Az angiotenzin AT2 receptor agonista megakadályozza a sóérzékeny magas vérnyomást elhízott Zucker patkányokban

Farmakológiai és Gyógyszerésztudományi Tanszék, Gyógyszerészeti Főiskola, Houstoni Egyetem, Houston, Texas

Az újranyomtatási kérelmek és egyéb levelezések címe: T. Hussain, Univ. Houston, Houston, TX 77204-5037 (e-mail: [e-mail védett]).

Absztrakt

a magas nátrium-bevitel kockázati tényező a magas vérnyomás patogenezisében, különösen az elhízásban (40, 44). Számos tanulmány elhízott ember- és állatmodellekben egyaránt azt sugallja, hogy az intrarenális mechanizmusok, mint például a renin-angiotenzin rendszer (RAS) hiperaktiválása, fokozott szimpatikus tónus és a vese fizikai kompressziója túlzott tubuláris reabszorpciót okoznak, ami térfogat-bővüléshez és a vér növekedéséhez vezet nyomás (21–23, 29, 36, 38, 41). Nemrégiben beszámoltunk arról, hogy a magas nátriumtartalmú étrend (HSD) az elhízott Zucker patkányok vérnyomásának növekedését (44) okozta, egy rágcsáló modellt, amelyet széles körben használnak az elhízással kapcsolatos veseműködési zavarok és magas vérnyomás megértésére (5, 7, 9). Ezenkívül a vérnyomás növekedése az anti-natriuretikus ANG II peptid növekedésével és az ANG pronatriuretikus peptid (1–7) csökkenésével járt ezeknek az állatoknak a vesekéregében (44).

Kísérleti protokoll

A hím elhízott Zucker patkányokat (10–11 hét) Harlan-tól (Indianapolis, IN) szereztük be. Megérkezés után az állatokat a Houstoni Egyetem állatgondozójában helyezték el. Az ebben a vizsgálatban használt állatkísérleti protokollokat a Houstoni Egyetem Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá. A hím elhízott patkányokat C21 AT2R agonistával (1 mg/kg -1 -1 nap -1, orálisan) kezeltük, normál-nátrium-étrenden (NSD; 0,4%) vagy HSD-n (4%) tartva 2 hétig. A patkányokat 4 napig metabolikus ketrecekben helyeztük el. Huszonnégy órás táplálék- és vízfelvételt rögzítettek, és a vizeletet naponta gyűjtötték az elmúlt 3 napos időszakban. Az egyes patkányok testtömegét feljegyeztük a kezelés megkezdése előtt és a kísérlet befejezésekor.

Glomeruláris szűrési arány FITC-inulin clearance-sel

Tovább 7. nap A C21 kezelés után FITC-inulinnal (5% sóoldatban) töltött mikro-ozmotikus szivattyúkat (Alzet, 1002 modell) helyeztünk a patkányok peritoneális üregébe izofluránnal altatásban. Tovább 13. nap és 14, vért (80 μl) vettünk a farokvénából. A FITC-inulin fluoreszcencia számát a plazmamintákban és az ugyanazon a napon összegyűjtött vizeletben (a fentiekben leírtak szerint) spektrofluorométerrel (Cytofluor Series 4000, Applied Biosystem) határoztuk meg. A glomeruláris szűrési sebességet (GFR) a GFR = (vizelet fluoreszcencia száma/24 óra)/(plazma fluoreszcencia szám/μl) képlettel számítottuk, és μl/perc formában jelentettük (5, 39).

Vérnyomás és pulzus a telemetriával

Az elhízott patkányokat egy éjszakán át éheztettük, és a műtétet Marcaine altatással kezeltük. A középvonal metszése után a telemetriás szondát (PA C-40 modell, Data Sciences International, St. Paul, MN) izoflurán altatásban (5% indukció, 3–4% karbantartás 1,5 l/perc mellett) ültettük a hasi aortába. A beültetés után az izmos hasfalat 4-0 poliészter varrattal zártuk, amely a telemetriás szondát is az elülső hasfalhoz rögzítette. A bőrt sebkapoccsal lezártuk, és karprofent (5 mg/testtömeg-kg ip) 24 óránként injektáltunk 3 napig a műtét után. Az állatokat 7 napig hagyták kiheverni az implantációs műtétből, mielőtt megkezdték a C2 AT2R agonistával történő kezelést. Az állatokat egyenként helyeztük el, és mindegyik ketrecet egy vevő fölé helyeztük, amelyet a vérnyomás és a pulzus telemetriai jelének monitorozására használtunk. Az adatgyűjtő szoftvert (Data Quest ART, Data Sciences) úgy állítottuk be, hogy a vizsgálat során 15 percenként 15 másodperces vérnyomás-mintát vegyen. Huszonnégy órás leolvasások átlagolták a napi vérnyomás-leolvasást. A vérnyomásmérés és az anyagcsere-ketrecben végzett vizsgálat végén az állatokat eutanizálták, a veséket eltávolították, patszárították, lemérték és -80 ° C-on fagyasztva tárolták biokémiai vizsgálatokhoz.

Vizelet mennyisége és nátrium

3 egymást követő naponként 24 óránként összegyűjtött vizeletet átlagoltuk minden állatra, és 24 óra vizeletmennyiségként adtuk meg, ml/nap. Az egyes vizeletmintákban lévő nátriumot Perkin Elmer AAnalyst 400 atomabszorpciós spektrométerrel határoztuk meg. A vizelet térfogatához hasonlóan minden egyes állatnál 3 napon keresztül gyűjtött vizeletminták vizelet Na térfogatának (UNaV) értékeit átlagoltuk és μmol/nap értékkel tüntettük fel.

Vizelet-nitrátok

A vizeletben lévő nitrátokat Griess reagenssel mértük. Röviden: a 24 órás vizelet 2 ml-es részét szűrjük Amicon Ultracel-10K centrifugális szűrőkkel 1 órán át, és a szűrletet 10-szer hígítjuk. A nitrát meghatározásához 50 μl szűrt vizeletet hagytunk reagálni 10 μl nitrátreduktáz enzimkészítménnyel és 10 μl kofaktor preparátummal, enyhe rázással 15 percig. E minták után a nitrát-standardokat (0–100 μM) és az üres anyagokat (desztillált víz) hagyták, hogy sötétben, enyhe rázás mellett 20 percig, 50% 2% szulfanilamiddal, 5% foszforsavban, majd 50 μl 0,2% -kal reagáltassanak. NEDD 20 percig sötétben, enyhe rázással. A képződött azo festéket 540 nm-en mértük, és a vizelet-nitrátokat μmol/nap értékkel számoltuk.

RAS-alkatrészek

Western blottolás.

Az AT1R, AT2R, ACE és kimáz expresszióját a vesekéregben Western-blottolással határoztuk meg. Erre a célra a vesekéregeket homogenizáltuk (mM) 50 Tris, 10 EDTA, 1 PMSF és proteáz inhibitorokat tartalmazó pufferben. Különböző patkánycsoportok azonos mennyiségű fehérjét (30 μg AT1R esetén, 60 μg AT2R, 40 μg ACE, 40 μg kimáz esetében) SDS-PAGE-nak és Western blot-nak vetettük alá, az AT1R, AT2R, ACE releváns primer antitestjeivel. és kimáz. Az elsődleges antitestekkel végzett inkubálást követően a blotokat releváns torma-peroxidázzal konjugált IgG-vel inkubáltuk. A jelet ECL rendszerrel detektáltuk, rögzítettük, és a Fluorchem 8800 (Alpha Innotech Imaging System, San Leandro, CA) elemzésével elemeztük a sávok sűrűségmérését. A blotokat eltávolítottuk és β-aktin egér monoklonális antitesttel újrapróbáltuk.

Renin és ACE2 aktivitás.

A renin és az angiotenzin-konvertáló 2-es típusú enzim (ACE2) aktivitását a vesekéregben a Sensolyte 520, illetve a Sensolyte 390 aktivitáskészlettel (Anaspec, Fremont, CA) mértük. Ezek a készletek Mca/Dnp fluoreszcencia rezonancia energiaátviteli (FRET) peptidet biztosítanak mátrix metalloproteináz (MMP) szubsztrátként. Az intakt FRET peptidben az Mca fluoreszcenciáját Dnp csillapítja. MMP-vel két különálló fragmensre hasítva az Mca fluoreszcenciája visszanyerhető, és gerjesztési/emissziós hullámhosszakon (490 nm/520 nm a reninnél és 330 nm/390 nm az ACE2-nél) monitorozható.

Angiotenzin peptidek.

Az ANG II és az ANG (1–7) peptidek szintjét a vesekéregben LC/MS alkalmazásával számszerűsítettük, amint azt a közelmúltban leírtuk (6). A szövetet lízispufferben (10 mM Tris, pH 7,4) homogenizáltuk, 15 percig 1600 ° C-on centrifugáltuk g, felülúszót tartalmazó oldatot C18-E (55 μm, 70A) patronba töltünk, és 60% acetonitrillel, 1% trifluorecetsavval és 39% desztillált vízzel egyensúlyozunk. Az oszlopot egyensúlyi pufferrel eluáljuk, és 15 ml-es csőbe gyűjtjük. Az eluenst megszárítottuk és 80% acetonitrilben és 0,1% hangyasavban rekonstruáltuk, mielőtt a peptideket LC/MS-vel elemeztük.

Vegyszerek

A C21-et egyedi szintetizálták (SPS Alfachem). Az ACE (sc-12187) és a β-aktin (sc-47778) antitesteket a Santa Cruz-tól vásároltuk. Kimáz antitestet (MA5-11717) a Thermo Scientific-től (Rockford, IL) szereztünk be. AT2R antitestet (EZBiolab, Westfielld, IL) és AT1R antitestet (Biomolecular Integrations, Little Rock, AR) szokás tenyészteni nyúlban. Az összes használt vegyszer szabványos minőségű volt, és a Sigma-tól (St. Louis, MO) vásárolta meg. A nitrát-reduktáz enzimet (780010) és a kofaktor készítményt (780012) a Cayman Chemical-tól (Ann Arbor, MI) szereztük be.

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± SE értékként adjuk meg. Az adatokat GraphPad Prism 4 (GraphPad, San Diego, CA) alkalmazásával elemeztük, és egyirányú ANOVA-nak vetettük alá Newman-Keuls post hoc teszttel. n = 5 az egyes csoportokban, amint azt az ábra jelmagyarázatai részletezik. A P értéke

1. táblázat: A kontroll és a C21-vel kezelt elhízott patkányok NSD-vel vagy HSD-vel etetett általános és veseparaméterei

Az értékek átlag ± SE; Egyutas ANOVA, majd Newman-Keuls teszt, P * Az értékek átlagosan 24 óra 14. nap.

† Jelentősen különbözik a kontroll elhízástól.

‡ Jelentősen különbözik a HSD-vel táplált patkányoktól.

HSD-vel etetett és/vagy C21-vel kezelt patkányok testtömege hasonló volt (1. táblázat); bár szignifikánsan nagyobb testtömeg-növekedést figyeltek meg a HSD-vel táplált patkányoknál (HSD 74 ± 5 vs. NSD 45 ± 8 g a megfelelő alaptömeg felett) a kezelés 2 hete alatt. A C21 kezelés megakadályozta a HSD-vel táplált patkányok testtömeg-növekedésének növekedését. A vese súlya változatlan volt a vizsgálati csoportok között (1. táblázat).

A GFR-t szignifikánsan csökkentette a HSD-etetés az NSD-vel táplált kontrollokkal összehasonlítva (NSD 654 ± 82 vs. HSD 202 ± 81 μl/perc). A C21-kezelés megmentette a GFR-t a HSD-vel táplált állatokban (HSD + C21 482 ± 47 μl/perc), de az NSD-vel táplált patkányokban nem volt hatással (1. táblázat).

A vizelet mennyisége és a nátrium kiválasztása

Az NSD kontrollokkal összehasonlítva a HSD-vel táplált patkányok nagyobb mennyiségű vizeletmennyiséget (HSD 19 ± 2 vs. NSD 9 ± 1 ml/nap) és vizelet-nátriumot (HSD 8 ± 0,6 vs. NSD 3 ± 0,4 μmol/nap) választottak ki. A C21-kezelés mind a vizeletmennyiség, mind a nátrium-kiválasztás jelentős növekedését okozta NSD-vel vagy HSD-vel etetett patkányokban (1. táblázat és 1. ábra).

1. ábra.A vizsgálatban használt protokoll sematikus ábrázolása.

Vizelet-nitrát kiválasztás

A nitrátok vizelettel történő kiválasztását (HSD 1,45 ± 0,22 vs. CT 0,69 ± 0,07 μmol/nap) szignifikánsan megnövelték a HSD-vel táplált állatokban, összehasonlítva a kontroll állatokéval. A C21-kezelés a vizelet-nitrátok további növekedését okozta a HSD-vel táplált patkányokban (1. táblázat).

Szisztolés vérnyomás

Amint a 2. ábrán látható, a telemetriai monitorozás kimutatta, hogy a HSD bevitele a szisztolés vérnyomás jelentős növekedését okozta az étrend 2 hete alatt. Noha a vérnyomás emelkedése a HSD-táplálás során fokozatos volt, a HSD-etetés második hetében bekövetkezett növekedés plasztikusnak tűnt, ami maximálisan 27 Hgmm-es növekedést jelent. A C21 kezelés teljesen megakadályozta a HSD által kiváltott vérnyomás-emelkedést. Az NSD-vel táplált patkányok vérnyomását a C21 kezelés nem befolyásolta. A pulzusszám és a diasztolés vérnyomás a kezelési periódus alatt minden csoportban hasonló maradt (csak az 1. táblázatban) 14. nap az adatok bemutatásra kerülnek).

2. ábra.A kontroll és a C21-vel kezelt elhízott patkányok szisztolés vérnyomása normál vagy magas nátriumtartalmú étrenddel (HSD) táplálkozott 2 hétig. @ Jelentősen különbözik a kontroll patkányoktól. # Jelentősen különbözik a HSD elhízott patkányoktól. Az értékek átlag ± SE; Egyutas ANOVA, majd Newman-Keuls teszt, P

RAS-alkatrészek

AT1R és AT2R.

Az NSD-vel táplált patkányok HSD táplálása vagy C21 kezelése nem volt hatással a kortikális AT1R (43 kDa sáv) expressziójára. Azonban az AT1R expresszió HSD-vel táplált patkányokban bármelyik csoporthoz viszonyítva a felére csökkent C21-kezeléssel (3. ábraA). A Western blot az AT2R jelenlétét mutatja három sávként (44/45 és 39 kDa) a vesekéregben. Az AT2R ezen három sávja a glikozilezés különböző fokainak köszönhető, amint azt korábban bemutattuk (19). Az AT2R mindhárom sávjának kompozit denzitometriája azt mutatta, hogy az AT2R kérgi expresszióját sem a HSD táplálás, sem a C21 kezelés nem befolyásolta (3. ábraB).

3. ábra.Az 1. típusú angiotenzin receptor expressziója (AT1R; A) és az AT2R (B) a kontroll és C21-kezelt elhízott patkányok normál-nátrium-diétával vagy HSD-vel táplált vesekéregében. Felül panelek: reprezentatív Western-blotok a megfelelő fehérjékhez, betöltő kontroll β-aktinnal. Oszlopdiagramok: a megfelelő fehérje sávok és a β-aktin, azaz AT1/β-aktin, AT2/β-aktin sűrűségének arányát mutatják be. # Jelentősen különbözik az elhízott HSD-vel kezelt patkányoktól. Az értékek átlag ± SE; Egyutas ANOVA, majd Newman-Keuls teszt, P

Renin aktivitás és kimáz expresszió.

A kortikális renin aktivitása az összes kezelési csoportban nem változott (4. ábraA). A vesekéreg Western blot-ján 35 kDa sáv mutatkozott meg a kimáz esetében, amelyet a HSD és/vagy C21 kezelések szintén nem érintettek (4. ábraB).

4. ábra.Renin-tevékenység (A), kimáz expresszió (B), az angiotenzin-konvertáló enzim (ACE) expressziója (C), ACE2 aktivitás (D) és az ANG II (E) és ANG (1–7) (F) peptidszintek a kontroll és C21-kezelt elhízott patkányok normál-nátrium-diétával vagy HSD-vel táplált elhízott patkányokban. Felül panelek: reprezentatív Western-blotok a megfelelő fehérjékhez, betöltő kontroll β-aktinnal. Oszlopdiagramok: a megfelelő fehérje sávok és a β-aktin, azaz ACE/β-aktin, kimáz/β-aktin sűrűségének arányát mutatják be. @ Jelentősen különbözik a kontroll patkányoktól. # Jelentősen különbözik a HSD elhízott patkányoktól. Az értékek átlag ± SE; Egyutas ANOVA, majd Newman-Keuls teszt, P

ACE expresszió és ACE2 aktivitás.

A vesekéreg Western blotja 170 kDa sávot mutatott az ACE számára (4. ábraC). Ezen sávok denzitometriája arra utalt, hogy az ACE expresszióját nem befolyásolta a HSD táplálás és/vagy a C21 kezelés. Éppen ellenkezőleg, az ACE2 aktivitás a vesekéregben a HSD táplálása után nagymértékben csökkent, és ezt a csökkenést a C21 kezelés megakadályozta (4. ábraD).

Angiotenzin peptidek.

A HSD-vel táplált patkányok vesekéregében az ANG II szintje majdnem négyszer magasabb volt, mint az NSD kontrolloké. A C21 kezelés gyengítette a HSD által kiváltott ANG II növekedést elhízott patkányokban (4. ábraE). Az ANG II változásokkal ellentétben az ANG (1–7) szintet csökkentette a HSD etetése, és ezt a csökkenést a C21 kezelés normál szintre állította (4. ábraF).

A fokozott vese Na-felszívódás az elhízás hipertóniájának patogenezisében játszik szerepet. A pontos mechanizmus azonban nem tisztázott, de a vese Na újrafelszívódása, amely a perifériás rezisztencia növekedéséhez vezető térfogat-bővüléssel jár, általános mechanizmusnak tekinthető (22). Jelen tanulmányban az AT2R agonista C21 diurézist/natriurezist és esetleg az intravaszkuláris térfogat csökkenését, amit a csökkent súlygyarapodás jelez, globális mechanizmust jelenthet a vérnyomás csökkentéséért a HSD-vel táplált elhízott patkányokban. Megfigyeltük azt is, hogy a HSD-vel táplált elhízott patkányok csökkent GFR-t mutattak, ami a krónikus vesebetegség jele (50), ami a tartós magas vérnyomás következménye lehet. Az elhízott patkányok már korábban kezdik mutatni a glomerulosclerosist (12); valószínű, hogy a magasabb vérnyomás mellett a magas nátrium-bevitel önmagában felgyorsíthatja a glomeruláris károsodást a HSD-vel táplált patkányokban. Úgy tűnik, hogy az AT2R aktiválása védő, amint azt korábban javasoltuk (12). Mivel a csökkent GFR a fokozott vese nátrium-visszatartással jár, valószínűleg a HSD-vel táplált patkányokban a GFR növekedése a C21 kezelés hatására helyreállította a vizelet nátrium-kiválasztását, és ezáltal védelmet nyújtott ezeknél az állatoknál a vérnyomás-emelkedés ellen.

Az NSD-vel táplált elhízott patkányok vérnyomását a C21-kezelés nem befolyásolta, ami ellentétes korábbi beszámolónkkal (5). Az eltérés azonban alapulhat 1) agonista: egy korábbi vizsgálatban a CGP42112A peptid agonistát szubkután beültetett ozmotikus pumpán keresztül juttatták be; a jelen vizsgálatban a C21-et, egy új orálisan aktív nonpeptid agonistát adták szájon át az állatoknak, és 2) módszerek a vérnyomás mérésére: a korábbi vizsgálatokban a vérnyomást csak stressz alatt (érzéstelenítés vagy farok mandzsetta) mérték (5, 42), ami a vérnyomás emelkedését okozta (28), amit a CGP42112A-val kezelt állatoknál megakadályoznak ( 5.) Jelen tanulmány radiotelemetriai megközelítést használt a vérnyomás folyamatos mérésére 2 hét múlva szabadon mozgó állatokban. Egyes tanulmányok (33), beleértve a publikálatlan adatainkat (átlagos artériás nyomás: elhízott 107 ± 1, sovány 103 ± 1 Hgmm), azt sugallják, hogy az elhízott patkányok ebben a korcsoportban nem lehetnek hipertóniásak, ezért a C21 várhatóan nem csökkenti a vérnyomást kontroll elhízott patkányok.

Összefoglalva, a jelen tanulmány azt mutatja, hogy az AT2R aktiváció egy új C21 agonistával megakadályozza a só által kiváltott vérnyomásemelkedést elhízott Zucker patkányokban. A további C21-kezelés az anti-natriuretikus ANG II/AT1R szint és a pronatriuretikus ANG (1–7) szintjének csökkenését okozza, ami azt sugallja, hogy potenciálisan részt vesznek az AT2R-aktiváció antihipertenzív hatásaiban az elhízásban magas nátrium-bevitel mellett.

Ezt a tanulmányt a Nemzeti Egészségügyi Intézetek R01 támogatása DK61578 támogatta .

A szerző (k) nem jelentenek be pénzügyi vagy egyéb összeférhetetlenséget.