ezek az eredmények azt sugallják, hogy a CB1R blokkolása megakadályozhatja a glükóz RPTC-k útján történő kereskedelmét a GLUT2 expressziójának befolyásolásával, következésképpen a cukorbetegség során bekövetkezett tubuláris sejtkárosodás enyhítésével.

A perifériás CB1R blokád csökkenti a DN-t az Akita cukorbeteg egerekben

Mivel a streptozotocin (STZ) toxicitás a hasnyálmirigy β-sejtjeinek számos más szervre, például a vesére, 36 kiterjedését eredményezheti, a JD5037 hatékonyságát genetikai egérmodellben teszteltük az 1-es típusú DN-re (Akita Ins2 +/C96Y). 37–39 Az STZ által kiváltott cukorbetegséghez hasonlóan a JD5037 krónikus kezelése sem mentette meg a cukorbetegséget az Akita egerekben (4. ábra, A – D). Míg a vese-test tömeg arány továbbra is magas volt, a vizelet glükózszintje szignifikánsan megemelkedett, és az albumin-kreatinin arány, valamint a BUN szint (4. ábra, E – H) csökkent a JD5037-vel kezelt Akita cukorbeteg egerekben. Ezenkívül a JD5037 csökkentette a kreatinin-clearance-t és a vizelet-terhelés/vízfogyasztás arányát (4. ábra, I és J), valamint vesekárosodást, gyulladást és tubulointerstitialis fibrózist (4. ábra, K – M). Ezek a perifériás CB1R blokád által kiváltott vese-javulások a GLUT2 (4. ábra, N – R) és a PKC-β1 (4. ábra, S – U) expresszió normalizálásával társultak.

Továbbá, amikor Matrigelben tenyésztettük az MDCK II sejteket, amelyek lehetővé teszik különálló bazolaterális (külső) és apikális (belső) felületekkel rendelkező többsejtű vese ciszták képződését (5. kiegészítő ábra), azt tapasztaltuk, hogy a PBS-ben tenyésztett ciszták a GLUT2 bazolaterális lokalizációját mutatják be, amelyet teljesen átirányítottak a sejtek apikális felszínére, amikor a sejteket magas glükózszintnek tették ki (5. ábra, A és B ábra) vagy ACEA-val aktiválták (5. ábra, C és D ábra). A JD5037 mindkét hatást teljesen gátolta.

Vita

Meggyőző bizonyítékok arra utalnak, hogy a hiperglikémia a vese romlásának és a DN kialakulásának fő tényezője. A CB1R kulcsszerepet játszik a DN patogenezisében is, hangsúlyozva blokádjának potenciális terápiás hatását a cukorbetegség veseműködésének javítására. Ez a tanulmány először azt mutatja, hogy az RPTC-kben a CB1R szabályozza a GLUT2 expresszióját és annak dinamikáját, ezért befolyásolhatja a glükóz újrafelszívódását a hiperglikémia során. Ez hozzájárul a sejt sérüléséhez, és ennek következtében meghatározza a tubulointerstitialis fibrózis és a DN szakaszát. Így a CB1R növekvő fontossága a proximális tubulus GLUT2 fiziológiájának szabályozásában azt sugallja, hogy a CB1R és/vagy GLUT2 manipulálását RPTC-kben a DN kezelésének terápiás stratégiájának kell tekinteni.

Több DN-modell alkalmazásával mások megmutatták, hogy a CB1R-ek farmakológiai blokádja vagy genetikai kiiktatása javítja a cukorbetegség által kiváltott vesekárosodást, gyulladást, fibrózist és sejthalált. 17,18,23,25,26,42 Mivel azonban a globálisan ható CB1R inhibitorok alkalmazása emberekben korlátozott, 27 úgy döntöttünk, hogy teszteljük a közelmúltban kifejlesztett és jól jellemzett perifériásan korlátozott CB1R antagonista 29 hatását 1-es típusú DN egérben modellek. Bár ezekben a modellekben sem a JD5037, sem az SLV319 nem mentette meg a cukorbetegséget, a mindkét antagonistával kezelt diabéteszes egerekben jelentős javulást tapasztaltak a veseműködésben, valamint csökkentették a gyulladást és a vesefibrózist. Ezeket a megállapításokat számos közelmúltban közölték. 17,18,25,42

A hiperglikémia alatti fokozott tubuláris GLUT2 expresszió kíséretében a lokalizáció BLM-ről BBM-re történő elmozdulásáról is beszámoltak. 6,13 Itt a GLUT2 két- és háromdimenziós dinamikus nyomon követését MDKC II sejtekben, valamint cukorbeteg egerekben tapasztaltuk, hogy a hiperglikémia indukálja a GLUT2 apikális inszerciót a BBM-be. Ezt a hatást utánozták a CB1R in vitro stimulálásával. Mindkét hatást tompította a JD5037 blokkolása. Ezek az eredmények együttesen mutatják a CB1R szerepét a GLUT2 dinamikájának szabályozásában a cukorbetegség alatt.

Az SGLT2 inhibitorok közelmúltbeli klinikai jóváhagyása a hiperglikémia kezelésére cukorbetegségben szenvedő betegeknél hangsúlyozza a vese GLUT-gátlásának terápiás lehetőségét. Az SGLT2 szintjének tesztelése ebben a vizsgálatban mind a négy állatmodellben nem mutatott változást az expressziójában sem a CB1R genetikai deléciója, sem farmakológiai manipulációja után. Fontos, hogy az SGLT2 szint mindkét diabéteszes modellben csökkent, amint Albertoni Borghese és mtsai. 47. ábra (11. kiegészítő ábra). Felmerült, hogy az SGLT2 inhibitorok növelhetik az AKI kockázatát a magas felszívatlan nátrium és glükóz (48) miatt, ezért nem ajánlott alacsony BP-vel rendelkező betegek, idős betegek vagy csökkent vesefunkciójú betegek számára. Ezért a vese GLUT2 blokkolása ígéretes stratégiának tekinthető a vese védelmére a DN kialakulásától.

Összefoglalva, ez a tanulmány azt mutatja, hogy a CB1R blokád megfordítja a DN-t azáltal, hogy az RPTC-kben szabályozza a GLUT2-t. A legvalószínűbb mögöttes sejtmechanizmus, amely összeköti a CB1R blokkolást a GLUT2-vel, a glükóz által kiváltott Ca 2+ -függő PKC-β1-aktiváció megszakadásával függ össze, amely viszont modulálja a GLUT2 transzlokációját és/vagy expresszióját az RPTC-kben (8. ábra). Mivel a hiperglikémiának és a CB1R-nek hasonló molekuláris jelátviteli kaszkádja lehet a Gq/11 stimulálásával, a CB1R blokkolása a GLUT2 alacsonyabb expresszióját eredményezi a BBM-ben, mivel kevesebb glükózmolekula jut be az RPTC-be, ami megakadályozza a diabéteszes diszfunkciót.

Javasolt mechanizmus a CB1R részvételére a hiperglikémia okozta GLUT2 transzláció szabályozásában a BBM-be RPTC-kben. (Felső panel) A magas glükózszint aktiválja a CB1R-Gq/11 fehérjét, amelynek eredményeként az endoplazmatikus retikulumból (ER) intracelluláris kalciumraktárak szabadulnak fel. A megnövekedett kalcium aktiválja a PKC-β1-et, amely közvetíti a GLUT2 apikális transzlokációját, és a tubulus lumenéből a glükóz fokozottabb bejutását az RPTC-kbe, ami tubuláris sérüléshez és DN-hez vezet. (Alsó panel) A CB1R farmakológiai blokkolása vagy genetikai deléciója az RPTC-kben a Gq/11-hez kapcsolt fehérje csökkent aktiválódását eredményezi, és ennek következtében kevesebb glükózmolekula lép be az RPTC-be. Ez viszont megvédi a sejteket a hiperglikémia káros hatásaitól.

Tömör módszerek

Állatok és kísérleti protokoll

A kísérleti protokollt a Jeruzsálemi Héber Egyetem Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá. A hím 8 hetes C57Bl/6 egereknek öt egymást követő intraperitoneális STZ injekciót adtak be (50 mg/kg naponta; alacsony dózisú STZ protokoll). Kontrollcsoportnak 0,1 mol/l citrátpuffert (pH 4,5) adtunk. Az STZ által kiváltott diabéteszes egereket naponta SLV319-gyel (3 mg/kg orálisan), JD5037-gyel (3 mg/kg orálisan) vagy Veh-rel (1% Tween80 és 4% DMSO sóoldatban) kezeltük 16 héten keresztül, és kontrolljaikat Veh . Hasonló protokollt hajtottak végre 8 hetes RPTC-CB1R -/- hím 40 egerekben és alomtársuk kontrolljaiban. A nagy dózisú STZ protokollhoz a 8 hetes hím C57Bl/6 vagy RPTC-CB1R -/- egerek és kontrolljaik egyetlen STZ injekciót kaptak (intraperitoneálisan 185 mg/kg). Ezenkívül a 7 hetes hím Akita Ins2 +/C96Y diabéteszes egereket naponta JD5037-gyel (3 mg/kg orálisan) vagy Veh-mel kezeltük 7 hétig, és nem cukorbeteg C57Bl/6 alomtársaikat Veh-vel kezeltük. Az eutanázia után a törzsvért összegyűjtötték, a vesét és a hasnyálmirigyet eltávolították és lemérték; a mintákat vagy pillanatszerűen lefagyasztották, vagy 4% -os pufferolt formalinban rögzítették. A teljes módszerek a Kiegészítő anyagban találhatók.

Anyagok

Az STZ-t, az ACEA-t, a 2-NBDG-t és a citokalazin B-t a Cayman Chemical cégtől vásároltuk. A JD5037-et és az SLV319-et szintetizáltuk a korábban leírtak szerint. 49

Biokémia

A szérum inzulint és a vizelet albumint ELISA módszerrel mértük. A BUN-t, a vizelet-glükózt és a kreatinint a Cobas C-111 kémiai analizátorral határoztuk meg. A vizelet lipokalin 2, IP-10, cisztatin C és klusterin meghatározását az 1. és 2. panel toxicitási multiplex vizsgálata végezte, Luminex MAGPIX alkalmazásával. A KIM-1, TIMP-1 és LCN2 vizeletszintjét ELISA-val mértük. Az eredményeket a teljes vizelet kreatininszintre normalizáltuk.

Hisztopatológia

Paraffinba ágyazott 2 μm metszetű vese- és paraffinba ágyazott 5 μm hasnyálmirigy-szakaszokat minden csoportból periodikus sav-Schiff festett, majd hematoxylin festéssel. Veseképeket tíz véletlenszerű 40 × mezőből készítettünk minden állatból. Minden vese esetében 20 véletlenszerűen kiválasztott glomerulust fogtak el, és a vese keresztmetszetét a ZEN BLUE szoftver segítségével számszerűsítették.

Immunhisztokémia

A fix vese és a hasnyálmirigy parafinba ágyazódott. A négy mikrométeres szakaszokon immunfestést hajtottunk végre, ahogy azt korábban leírtuk. 40 antitestet az 1. kiegészítő táblázat sorol fel. A pozitív területeket ImageJ alkalmazásával számszerűsítettük.

Western Blotting

A vese homogenizátumok Western-blot-analíziseit a korábban leírtak szerint végeztük. 50 antitestet az 1. kiegészítő táblázat sorol fel.

Valós idejű PCR

A teljes vese- vagy sejtlizátum mRNS-t kivontuk, és a génexpressziós vizsgálatokat a korábban leírtak szerint értékeltük. 51 alapozó a 2. és 3. kiegészítő táblázatban található.

Sejtkultúra

A hRPTC-ket és a DhRPTC-ket (Lonza) a korábban leírt módon REGM BulletKit táptalajban tenyésztettük. A C-terminális GLUT2-mCherry fúziós fehérjét expresszáló 29 MDCK II sejtet (ATCC) tenyésztettünk a korábban leírtak szerint. 13.

Kalcium képalkotás

A hRPTC-ket és a DhRPTC-ket 0,2 mg/ml polidilizinnel bevont képalkotó kamrákban észleltük 3-4 órával, mielőtt 10 μM Fura-2AM-mal töltöttük volna 1 órán át. A sejteket ezután d-glükózban vagy ACEA-ban inkubáltuk 100 nM JD5037 jelenlétében/távollétében 30 percig. A sejteket xenon ívlámpával világították meg.

Kis zavaró RNS kezelés

A GLUT2 (sc-35495; Santa Cruz) elleni kis interferáló RNS-transzfekciót hRPTC-kben siRNS reagens rendszer (sc-45064; Santa Cruz) alkalmazásával hajtottuk végre a gyártó utasításainak megfelelően.

2-NBDG vizsgálat és áramlási citometria

Az összes áramlási citometriás kísérletet kolin-klorid Na + -mentes pufferben végeztük. A hRPTC-ket 12 lyukú lemezekre oltottuk 100 nM JD5037-el/anélkül 30 percig vagy 10 μM citokalazin B-t 10 percig. Ezután a sejteket 2 órán át inkubáltuk 100 μM 2-NBDG jelenlétében/hiányában kolin-klorid Na + -mentes pufferben oldva magas glükózszinttel (30 mM) vagy 10 μM ACEA-val vagy anélkül.

XTT teszt

Az XTT sejtek életképességi tesztjét a szállító utasításainak betartásával hat független kísérletben végezték el.

Celluláris GLUT2 transzlokáció

A C-terminális GLUT2-mCherry fúziós fehérjét expresszáló MDCK II sejtek egyrétegű és differenciált üreges polarizált cisztatenyészeteit a korábban leírtak szerint hoztuk létre. 13.

STZ mérések folyadékkromatográfia-tandem tömegspektrometriával

Az STZ-t TSQ Quantum Access Max tömegspektrométerrel detektáltuk pozitív ionizációs üzemmódban, elektrospray ionizációval, és a detektálást és a mennyiségi meghatározást többszörös reakciómonitorozással hajtottuk végre.

Statisztikai elemzések

Az értékeket átlag ± SEM-ben fejezzük ki. A párok nélküli kétfarkú t tesztet használtuk a csoportok közötti különbségek meghatározására. A több csoportban elért eredményeket és az időfüggő változókat ANOVA-val hasonlítottuk össze, majd Bonferroni-teszt (GraphPad Prism v6 for Windows) követte. A jelentőséget P Randall MD-n határozták meg,

Kendall DA,

O’Sullivan S

: A kannabinoidok kardiovaszkuláris hatásainak összetettsége. Br J Pharmacol 142: 20-24, 2004, pmid: 15131000