Az alkoholmentes steatohepatitis GAN diéta által kiváltott elhízott egérmodelljének humán lefordíthatósága

Absztrakt

Háttér

Az alkoholmentes steatohepatitis (NASH) állatmodelljei fontos eszközök a preklinikai kutatásban és a gyógyszer felfedezésében. A Gubra-Amylin NASH (GAN) diéta által kiváltott elhízott (DIO) egerek a fibroszáló NASH modelljét képviselik. Ez a tanulmány közvetlenül értékelte a modell klinikai transzlálhatóságát a máj-biopszia szövettani és transzkripta-változásainak fej-fej összehasonlításával GAN DIO-NASH egér és humán NASH betegeknél.

Mód

A C57Bl/6 J egereket tápláltuk chow-val vagy telített zsírban (40%), fruktózban (22%) és koleszterinben (2%) gazdag GAN-diétával ≥38 hétig. Értékelték az anyagcsere paramétereket, valamint a plazma és a máj biomarkereit. A májbiopszia szövettanát és a transzkriptóm aláírásokat összehasonlítottuk az emberi sovány egyedek és a NASH diagnosztizált betegek mintáival.

Eredmények

A GAN DIO-NASH egerek májelváltozásai hasonló morfológiai jellemzőket mutattak a NASH páciens validációs készlethez képest, beleértve a makrosteatózist, a lobularis gyulladást, a hepatocyta ballonosodó degenerációját és a periportalis/perisinusoidalis fibrózist. A hisztomorfometrikus elemzés a máj lipid felhalmozódásának, gyulladásának és kollagén lerakódásának markereinek összehasonlítható növekedését mutatta GAN DIO-NASH egerekben és NASH betegmintákban. A GAN DIO-NASH egerek és a NASH betegek májbiopsziái összehasonlítható dinamikát mutattak a NASH patogenezisében szerepet játszó számos génexpressziós útvonalon. A NASH klinikai jellemzőivel összhangban a GAN DIO-NASH egerek a metabolikus szindróma kulcsfontosságú összetevőit mutatták be, beleértve az elhízást és a csökkent glükóz toleranciát.

Következtetések

A GAN DIO-NASH egérmodell jó klinikai transzlálhatóságot mutat az emberi betegség hisztopatológiai, transzkripciós és metabolikus aspektusai szempontjából, kiemelve a GAN DIO-NASH egérmodell alkalmasságát terápiás célok azonosítására és az új gyógyszeres terápiák jellemzésére a NASH számára.

Háttér

Az alkoholmentes zsírmájbetegség (NAFLD) a máj elváltozásainak folytonosságát foglalja magában, az egyszerű steatosistól az alkoholmentes steatohepatitisig (NASH), amelyet a steatosis mellett lobularis gyulladás és hepatocelluláris ballonos degeneráció jellemez [1]. A NASH a közegészségügy egyik fő kihívásává vált, világszerte növekvő gyakorisága, a diagnózis nehézségei, a súlyos szövődmények kockázata és a hatékony terápiák hiánya miatt. A metabolikus szindróma, nevezetesen az elhízás és a 2-es típusú cukorbetegség jelenléte a legerősebb hajlamosító tényező a NAFLD fejlődésére és progressziójára [2]. Míg az egyszerű steatosisnak általában jóindulatú folyamata van, a NASH-ban és a fibrózisban szenvedő betegeknél fokozott a májkal kapcsolatos szövődmények, köztük a cirrhosis, a hepatocelluláris carcinoma és a végstádiumú májbetegség kockázata. Ennek következtében a NASH várhatóan hamarosan a májtranszplantáció vezető indikációjává válik [3].

Jelen tanulmány célja a GAN diéta által kiváltott májelváltozások klinikai transzlálhatóságának további validálása volt, összehasonlítva a májbiopszia hisztopatológiai és transzkriptómjellemzőit GAN DIO-NASH egerekben és humán NASH betegekben.

Mód

Humán tantárgyak

Állatok

A Dán Állatkísérleti Felügyelőség jóváhagyott minden kísérletet, amelyet a laboratóriumi állatok felhasználására vonatkozó, nemzetközileg elfogadott elvek alapján hajtottak végre (engedélyszám: 2013-15-2934-00784). A C57BL/6 J egerek (5 hetesek) a Janvier Labs-tól (Le Genest Saint Isle, Franciaország) származnak, és ellenőrzött környezetben (12 órás világos/sötét ciklus, 3 órakor világít, 21 ± 2 ° C, páratartalom 50) ± 10%). Mindegyik állatot beültethető szubkután mikrochip segítségével azonosítottuk (PetID Microchip, E-vet, Haderslev, Dánia). Az egerek ad libitum hozzáféréssel rendelkeztek csapvízhez és chow-hoz (3,22 kcal/g, Altromin 1324, Brogaarden, Hoersholm, Dánia) vagy Gubra Amylin NASH diétához [GAN-étrend, 4,49 kcal/g, 40 kcal-% zsír (ebből 46% telített) zsírsavak tömegszázalékban), 22% fruktóz, 10% szacharóz, 2% koleszterin; D09100310, Kutatási étrendek]. Az egereket chow- vagy GAN-diétával etették 38–44 hétig. Az állatokat szívpunkcióval állítottuk le izoflurán altatásban.

A kórszövettani pontozás

Szemikvantitatív hisztopatológiai pontozást végeztünk HE- és PSR-festett emberen (egészséges, normál testsúlyú egyének), n = 14; NASH betegek, n = 16) és egér (chow-táplált egerek, n = 10; GAN DIO-NASH egerek, n = 25) májminták vakon, tapasztalt hepato-hisztopatológusok alkalmazásával, a NAFLD Activity Score (NAS) és a fibrózis staging rendszer segítségével, a Brunt-kritériumok szerint, Kleiner et al. [27]. A NAS pontszámot a steatosis (0–3), a lobularis gyulladás (0–3) és a ballonozás (0–2) pontszámainak súlyozatlan összegeként határoztuk meg, így 0 és 8 között változott. A májfibrózist egy ötfokú skála, azaz a fibrózis hiánya (0. stádium), perisinusoidalis vagy portális fibrózis (1. stádium), perisinusoidális és portális/periportális fibrózis (2. stádium), septum vagy áthidaló fibrózis (3. stádium), cirrhosis (és 4. stádium).

Máj hisztomorfometria

Emberi májbiopsziák (egészséges, normál testsúlyú egyének, n = 14; NASH betegek, n = 11) és egér lobularis minták (chow-táplált egerek, n = 10; GAN DIO-NASH egerek, n = 25) egy éjszakán át fixáltuk 4% paraformaldehidben, paraffinba ágyazva és metszve (3 μm vastagságban). A metszeteket hematoxilin-eozinnal (HE), anti-galektin-3-mal (kat. 125 402, Biolegend, San Diego, Kalifornia) vagy picro-Sirius Red-szel (PSR, Sigma-Aldrich, Broendby, Dánia) festettük szokásos eljárásokkal [28, 29.] A máj lipid (HE-festés), a gyulladás (galektin-3) és a fibrózis (PSR) frakcionált (%) területét a teljes metszeti területhez viszonyítva fejeztük ki.

Máj RNS szekvenálás elemzése

Eredmények

Összehasonlítható máj hisztopatológiai jellegzetességek a GAN DIO-NASH egerek és a NASH betegek

Az egér- és az emberi májbiopsziák egyedi hisztopatológiai pontszámait az 1. táblázatban mutatjuk be. Egészséges, normál testsúlyú emberi egyének normál tartományú májszövettani vizsgálattal rendelkeznek. A NASH-betegek közepes-súlyos steatosist (2–3. Fokozat), enyhe lobuláris gyulladást (1-es fokozat) és enyhe vagy kiemelkedő hepatocita-ballonozást mutattak (1–2. Fokozat). A 16 NASH-ból 13 betegnél fibrózist diagnosztizáltak, enyhe vagy közepes stádiumban (F1-F2). A chow-vel táplált kontroll egerekben a normál májszövettanhoz képest az összes GAN DIO-NASH egér súlyos steatózist mutatott (3. fokozat), a lobuláris gyulladás változó súlyosságú. Jelenleg a hepatocita ballonos degenerációja enyhe volt (1. fokozat). A 25 GAN DIO-NASH egérből 22-ben májfibrózis alakult ki, szinte mindegyik enyhe vagy közepesen súlyos fibrózist mutatott (F1-F2). A NASH betegek és a GAN DIO-NASH egerek viszonylag hasonló betegség-súlyosságát tükrözték az összehasonlítható NAFLD-aktivitási pontszámok (NASH-betegek, NAS 5–6; GAN DIO-NASH egerek, NAS 4–7), lásd a 2. táblázatot. A HOMA-IR szignifikánsan növekedett a NASH-betegeknél (7,6 ± 1,0, o 1. táblázat: A májbiopszia hisztopatológiai pontszámainak összehasonlítása humán NASH betegeknél és GAN DIO-NASH egereknél

Összehasonlítható kvantitatív máj hisztopatológiai változások GAN DIO-NASH egerekben és NASH betegeknél

A májzsír (HE festés), a gyulladásos sejtek beszivárgása (galektin-3 IHC) és a kollagén lerakódás (PSR festés) mennyiségi szintjét összehasonlítottuk humán és egér májbiopsziában (1. ábra). NASH-betegek (n = 11) szignifikáns növekedést mutatott a májzsír frakcionális (%) területén (8-szoros növekedés; 24,2 ± 2,6 vs. 2,9 ± 0,4%, o 2. ábra

A betegséggel összefüggő jelölt gének szabályozása NASH betegeknél és GAN DIO-NASH egereknél. a Betegséggel összefüggő májjelölt gének, b Kiválasztott májgének, amelyek a NASH különböző gyógyszercéljait képviselik. A színgradiensek szignifikánsan szabályozott (piros színű) és lefelé szabályozott (kék színű) génexpressziót jeleznek a NASH betegeknél (n = 16) és GAN DIO-NASH egerek (n = 25) összehasonlítva a megfelelő kontroll csoporthoz (egészséges normál testsúlyú egészséges emberek, n = 14; chow-táplált egerek, n = 10). A jelölt géneket az S1 táblázat tartalmazza

A GAN DIO-NASH egerek csökkent glükóz toleranciát mutatnak

A chow-táplált kontrollokhoz képest a GAN DIO-NASH egereknél szignifikánsan megnövekedett a testtömeg, megnövekedett az egész test zsírtömege (zsírosodás) és a hepatomegalia a befejezéskor (4A-4D. Ábra). Az ipGTT-t egy héttel a felmondás előtt egy héttel táplált és GAN DIO-NASH egerekben végeztük. Míg a kiindulási és a csúcs glükózszint hasonló volt a chow-táplált és a GAN DIO-NASH egereknél, a glükóz-kirándulások (t = 60–120 perc, o = 0,0029–0,0002) és a glükóz-AUC szintek (o = 0,0062) szignifikánsan emelkedett a GAN-DIO NASH egerekben, ami a glükóz tolerancia romlását jelzi a GAN DIO-NASH egerekben (4e. Ábra). A GAN DIO-NASH egerek hiperinsulinémiát mutattak ki, és ennek megfelelően szignifikánsan megnövekedett a HOMA-IR index a chow-val táplált egerekhez képest (4f. Ábra, g). A GAN-DIO NASH egerek hiperleptinémiát és hiperkoleszterinémiát is mutattak (4h. Ábra, i). Míg a plazma szabad zsírsavszintje általában emelkedett (o = 0,05), a plazma TG-koncentrációja nem változott (o = 0,75) GAN DIO-NASH egerekben (4j, k ábra).

Plazma és máj biokémiai változások a GAN DIO-NASH egerekben

Az elemzett egyéb plazma- és májbiokémiai paramétereket a 3. táblázatban mutatjuk be. A GAN DIO-NASH egereknél a májkárosodás (ALT, AST; o 3. táblázat: A plazma és a máj biokémiai markereinek emelkedése GAN DIO-NASH egerekben

A keringő és a máj citokinek/kemokinek szintjének emelkedése a GAN DIO-NASH egerekben

A plazma és a máj citokin/kemokin szintjét a 4. táblázat mutatja. A TNF-α plazma és máj koncentrációi egyaránt (plazma, p 4. táblázat: A plazma és a máj citokinszintjének emelkedése GAN DIO-NASH egerekben

Vita

Tekintettel a NASH bizonyítékokon alapuló hatékony terápiáinak hiányára, kifejezetten szükség van olyan állatmodellekre, amelyek jobban összefoglalják a betegség kardinális jellemzőit. Ezért a jelen tanulmány a GAN DIO-NASH egerek és a humán NASH betegek májbiopsziáinak hisztológiai és transzkriptóm változásainak fej-fej összehasonlításával értékelte a GAN DIO-NASH egérmodell klinikai transzlatálhatóságát. A fő megállapítás a GAN DIO-NASH egér modell jelentős klinikai transzlatálhatósága volt, figyelembe véve a humán NASH szövettani, transzkripciós és metabolikus aspektusait. Ez rávilágít a GAN DIO-NASH egérmodell alkalmasságára a terápiás célok azonosítására és a NASH új gyógyszeres terápiáinak jellemzésére.

Mivel a NAS és a fibrózis pontszámok szemikvantitatívak és korlátozott választ adnak a válaszadatokból, képalkotó alapú hisztomorfometriát alkalmaztunk a hisztológiai változások elfogulatlan kvantitatív értékeléséhez. A kvantitatív szövettani elemzés megerősítette a lipid felhalmozódást, az immunsejtek fokozott beszivárgását és a jelentős kollagén lerakódást GAN DIO-NASH egerekben és NASH betegeknél. A GAN DIO-NASH kohorszban a NASH páciensekhez képest általában magasabb hisztopatológiai pontszámokkal összhangban a GAN DIO-NASH egerek viszonylag nagyobb mennyiségi változásokat mutattak a NASH hisztopatológiai jellemzőiben.

Következtetések

Összegzésképpen elmondható, hogy a GAN DIO-NASH egér jó klinikai transzlálhatóságot mutat a fibrosizáló NASH fiziológiai, metabolikus és hisztopatológiai aspektusai tekintetében, valamint szoros összhangban áll az emberi betegség máj transzkriptóm aláírásával. Ezért a NASH egyértelmű metabolikus és hisztopatológiai jellemzői kiemelik a GAN DIO-NASH egérmodell alkalmasságát a terápiás célok azonosítására és az új gyógyszeres terápiák jellemzésére a NASH számára.

Az adatok és anyagok rendelkezésre állása

Az RNS szekvenálási adatok az NCBI GEO adatbázisban érhetők el a csatlakozási szám alatt. GSE126848. A jelenlegi vizsgálat során felhasznált és/vagy elemzett egyéb adatkészletek ésszerű kérésre rendelkezésre állnak a megfelelő szerzőtől.