Az antioxidáns BO-653 antiatherogén hatása három különböző állatmodellben

Szerkesztette: Daniel Steinberg, a Kaliforniai Egyetem, San Diego, La Jolla, Kalifornia, és jóváhagyta 1998. június 1-én (felülvizsgálatra kapott: 1998. április 1.)

három

Absztrakt

Az antioxidánsok antiaterogén potenciállal rendelkeznek az alacsony sűrűségű lipoprotein (LDL) oxidáció gátlásával. Itt egy antioxidánsról, a BO-653-ról számolunk be (2,3-dihidro-5-hidroxi-2,2-dipentil-4,6-di-terc-butil-benzofurán), amelynek célja az α-tokoferoléhoz hasonló antioxidáns hatékonyság, de mégis magas fokú lipofilitással rendelkezik, mint a probucolé. A BO-653 nagy affinitást mutat az LDL iránt, és in vivo jól eloszlik az aorta erekben. Nyulak és egerek érelmeszesedési modelljeiben kimutatták, hogy a BO-653 nem kívánt mellékhatások nélkül képes elnyomni az érelmeszesedéses elváltozások kialakulását. Pontosabban, a nagy sűrűségű lipoprotein szint nem csökkent. Ez az antioxidáns további bizonyítékot nyújt az oxidált LDL hipotézis alátámasztására, és maga is ígéretes antioxidáns jelölt klinikai alkalmazásra.

A fent leírt helyzet felismeréseként egy olyan vegyület megtervezését tűztük ki célul, amely in situ az artériás falban az LDL oxidációja ellen aktív, de nem csökkenti a HDL szintet. Erre a célra olyan szűrési stratégiát valósítottunk meg, amely egy ígéretes antioxidáns vegyülethez, a BO-653-hoz vezetett. Ez a vegyület képes számos állatmodellben jelentősen elnyomni az ateroszklerotikus elváltozások képződését a HDL csökkenése nélkül. Ezek az eredmények bizonyítékokkal támasztják alá az oxidált LDL hipotézist, és azt sugallják, hogy ez a vegyület ígéretes antioxidáns a klinikai alkalmazáshoz.

Drogtervezés.

Ennek az antiaterogén antioxidánsnak a megtervezése a rendelkezésre álló antioxidánsok bizonyos gyenge pontjainak leküzdésére irányult. A jellemzők egyedülálló kombinációját szerettük volna elérni: (i) magas reakcióképességet a lipoprotein oxidációval szemben és (ii) lokalizációt az LDL részecske hidrofób magjában. A nagy reakcióképességet ésszerűen úgy tervezik meg, hogy csökkentik a fenolos O-H kötés disszociációs energiáját, vagyis a fenolos hidroxilcsoportra para-helyzetben lévő oxigénatom stabilizálni tudja a fenoxicsoportot, ha 5 tagú gyűrűhöz tartozik, amint azt leírták. írta Ingold et al. (17) Így az előbbi jellemzők elérése érdekében hidroxibenzofurán szerkezetet terveztünk. A probucol az utóbbi jellemző miatt jól ismert (18), és e tekintetben különbözik egy antioxidánstól, például az α-tokoferoltól, amely csak az LDL felszíni lipidjeivel képes kölcsönhatásba lépni (19). Ezenkívül olyan vegyületet kerestünk, amely: (iii) nem mutat mellékhatásokat, például HDL-redukciót (8, 20), és (iv) hatékony felszívódást és bejutást mutat az artériába, ami az LDL oxidációjának kulcsfontosságú helye.

Szűrési stratégia.

A 600 újonnan szintetizált antioxidáns könyvtárából a fent említett kritériumok szerint megvizsgáltuk (i) az oxidált LDL makrofágbontásának gátlását a fémionokkal történő inkubálás után különféle vegyületek jelenlétében, (ii) az oxidatív iniciátorok variáns hatását LDL oxidációs rendszerekben, (iii) reaktivitás peroxilgyökökkel az első két kritérium kiválasztása után, és (iv) felszívódási és eloszlási tulajdonságok orális beadás után Watanabe-féle örökletes hiperlipidémiás (WHHL) nyulakban.

MÓD

Kísérleti állatok.

2-3 hónapos WHHL hím nyulakat a Kitayama Labes-tól (Ina, Japán) vásároltak. 5 hetes nőstény C57BL/6J egereket a Clea Japan-tól (Tokió, Japán) vásároltunk. A 6 hetes hím és nőstény LDL-receptor knockout egereket és a 3 hónapos JW nyulakat a CSK Research Parktól (Tokió, Japán) szereztük be. Nőstény ICR egereket a Charles River Japan-tól (Atsugi, Japán) vásároltunk peritoneális makrofág-készítményekhez. A peritoneális makrofágokat Adams (21) módszere szerint készítettük Brewer tioglikolát táptalajának (Difco) felhasználásával. A kísérleteket megelőzően legalább 1 hétig a nyulakat és az egereket állatszobákban helyezték el, szabad hozzáféréssel az élelemhez és a vízhez. Az állatokat a Chugai Pharmaceutical etikai irányelveinek megfelelően kezeltük az állatok gondozására, kezelésére és felmondására vonatkozóan. Ezek az irányelvek megfelelnek a humánus bánásmód általánosan elfogadott nemzetközi kritériumainak, megkímélve az állatokat a felesleges fájdalomtól és szenvedéstől, és biztosítva, hogy az elvégzett kísérletek tényleges tudományos hasznot jelentenek az emberiség számára.

Chemiluminescence assay.

A linolsav-peroxil-csoportokat autoxidációval állítottuk elő, és kemilumineszcenciával detektáltuk Cypridina-luciferin analóg [2-metil-6- (p-metoxi-fenil) -3,7-dihidroimidazo [1,2-a] pirazin-3-on (MCLA) alkalmazásával). ] (22). 10 mM MCLA-t tartalmazó 1 mM linolsav 1-butanolban készült oldatát 10 percig inkubáltuk 37 ° C-on levegő alatt. A kemilumineszcenciát az MCLA gyors reakciója indukálta a linolsav-peroxicsoportok által termelt szingulett oxigénnel. A kemilumineszcencia csillapítását a vegyület hozzáadása után a kemilumineszcencia intenzitás változásaként értékeltük.

Az LDL oxidációja.

Az LDL-t (sűrűség 1,019–1,063 g/ml) szekvenciális ultracentrifugálással izoláltuk nyúl plazmából (23). Az LDL-t (200 μg/ml) és a tesztvegyületet 37 ° C-on 24 órán át inkubáltuk 10 μM CuSO4 vagy 40 μg/ml szójabab-lipoxigenázzal. A lipid-peroxidokat tiobarbitursav-reaktív anyagként (TBARS) határoztuk meg (22). A lebomlási vizsgálatokhoz az LDL-t Na 125I-gyel jelöltük jód-monoklorid eljárással (24). A 125 I-LDL-t 37 ° C-on 24 órán át inkubáltuk 10 μM CuSO4-gyel, és a lebontást úgy végeztük, hogy egér peritoneális makrofágokat inkubáltunk 10 μg/ml LDL-t tartalmazó RPMI 1640 táptalajban 37 ° C-on 5 órán át, majd meghatároztuk a triklór-ecetsavban oldható nem-jodid radioaktivitást.

Diéták és vegyületek beadása.

A magas zsírtartalmú étrendet (1,25% koleszterin) Nishina és mtsai (25) szerint készítettük. Az ebben a cikkben használt étrendeket a Clea Japan készítette, és az étrendben a vegyület jelzett koncentrációját HPLC-vel igazoltuk az alábbiakban leírtak szerint. A C57BL/6J egereket 28 hétig magas zsírtartalmú étrenden tartottuk, amely 0,5% tesztvegyületet vagy cellulózot tartalmaz; Az LDL-receptor knockout egereket 13 hétig vagy 21 hétig tartották az étrenden. A WHHL nyulakat 6 hónapig normál étrenden (CR3) tartották hozzá antioxidánsok nélkül, vagy 1% probukollal vagy 0,2% vagy 0,5% BO-653-mal.

A lipoprotein profil és a vegyület koncentrációjának mérése.

A plazma lipoprotein profilokat a frakciók koleszterin koncentrációiként értékeltük gélpermeációs kromatográfiával (GPC). Tíz mikroliter vért nyertünk egy háti metatarsalis vénából, és gyorsan sóoldattal hígítottuk. Ezután a hígított plazmamintát centrifugálással nyertük, és GPC-vel analizáltuk a lipoprotein profilját, és autoanalizátorral (COBAS FARAII, Hoffmann – La Roche) elemeztük a lipid-összetételt. Az étrendben, a plazmában és a szövetekben lévő koncentrációkat fordított fázisú HPLC-vel határoztuk meg az étrend, a plazma és a szöveti homogenátum minták metanolban oldódó frakciójának.

Az ateroszklerotikus elváltozások és a Xanthoma Score értékelése.

A WHHL nyulak ateroszklerotikus elváltozásának területét az aorta belső felületek zsírrégiójának területeként értékeltük. Az aorta szelepek vagy aorta boltívek fagyott keresztmetszeteit Szudán IV-vel festettük, és hematoxilinnel ellenfestettük. Az ateroszklerotikus elváltozásokat Szudán IV-pozitív régióinak átlagos területeként értékeltük az aorta szelep keresztmetszeteiben (26) vagy az aorta keresztmetszeteiben (négy 6 mm vastag szakasz 1 mm-es időközönként). Az összes területet a SigmaScan Pro szoftver (Jandel Scientific Software) határozta meg, amelyet az aorta belső felületének, aorta szelepének vagy aorta boltozatának fényképeire szkenneltek. A főleg az elülső végtagokban és a szemhéjakban megfigyelt xantómákat pontozással értékelték. A xanthoma pontszámot mind az elülső pontszámok (0 = nincs elváltozás, 1 = enyhe duzzanat, 2 = súlyos duzzanat) és a szemhéj pontszám (0 = nincs elváltozás, 1 = elváltozások) összegeként számítottuk.

Statisztikai analízis.

A statisztikai szignifikanciát a kontrollcsoporttal szemben Dunnett ANOVA módszerével elemeztük.

EREDMÉNYEK

In vitro hatások.

A BO-653-at választottuk optimális vegyületnek, mivel a következő szerkezeti jellemzőkkel rendelkezik (1a. Ábra): (i) benzofuránszerkezet, amely hidrogéndonorként erős aktivitással rendelkezik; (ii) egy anti-oxidáns funkcionális helyet körülvevő di-terc-butil-szerkezet, amely képes hatással lenni az oxidációra még a hidrofób magban is; és (iii) oldalláncok, amelyek képesek modulálni a mobilitást és a hidrofóbitást, fokozva az abszorpciót és az eloszlást, és lehetővé téve a sztereoizomerek kizárását.

Az antioxidáns BO-653 tulajdonságai. a) A BO-653, 2,3-dihidro-5-hidroxi-2,2-dipentil-4,6-di-terc-butil-benzofurán szerkezete, valamint a probukol és a-tokoferol antioxidánsok szerkezete. (b) A BO-653 gátlása a linolsav-peroxicsoportok által kiváltott kemilumineszcencián. A linolsav-peroxil-csoportokat autoxidációval állítottuk elő, és kemilumineszcenciával detektáltuk MCLA alkalmazásával. (c) A BO-653 gátlása a nyúl LDL oxidációján. Az LDL-t és a tesztvegyületet 24 órán át 37 ° C-on inkubáltuk CuSO4-tal vagy szójabab-lipoxigenázzal (LO), és a lipid-peroxidokat TBARS-ként határoztuk meg. (d) A BO-653 gátolja az oxidáció által kiváltott 125 I-LDL lebomlást. A 125 I-LDL-t 37 ° C-on inkubáltuk 24 órán át CuSO4-gyel, és a lebontást egér peritoneális makrofágokkal végzett inkubálással hajtottuk végre. Az összes eredményt háromszoros (b és c) vagy kettős (d) minta átlag ± SD-ként mutatjuk be. ∗, P 2+ vagy lipoxigenáz, amelyekben a BO-653 vizsgálatot hatékonyabbnak találták, mint a probucol vagy az a-tokoferol, különösen a lipoxigenáz oxidációja ellen (1c. Ábra). A BO-653 a makrofágok által az LDL lebomlását is háromszor erősebben gátolta, mint a probucol (1d. Ábra). Ezek az eredmények együttesen azt jelzik, hogy a BO-653 hatékonyan gátolja az LDL oxidációját.

Antiatherogén hatás.

Plazma koleszterin, VLDL + LDL és HDL szintek és LDL oxidálhatóság WHHL nyulakban