A vinpocetin gyengíti a lipidfelhalmozódást és az ateroszklerózis képződést

Yujun Cai

a Aab Kardiovaszkuláris Kutatóintézet, Orvostudományi Tanszék, Rochesteri Egyetem, 601 Elmwood Ave, Rochester, NY 14642, USA

Jian-Dong Li

b Gyulladás-, immunitás- és fertőzésközpont és Biológiai Tanszék, Georgia State University, Atlanta, Georgia 30303, USA

Chen Yan

a Aab Kardiovaszkuláris Kutatóintézet, Orvostudományi Tanszék, Rochesteri Egyetem, 601 Elmwood Ave, Rochester, NY 14642, USA

Absztrakt

Bevezetés

Az érelmeszesedés a miokardiális infarktus és a stroke fő kiváltója, a fejlett országokban a morbiditás és a halálozás vezető okai. A koleszterin lerakódása az artéria falában kritikus szerepet játszik az érelmeszesedésben [1; 2; 3]. A megemelkedett plazma lipidszint, különösen az alacsony sűrűségű lipoprotein (LDL) koleszterin, az ateroszklerózis fontos kockázati tényezője [1; 4], és a sztatinok klinikai haszna az érelmeszesedés kezelésében elsősorban a koleszterinszint-csökkentő hatástól függ [5]. Az LDL áthaladhat az érfal endotheliumán, és az endotheliális térben tartózkodhat, ahol az LDL oxidatív módon módosulhat, hogy oxidált LDL (ox-LDL) legyen. az ox-LDL az endothel diszfunkció és az érgyulladás elsődleges kiváltója, kulcsszerepet játszik az érelmeszesedés kialakulásában és előrehaladásában [2; 6]. A megkötő receptor, például a lektinszerű oxidált LDL-1 (LOX-1) fő ox-LDL-receptor [6; 7]. A LOX-1 alacsony szinten expresszálódik az egészséges vaszkuláris sejtekben, és számos pro-atherogén inger és agonista ox-LDL szabályozza [6; 7]. A szubendoteliális térben található makrofágok ox-LDL-t fogyasztanak, habsejtekké válnak, és zsírsáv-képződést okoznak, ami az atherogenezis korai szakaszában jelentős kóros jellemzőket képvisel [2; 6].

Anyagok és metódusok

Állatok

Valamennyi állatot az Országos Egészségügyi Intézet és az American Heart Association irányelveinek megfelelően használtuk laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására. Az eljárásokat a Rochesteri Egyetem Állati Erőforrások Egyetemi Bizottsága által jóváhagyott kísérleti protokollok szerint hajtották végre. A hím C57BL/6J ApoE knockout egereket (Jackson Laboratories) 8 hetes korban normál chow étrenddel vagy 1,25% koleszterint tartalmazó magas zsírtartalmú étrenddel (Research Diets D12108C) 16 hétig tápláltuk. A vinpocetint (5 mg/testtömeg-kg) vagy ugyanolyan mennyiségű vivőanyagot adtuk be i.p. útvonal minden második nap 16 héten keresztül, az előzőekben leírtak szerint [14].

Ateroszklerotikus elváltozás értékelése

Vérnyomás, a szérum koleszterinszint mérése

A vérnyomást nem invazív farok-mandzsetta eljárással és Visitech BP-2000 vérnyomáselemző rendszerrel mértük a korábban leírtak szerint [16]. A szérum LDL és HDL koleszterinszintjét HDL és LDL/VLDL koleszterin assay készlettel (Abcam) mértük a gyártó utasításainak megfelelően.

Sejtkultúra

Az egér RAW264.7 makrofág sejtvonalát (ATCC, Rockville, MD) 10% magzati szarvasmarha-szérumot (DBS) tartalmazó nedvesített inkubátorban (37 ° C, 5% CO2) növesztettük Dulbecco's Modified Eagle's Medium-ban (DMEM).

RNS izolálás és RT-PCR

Az összes sejtes RNS-t izoláltuk a RAW264.7 sejtekből egy RNeasy Mini Kit (Qiagen) segítségével a gyártó utasításainak megfelelően. A cDNS-t reverz transzkripcióval szintetizálták Taqman reverz transzkripciós készlet (Applied Biosystems) alkalmazásával, a gyártó utasításainak betartásával. A valós idejű PCR-t iQ ™ SYBR Green supermix (BIO-RAD) alkalmazásával hajtottuk végre LOX-1 primerekkel: 5′-CAAGATGAAGCCTGCGAATGA (előre) és 5′-ACCTGGCGTAATTGTGTCCAC (fordított). Az mRNS-ek relatív mennyiségét glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenázzal (GAPDH) normalizáltuk.

Immunfluoreszcens festés

Az immunfestést a korábban leírtak szerint végeztük [14]. Röviden, a fagyasztott szakaszokat 4% paraformaldehiddel rögzítettük és 0,2% Triton X-100-ban permeabilizáltuk. A metszeteket Dako szérummentes blokkoló oldattal (M0841, Dako) blokkoltuk és primer antitesttel inkubáltuk. Az elsődleges antitestek a MAC-2 (CL8942AP, Cedarlane) és a LOX-1 (sc-11653, Santa Cruz) voltak. Ezután a metszeteket fluoreszcenciával konjugált szekunder antitestekkel inkubáltuk. Az atomot DAPI-val festették. A képeket Olympus (BX-51) fluoreszcens mikroszkóppal készítettük. Az olajvörös O pozitív területet, a LOX-1 expressziót és a Mac-2 pozitív területet Image-Pro 6.2 szoftverrel (Media Cybernetics) számszerűsítettük.

Ox-LDL felhalmozódás

A fluoreszcenciával jelölt ox-LDL (Dil-ox-LDL) felvétel és felhalmozódás mérése céljából a RAW264.7 sejteket különböző dózisú vinpocetinnel előkezeltük 24 órán át 0,1% FBS-t tartalmazó DMEM-ben, majd 10 μg/ml Dil-ox-tal töltöttük fel. -LDL (Biomedical Technologies, Inc.) további 4 órán át. A sejteket ezután PBS-sel mostuk és formalinnal rögzítettük. A nukleáris anyagot DAPI-val festették. A képeket BX-51 Olympus fluoreszcens mikroszkóppal készítettük. A rendszeres ox-LDL felvétel és felhalmozódás mérésére a sejteket vinpocetinnel kezeltük a fent leírtak szerint, majd 24 órán át 50 μg/ml ox-LDL-vel (Biomedical Technologies, Inc.) töltöttük fel. A sejteket ezután mossuk, rögzítjük és olaj-vörös O oldattal festjük. A Dil-oxLDL és az Olaj-vörös O festési intenzitást Image-Pro 6.2 szoftverrel (Media Cybernetics) számszerűsítettük, és mindegyik mintához öt mezőt vizsgáltunk.

Statisztikai analízis

A mennyiségi eredményeket átlag ± SEM-ként vagy átlag ± SD-ként fejezzük ki a jelzettek szerint. Az összes bemutatott eredményt legalább három független kísérlet megerősítette. Az adatokat egyirányú ANOVA-val elemeztük. * P-értékek Az 1. ábrán a zsírtartalmú étrenddel etetett egerekben a teljes aorta érelmeszesedéses elváltozások jelentősen csökkentek a normál chow-étrendhez képest (1A. És B. Ábra). A vinpocetinnel végzett kezelés jelentősen csökkentette az olajvörös O-festett területeket (1A. És B. Ábra). Ezenkívül szövettani elemzésekkel értékeltük az aorta sinus intim elváltozásának területét, és megállapítottuk, hogy a vinpocetine csökkentette az aorta sinus intim elváltozásait is (1C. És D ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a vinpocetin javítja az érelmeszesedéses elváltozás kialakulását.

A vinpocetin hatása az érelmeszesedéses elváltozások kialakulására. (A) Reprezentatív En-arcképek az ApoE kiütéses egerek olajvörös festett aortájáról normál chow-val (NC) vagy magas zsírtartalmú étrenddel (HF) 16 héten át, 5 mg/kg/nap vinpocetin (Vinp) ip injekcióval vagy jármű sóoldata (Veh). (B) Az ateroszklerotikus elváltozás százalékos arányát mutató kvantitatív adatok a teljes aortában. (C) A magas zsírtartalmú étrenddel etetett és vinpocetinnel vagy vivőanyaggal injektált egerek H & E-vel festett aorta sinusának reprezentatív képei. (D) Az aorta gyökér intim elváltozási területeinek bemutatására vonatkozó kvantitatív adatok. Az értékek átlag ± SEM (n = 7 mind a vinpocetin, mind a hordozócsoport esetében). * P 1. táblázat). Fontos, hogy a vinpocetin-kezelés a halálozási arányt 27% -ról 8% -ra is csökkentette (1. táblázat). A vinpocetin védőhatásai nem tulajdoníthatók a lipid anyagcsere változásának, mivel a vinpocetin nem változtatta meg a plazma HLD, LDL és VLDL szintjét (1. táblázat). A magas zsírtartalmú étrend vérnyomás-növekedést váltott ki az ApoE -/- egerekben (1. táblázat), hasonlóan a korábban közölt megállapításokhoz [18; 19]. A vinpocetin elnyomta a vérnyomás emelkedését, ami összhangban van a vinpocetin értágító hatásával [20]. A vérnyomás azonban nem veszi figyelembe az ateroszklerózis kialakulását ApoE -/- egerekben [19]. Így a vinpocetin anti-atherogén hatását valószínűleg az érfalakra gyakorolt hatása közvetíti.

Asztal 1

Szérum koleszterin, vérnyomás, testtömeg és halálozási arány