Az antihipertenzív és trigliceridszintet csökkentő szerek hatása a máj rézkoncentrációjára zsírmájbetegségben szenvedő patkányokban

Orvostudományi osztályok, Hadassah-Héber Egyetem Orvosi Központ, Jeruzsálem, Izrael

A levelezés szerzője: Zvi Ackerman, Orvosi Osztály, Hadassah-Héber Egyetem Orvosi Központ, Mount Scopus Campus, P.O. Box 24035, Jeruzsálem 91240, Izrael (fax: +972 2 5823515,

Orvostudományi osztályok, Hadassah-Héber Egyetem Orvosi Központ, Jeruzsálem, Izrael

Ort Braude Műszaki Főiskola, Karmiel, Izrael

Kémiai Patológiai Intézet, Sheba Orvosi Központ, Tel Hashomer, Izrael

Orvostudományi osztályok, Hadassah-Héber Egyetem Orvosi Központ, Jeruzsálem, Izrael

A levelezés szerzője: Zvi Ackerman, Orvosi Osztály, Hadassah-Héber Egyetem Orvosi Központ, Mount Scopus Campus, P.O. Box 24035, Jeruzsálem 91240, Izrael (fax: +972 2 5823515,

Orvostudományi osztályok, Hadassah-Héber Egyetem Orvosi Központ, Jeruzsálem, Izrael

Ort Braude Műszaki Főiskola, Karmiel, Izrael

Kémiai Patológiai Intézet, Sheba Orvosi Központ, Tel Hashomer, Izrael

Absztrakt

Az alkoholmentes zsírmájbetegség (NAFLD) a legelterjedtebb krónikus májbetegség. A NAFLD világszerte elterjedtsége folyamatosan növekszik az egyre növekvő elhízási járvánnyal (áttekintve az 1. részben). A NAFLD leggyakoribb kockázati tényezője a metabolikus szindróma jelenléte, amely magában foglalja a hasi elhízást és a következő két vagy több tulajdonságot: magas vérnyomás, emelkedett éhomi plazma glükóz- és trigliceridszint vagy alacsony plazma HDL-koleszterinszint. A NAFLD a metabolikus szindróma máj megnyilvánulásának tekinthető (áttekintve a 2. részben).

Humán és állatkísérletekből származó összesített bizonyítékok azt sugallják, hogy a NAFLD növekvő prevalenciája összefügg az egyszerű cukrok, különösen a fruktóz növekvő bevitelével (áttekintve 3, 4). A fruktóz hosszú ideig történő fogyasztása hajlamosíthatja az állatokat és az egyéneket a máj zsíros beszivárgására és a 3-7 metabolikus szindrómára. Az elmúlt években az élelmiszeriparban édesítőszerként használt fruktózfogyasztás rendkívüli mértékben megnőtt 4 .

Mostanáig több patofiziológiai mechanizmus, beleértve a rézhiányt, összefüggésbe hozta a megnövekedett fruktóz-fogyasztást és a NAFLD 4, 8-12 fejlődését .

A réz olyan nyomelem, amely elengedhetetlen a különféle biológiai folyamatokban részt vevő számos enzim működéséhez. Az elmúlt évtizedekben az Egyesült Királyságban és az Egyesült Államokban végzett vizsgálatok megerősítették, hogy a különböző élelmiszer-ipari termékek (például hús, gyümölcs és zöldség) réztartalma csökken. Becslések szerint a csökkent rézfogyasztás következtében a nyugati lakosság nagy része hajlamos a rézhiány és az egészséggel kapcsolatos problémák kialakulására (áttekintve 12, 13). A rézhiányról ismert, hogy hatással van a szív- és érrendszeri, mozgásszervi és idegrendszerre, különféle hematológiai rendellenességeket okoz, rontja az immunrendszer működését, károsítja a koleszterin és a glükóz anyagcseréjét, és befolyásolja a máj antioxidáns rendszerének működését. (áttekintve 12., 13.).

Csoportunk korábbi publikációiban bemutattuk a fruktózzal dúsított étrend (FED) patkány modelljének jellemzőit a nem elhízással összefüggő NAFLD esetében 5, 14. A FED patkányokban máj makro- és mikrovezikuláris zsírlerakódások, a trigliceridek és a koleszterin májtartalmának növekedése, a máj oxidatív stresszének növekedése és a máj antioxidatív útvonalainak hibáinak növekedése alakult ki 5, 14-16. A FED patkány modellt a metabolikus szindróma több aspektusa is jellemezte, beleértve az inzulinrezisztenciát, a hipertrigliceridémiát és a magas vérnyomást 5, 14-16. A magas vérnyomás (amlodipin vagy kaptopril) vagy a plazma trigliceridek (bezafibrát) csökkentésére szolgáló gyógyszerek a vérnyomás és a plazma trigliceridek várható csökkenése mellett váratlan változásokat okoztak a máj szövettanában, a szérum májenzimekben, a szérum és a máj lipidjeiben, inzulinrezisztenciában, máj vasban koncentráció (HIC), változások a máj oxidatív, antioxidáns közegében és változások a splenocita apoptózisában 5, 14-17 .

Jelen munka célja a patkányokban a plazma és a máj rézkoncentrációjának változásainak jellemzése volt, akiknek FED-et adtak farmakológiai manipulációkkal és anélkül, hogy csökkentik a vérnyomást vagy a plazma triglicerideket. A máj rézkoncentrációjának változásai korreláltak a réz – cink – szuperoxid-diszmutáz (CuZnSOD: SOD1), metallotionein (MT) és nitrotirozin (NITT) immunhisztokémiai máj expressziójában megfigyelt változásokkal, amelyek különböző patkánycsoportokban fordultak elő.

Anyagok és metódusok

Állatok

Ebben a vizsgálatban az előző vizsgálatunkban 5 vizsgált állatokból archivált máj- és plazmamintákat elemeztük. Harminc 200 ± 20 gramm súlyú hím Sprague-Dawley patkányt (Harlan Laboratories Ltd., Jeruzsálem, Izrael) vizsgáltak. A patkányokat rendszeres ketrecekben helyezték el, 22 ° C-on, egy állati helyiségben, 14/10-órás világos/sötét ciklussal. A patkányokat standard patkány-chow-étrenden tartottuk (pelletek # 19520; Koffolk, Tel-Aviv, Izrael), és csapvizet adtak inni ad libitum. Az állatokkal végzett összes eljárás összhangban volt a Sába Orvosi Központ állatkísérletekkel kapcsolatos irányelveivel és az Intézményi Állatetikai Bizottság jóváhagyta.

A vizsgálat elején a patkányokat véletlenszerűen öt csoportba osztották (mindegyik csoportban hat patkány). Az egyik csoportot 5 hétig továbbra is standard patkány-chow-étrenden tartották, míg a másik négy csoport 5 hétig FED-et kapott (TD 89247 ‐ Harlan Teklad, Madison, WI, USA). A FED 20,7% (tömegszázalékban) fehérjét (kazeinként), 5% zsírt (sertészsírként), 60% szénhidrátot (fruktózként), 8% cellulózot, 5% ásványi anyag keveréket, R‐ tartalmazott (a Harlan Teklad szállítása szerint) H (# 170760) és 1% vitaminkeverék, Teklad (# 40060). A TD 89247 diéta 1 kg étrendben 30 mg rézt (réz-szulfát formájában) tartalmaz. A standard patkány-chow-étrend (a Koffolk által rendelkezésre bocsátott módon) 21,9% fehérjét, 4,5% zsírt, 41% keményítőt, 5% cukrot és 3,7% nyersrostot tartalmaz. A standard patkány-chow-étrend 10 mg rézet tartalmaz (réz-szulfát és réz-karbonát formájában) 1 kg étrendben. Mindkét étrendet pellet formában szállították.

Három héttel a FED megkezdése után (amikor a metabolikus szindróma minden összetevője már jelen volt) a patkányok négy csoportjából háromnak további gyógyszerészeti beavatkozást adtak 2 hétig. Az egyik csoport amlodipint (15 mg/kg naponta; Pfizer, New York, NY, USA), egy másik csoport kaptoprilt (90 mg/kg naponta; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) és a harmadik csoportnak bezafibrátot adtak (10 mg/kg naponta; Roche Diagnostics GmbH, Bázel, Svájc). Az összes gyógyszert feloldottuk 0,5 ml etanolban, hígítottuk és beadagoltuk az ivóvízbe. A kísérlet utolsó 2 hetében a víz bevitele napi öt ml-ig korlátozva volt öt állat számára, a gyógyszer teljes adagolásának és az egységes vízfogyasztásnak az összes csoportban történő biztosítása érdekében. Az ebben a vizsgálatban alkalmazott gyógyszerek dózisai a hipertónia csökkentésében és a plazma trigliceridszint csökkentésében hatnak 5. Az 1. táblázat összefoglalja a tanulmány vázlatát, az étrendeket és a gyógyszercsoportok számára biztosított gyógyszereket.

1., 2. és 3. hét, 4. és 5. hét

1. csoport (n = 6)	Csak a chow diéta	Csak a chow diéta
2. csoport (n = 6)	Csak fruktózzal dúsított étrend	Csak fruktózzal dúsított étrend
3. csoport (n = 6)	Csak fruktózzal dúsított étrend	Fruktózzal dúsított étrend + amlodipin
4. csoport (n = 6)	Csak fruktózzal dúsított étrend	Fruktózzal dúsított étrend + kaptopril
5. csoport (n = 6)	Csak fruktózzal dúsított étrend	Fruktózzal dúsított étrend + bezafibrát

A „farmakológiai beavatkozási időszak” végén a patkányokat leölték. Májukat betakarították és megmérték. Minden májszövet két részét foszfáttal pufferolt formaldehidben rögzítettük. Az egyiket paraffinba ágyazták, a másikat a máj rézkoncentrációjának meghatározására használták.

A máj és a plazma rézkoncentrációinak meghatározása

A máj és a plazma rézkoncentrációinak meghatározását atomabszorpciós spektrométerrel határoztuk meg. A rézkoncentrációk eredményeit μg/gramm száraz májszövetben és μg/dl-ben fejeztük ki a plazmában. Az egész eljárás részleteit másutt mutatjuk be 18 .

Immunhisztokémia és képelemzés

A formalinnal rögzített, paraffinba ágyazott májszöveteket 5 μm-nél metszettük. A deparafinizált, rehidratált szakaszokat egymás után a következő eljárásoknak vetettük alá: hő által indukált epitóp visszanyerés citrátpufferben, 3% -os peroxiddal történő blokkolás és Background Buster (INNOVEX, Richmond, Kalifornia, USA). Nyúl anti-nitrotirozin (EEMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA), 1: 200 arányban hígítva; Nyúl anti-SOD-1 (Proteintech, Chicago, IL, USA), 1: 100 arányban hígítva; és 1: 100 arányban hígított egér monoklonális anti-metallotioneint (keresztreakciók MT1-vel és MT2-vel; DAKO, Dánia) egy éjszakán át 4 ° C-on hígítottunk. Az antitesteket a ZytoChem Plus HRP Polymer anti-Mouse egérrel (ZYTOMED, Németország), majd a diaminobenzidin-tetrahidrokloriddal [DAB Chromogen System (SIGNET), Covance, Anglia], standard eljárásokkal detektáltuk. Minden festési eljárás negatív kontrollokat tartalmazott. A metszeteket enyhén festették Mayer hematoxylinnel, és az EUKITT-be helyezték.

A fehérje expressziót (SOD1, MT és NITT esetében) a májsejtek immunpozitivitásának optikai intenzitásának mérésével (pixelben), 3 májhártya 3 mezőjében, a központi vénák körül elhelyezkedő májszövetekben (minden állaton kilenc mező) mértük. A képelemzést módosított megközelítéssel hajtottuk végre az imagej szoftverben. A májszakaszok szövettani értékelését vakon végeztük (GS).

Statisztikai értékelés

Az adatok átlag ± standard hiba (S.E.M.) formájában vannak ábrázolva. A csoportok közötti összehasonlításokat egyirányú varianciaanalízissel (anova) Tukey – Kramer többszörös összehasonlító teszttel, vagy ha szükséges, Kruskal – Wallis teszttel (nemparametrikus anova) végeztük. o ≤ 0,05 statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

Eredmények

A FED patkányok májjában enyhe vagy közepesen súlyos makro- és mikrovezikuláris májzsír-infiltrátumok és nagyon enyhe szinuszos fibrózis voltak 5. A FED beadása a máj rézkoncentrációjának 2,2-szeres csökkenésével járt (o 5 és a máj rézkoncentrációiban. A kaptopril beadása a FED patkányokhoz 50% -os csökkenést okozott a makrovesicularis májzsír infiltrátumokban 5, de a máj rézkoncentrációjában nem változott. A bezafibrát beadása a FED patkányoknál a máj makrovesicularis májzsír infiltrátumainak 90% -os csökkenését okozta, de a mikrovezikuláris zsír infiltrátumok, gyulladásos vagy fibrózisos pontszám 5 nem változott. A bezafibrát beadása a FED patkányok számára visszaállította a máj rézkoncentrációját a chow (kontroll) csoportban megfigyelt szintekre (1. ábra). A plazma rézkoncentrációjának változását nem figyelték meg a különböző vizsgálati csoportok között (2. ábra). A FED beadása csökkentette a máj SOD1 expresszióját (o

A fruktózzal dúsított étrend a máj MT expressziójának eltűnését okozta. A FED patkányok tárgylemezén csak háttérfestést figyeltünk meg. Az amlodipin beadása a FED patkányokhoz nem társult a máj MT expressziójának további változásaival. Akár captopril, akár bezafibrát beadása a FED patkányokhoz a máj MT expressziójának jelentős növekedését okozta (o

A fruktózzal dúsított étrend beadása a máj NITT expressziójának növekedésével járt (o

Vita

Ebben a tanulmányban kimutattuk, hogy a Sprague-Dawley patkányoknál, akik 60% -os FED-et kaptak és a metabolikus szindróma jellemzői mellett kialakult NAFLD, csökkent a réz májkoncentrációja, csökkent a réz által szabályozott máj antioxidáns fehérjék expressziója (SOD1 és MT ) és az oxidatív stressz marker (NITT) fokozott máj expressziója.

A máj rézhiány és a NAFLD közötti összefüggést korábban 8-12. Között jelentették. A NAFLD-vel rendelkező egyéneknél alacsonyabb a máj rézkoncentrációja, mint a 9, 10 kontroll egyéneknél. Sőt, a fejlettebb NAFLD formában (alkoholmentes steatohepatitis) szenvedő betegeknél alacsonyabb a máj rézkoncentrációja, mint a kevésbé fejlett NAFLD formájú betegeknél (egyszerű steatosis) 8, 9 .

Számos patofiziológiai mechanizmust javasoltak a máj rézhiány és a NAFLD összekapcsolására. Ezek közé tartozik a máj triglicerid termelésének növekedése és a plazma koleszterin és triglicerid koncentrációjának növekedése, valamint a máj antioxidáns rendszerének elnyomása és a HIC növekedése.

Az étkezési réz korlátozása kísérleti állatokban arról számolt be, hogy növeli a plazma koleszterin- és trigliceridszintjét 19. Ezenkívül a rézhiányos patkányok fruktóz takarmányozása a plazma koleszterinszintjének, valamint a plazma és a máj triglicerid koncentrációjának további növekedését okozta, és ezáltal a máj gyulladását eltúlozta 20, 21. Javasoljuk, hogy az étkezési fruktóz metabolikus hatásai mellett a rombusz felszívódását is gátolhatja a rák bélben történő felszívódásával azáltal, hogy gátolja a nyombélben és a proximális jejunumban található réz transzportert .

Jelen tanulmányban egyedülálló megállapítást fedeztek fel: a bezafibrát beadása a FED patkányokhoz a máj rézkoncentrációjának növekedésével járt. Mások már beszámoltak arról, hogy a fibrátok patkányoknak történő beadása a máj rézkoncentrációjának növekedését eredményezte 23. Egyelőre nem világos, hogy a fibrátok beadása miként okozta a máj rézkoncentrációjának növekedését.

A jelen tanulmány megállapításai összhangban vannak a korábban beszámoltakkal; a máj SOD1 expressziójának csökkenését figyelték meg a rézhiányos FED patkányokban. Ezenkívül szignifikáns korrelációt észleltek a máj rézkoncentrációjának értéke és a máj SOD1 expressziójának értéke között minden, a vizsgálatban részt vevő állat esetében. A bezafibrát adagolása a máj rézkoncentrációjára gyakorolt hatása mellett a máj működését is javíthatja 26. Csoportunk korábbi publikációjában arról számoltak be, hogy ezekben a NAFLD-vel rendelkező FED patkányokban a SOD2 gén és a fehérje expresszió csökkenése is bekövetkezett 16. A jelen jelentéshez hasonlóan a bezafibrát adagolása visszaállította az SOD2 gén és fehérje expresszióját az alapszintre 16. Mind a SOD1, mind a SOD2 csökkent máj expressziójának megállapításai ezekben a patkányokban FED alkalmazásával, és mindkét enzim máj expressziójának helyreállítása bezafibráttal felveti annak lehetőségét, hogy a rézhiány mellett a májkárosodás is felelős a redukcióért a máj SOD1 expressziója.

Számos tanulmány arról számolt be, hogy azoknál az egyéneknél és kísérleti állatoknál, akik FED-et fogyasztanak és rézhiányosak, a HIC növekedése 8-11. A HIC növekedése rézhiányos egyéneknél a fokozott duodenális vas felszívódáshoz és/vagy a máj májexportjának károsodásához kapcsolódik 8-11, 35, 36. Azt javasolták, hogy a megnövekedett HIC közvetítheti a máj oxidatív stresszének növekedését és a NAFLD 8-11 progresszióját. Azonban, amint azt korábban említettük, nem tudtuk kimutatni a HIC növekedését a FED patkányokban, amelyek kifejlesztették a NAFLD 5-t .

Vizsgálatunknak számos korlátja van: (a) a máj rézkoncentrációinak meghatározását ebben a vizsgálatban olyan archivált májszövetekben végezték, amelyeket foszfáttal pufferolt formaldehidben rögzítettek. A máj rézkoncentrációinak meghatározása azonban olyan szövetekben, amelyeket formalinnal rögzítettek vagy évekig paraffin blokkokban tároltak, ugyanolyan megbízhatónak bizonyult, mint a friss májszövetekben végzett mérések 37. (b) Vizsgálatunk jellege (archivált máj- és plazmaminták elemzése) miatt nem voltunk képesek megbízható molekuláris biológiai technikákat végrehajtani, hanem csak immunhisztokémiai elemzéssel tanulmányoztuk az SOD1, MT és NITT máj expressziójában bekövetkezett változásokat, mint a különféle farmakológiai manipulációk eredményeként.

A NAFLD patogenezise a fruktózt fogyasztó egyénekben összetett. Ebben a vizsgálatban bebizonyosodott, hogy a NAFLD-vel rendelkező FED patkányok alacsony májréz-koncentrációval rendelkeznek. A csökkent máj rézkoncentráció hozzájárulhat ezen patkányok elnyomott máj antioxidáns kapacitásához, és ezért valószínűleg „második találatként” szerepet játszik a NAFLD progressziójában. A bezafibráttal kezelt patkányokban a FED által indukált NAFLD javulása részben a bezafibrát által kiváltott májréz-koncentráció növekedésének köszönhető. További vizsgálatokra van szükség annak kiderítésére, hogy a NAFLD-ben szenvedő betegek étrend-kiegészítése javíthatja-e májbetegségüket.