Az antioxidáns kofaktor alfa-liponsav szabályozhatja az endogén formaldehid anyagcserét emlősökben

Anastasia V. Shindyapina

1 Genetikai és Biotechnológiai Tanszék, N. I. Vavilov Általános Genetikai Intézet, Orosz Tudományos Akadémia, Moszkva, Oroszország

2 Nukleoproteinek Kémiai és Biokémiai Tanszéke, A. N. Belozersky Fizikai-Kémiai Biológiai Intézet, Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Moszkva, Oroszország

Tatjana V. Komarova

1 Genetikai és Biotechnológiai Tanszék, N. I. Vavilov Általános Genetikai Intézet, Orosz Tudományos Akadémia, Moszkva, Oroszország

2 Nukleoproteinek Kémiai és Biokémiai Tanszéke, A. N. Belozersky Fizikai-Kémiai Biológiai Intézet, Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Moszkva, Oroszország

Jekatyerina V. Sheshukova

1 Genetikai és Biotechnológiai Tanszék, N. I. Vavilov Általános Genetikai Intézet, Orosz Tudományos Akadémia, Moszkva, Oroszország

2 Nukleoproteinek Kémiai és Biokémiai Tanszéke, A. N. Belozersky Fizikai-Kémiai Biológiai Intézet, Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Moszkva, Oroszország

Natalia M. Ershova

1 Genetikai és Biotechnológiai Tanszék, N. I. Vavilov Általános Genetikai Intézet, Orosz Tudományos Akadémia, Moszkva, Oroszország

2 Nukleoproteinek Kémiai és Biokémiai Tanszéke, A. N. Belozersky Fizikai-Kémiai Biológiai Intézet, Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Moszkva, Oroszország

Vadim N. Tashlitsky

3 Kémiai Kar, Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Moszkva, Oroszország

V. V. Kurkin

3 Kémiai Kar, Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Moszkva, Oroszország

Ildar R. Jusupov

3 Kémiai Kar, Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Moszkva, Oroszország

Garik V. Mkrtchyan

2 Nukleoproteinek Kémiai és Biokémiai Tanszéke, A. N. Belozersky Fizikai-Kémiai Biológiai Intézet, Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Moszkva, Oroszország

Murat Y. Shagidulin

4 V. I. Schumakov akadémikus Transzplantológiai és Mesterséges Szövetségi Kutatóközpont, Moszkva, Oroszország

Jurij L. Dorokhov

1 Genetikai és Biotechnológiai Tanszék, N. I. Vavilov Általános Genetikai Intézet, Orosz Tudományos Akadémia, Moszkva, Oroszország

2 Nukleoproteinek Kémiai és Biokémiai Tanszéke, A. N. Belozersky Fizikai-Kémiai Biológiai Intézet, Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Moszkva, Oroszország

Társított adatok

Absztrakt

Bevezetés

Emlősökben a metabolikus rövid láncú alkoholok, például a metanol (MeOH) és az etanol (EtOH) oxidációja az alkohol-dehidrogenáz 1 (ADH1) osztályába tartozó enzimek részvételével történik (Cederbaum, 2012; Wang et al., 2012; Edenberg és Foroud, 2013; Dorokhov et al., 2015). A gyomor-bél mikrobiomjának pektin-metilészterázai (PME) vagy növényi táplálékkal fogyasztott növényi PME által termelt MeOH-t (Dorokhov et al., 2012, 2015; Komarova et al., 2014; Shindyapina et al., 2014) változatlanul átalakítja az ADH1 enzim formaldehiddé (FA) emlős organizmusokban. A MeOH nem az egyetlen metabolikus FA forrása; kialakulhat a kreatininből származó metilamin (a) szemikarbazid-érzékeny amin-oxidáz által közvetített oxidatív dezaminálásának eredményeként is (Charlton és Mack, 1994; Lee és mtsai, 2008) és (b) a kromatinszerkezet átalakulása a metilcsoportok eltávolítása a lizin maradványokból hisztonokban, amelyet lizin-specifikus demetiláz 1 és JmjC domént tartalmazó hiszton demetilázok katalizálnak (Tsukada és mtsai, 2006; Cloos és mtsai, 2008; Hou és Yu, 2010; Walport és mtsai. al., 2012; Liu és mtsai, 2013).

Úgy tűnik, hogy az FA a neurodegeneráció releváns ágense (alább); hangyasavvá történő oxidációja méregtelenítést jelent ebben az összefüggésben. Az FA főként az aldehid-dehidrogenáz 2 (AlDH2) osztályába tartozó enzimek részvételével hangyasavvá alakul (Sládek, 2003; Sophos és Vasiliou, 2003). Az FA oxidációja az ADH5 vagy a glutation-függő χ-ADH FA dehidrogenáz (FDH) enzim részvételével is bekövetkezik (Tulpule et al., 2013). Ugyanakkor ismert, hogy a kataláz (CAT) (Cederbaum és Qureshi, 1982; Deng és Deitrich, 2008) és a citokróm P450 (CYP2E1) (Coon és Koop, 1987; Caro és Cederbaum, 2004; Wallage és Watterson, 2008 ) magas alkoholkoncentráció esetén bekerülnek az alkohol-anyagcsere folyamatába. Fontos megjegyezni, hogy az agy és a máj szöveteiben a MeOH szintjének szabályozása különböző módon történik. Az ADH1 enzim a MeOH legnagyobb részét az emberi májban oxidálja, míg az agysejtekben aktivitása közel nulla (Julià et al., 1987; Galter és mtsai, 2003; Tulpule és Dringen, 2013). Nyilvánvaló, hogy az ADH1 enzim alacsony aktivitása az emberi agysejtekben védekezés mechanizmusaként működik az FA neuronokra gyakorolt káros hatásai ellen (Tulpule és Dringen, 2013).

A FA krónikus expozíciója ismert, hogy akut egészségügyi problémákat okoz (Tang et al., 2009), amelyek az amiloid aggregációval (Chen et al., 2007), a tau fehérje aggregációval és a hiperfoszforilációval kapcsolatosak in vitro és in vivo (ENCODE Project Consortium et al., 2007; Liu és mtsai, 2013; Su és mtsai, 2016). Feltételezték, hogy az FA toxicitása összefügg az életkorral összefüggő idegsejtkárosodás és az Alzheimer-kór patológiájának fő jellemzőivel (Tong et al., 2011, 2013a, b, 2017; Liu et al., 2013). Az Alzheimer-kórban talált magas FA-szint (Tang és mtsai, 2013a, b; Tong és mtsai, 2013a, 2017) fontos szerepet játszhat a β-amiloid (Aβ) aggregációban és az agyi amiloid angiopathiában (Li et al., 2016b).

Így feltételezhető, hogy az ALA képes az emlősök ALDH2 aktivitásának szabályozójaként működni, és ezáltal szabályozni tudja az FA anyagcseréjét. Ennek a feltételezésnek a teszteléséhez megvizsgáltuk az ALA hatását az FA metabolizmusára egerekben. Eredményeink azt mutatták, hogy az ALA képes csökkenteni az exogén és metabolikus MeOH és FA szinteket egerekben. Az FA eliminációjának mechanizmusa magában foglalja az anyagcseréjéért felelős gének (ADH1, ALDH2, CAT, CYP2E1) felfelé történő szabályozását a hippocampusban és a lépben, valamint az ALDH2 megemelkedett enzimatikus aktivitását az egér agyában.

Anyagok és metódusok

Anyagok

A β-nikotinamid-adenin-dinukleotidot, az acetonitrilt (HPLC minőségű) és a Triton X-100-at a PanReac AppliChem, a Halt Protease Inhibitor Cocktail (100X) és 16% metanolmentes formaldehidet vásároltuk a Thermo Fisher Scientific-től, a TriReagent az MRC-től. Az Alda-1-et Dr. A.V. Kurkin (Moszkvai Állami Egyetem, Oroszország). Minden más vegyszer Sigma Aldrich-től (Bécs, Ausztria) származott, ha másképp nem jelöltük.

Állatok és in vivo kezelés

Patkánymáj perfúziós technika

Minden manipulációt steril körülmények között hajtottak végre, figyelembe véve az aszeptikus és antiszeptikus követelményeket. A kísérleti állatok érzéstelenítését úgy hajtottuk végre, hogy a Zoletil 50 oldatot (Virbac Sante Animale, Franciaország) 7,5 mg/testtömeg-kg dózisban injektáltuk a hasüregbe. A szisztémás heparinizálás céljából heparint adtunk a pénisz vénájába 200 egység dózisban. Ezután medián laparotómiát hajtottak végre. Egy speciális kanül (Venflon 1,3 × 45 mm) segítségével a portális vénát (Vena portae) kanüláltuk, és további 150 egység heparint adtunk a portális vénához. Közvetlenül ezután a portális véna subhepatikus ágát ligáltuk. A vérelemek máját oxigénnel (95% O2 és 5% CO2) tartalmazó Krebs-Henseleit pufferrel (118 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2,75 mM CaCl2, 1,19 mM KH2PO4, 1,18 mM MgSO4 és 25 mM NaHCO3, pH 7,4) mossuk. t = 37,8 ° C-on) 500 ml-es térfogatban perisztaltikus pumpával 2,5–4,0 ml/perc/g áramlási sebességet és fiziológiai nyomást

12–15 Hgmm a portális vénában. Recirkuláló perfúziós rendszert alkalmaztunk. A pleurális részben a vena cava szuprahepatikus ágát boncoltuk, és a perfuzátumot eltávolítottuk. A máj perfúziójának minőségét a szerv integritása, a halvány szín egyenletessége és a konzisztencia (az ödéma mértéke) alapján értékelték. A vérelemek májból történő lemosása után máj explantálást hajtottunk végre, és izolált perfúziót hajtottunk végre. MeOH-t (120 mg/kg) és ALA-t (20 mg/kg) adtunk egymás után a felső perfúztartályhoz. A mintákat 15 percenként, egy órán át vettük 2 ml perfuzátummal.

Májenzim elemzés

Az AST, az ALT és az ALP méréseit egy A25 analizátoron (Biosystems, Spanyolország) végeztük a Hospitex Diagnostics (Olaszország) által gyártott kereskedelmi készletekkel a gyártó utasításainak megfelelően. A spektrofotométert minden enzimmérés előtt kalibráltuk.

FA-mérés HPLC-vel

MeOH mérések GC-vel

A MeOH-tartalmat Kristall 5000 (Chromatek, Oroszország) kromatográfon elemeztük a következő körülmények között: Sol-Gel Wax 30 * 0,25 * 0,25 oszlop, a lángionizációs detektor (FID) hőmérsékletét és az injektor hőmérsékletét 220 ° C-ra állítottuk be. A kemence hőmérsékletét 1 percig tartottuk 50 ° C-on, majd 20 ° C/perc-en 100 ° C-ig (1 percig tartva) emeltük, majd 20 ° C/min. A nitrogén, a hidrogén és a levegő áramlása 30, 40, illetve 400 ml/perc volt. A minták injektálási térfogata 1 μl volt.

qRT-PCR

Az RNS-koncentrációkat Nanodrop ND-1000 spektrofotométerrel (Isogen Life Sciences) határoztuk meg. Valamennyi RNS minta 260/280-as abszorbanciaaránya 1,9 és 2,1 között volt.

ALDH2 enzimatikus aktivitás mérése egér agyban

Az egereknek ALA-t (20 mg/kg) adtak egyidejűleg 4-MP-vel (10 mg/kg), és 90 perccel később a mitokondriális és a citoplazmatikus fehérjék agyfrakcióit elválasztották az előzőekben leírtak szerint (Bunik et al., 2008 ). Az ALDH2 vizsgálatot 200 μl-ben hajtottuk végre, amely 50 mM nátrium-pirofoszfát-puffert (pH = 8,1), 0,1 mM NAD +, 50 mM FA-t és 20 μl agyi mitokondriális frakciót tartalmazott. Az ALDH2-t és a háttérreakciókat (FA nélkül) párhuzamosan, 20 percig, 340 nm-en rögzítettük a fekete lemezeken (25 ° C). Az ALDH2 aktivitását a Pierce BCA Protein Assay készlettel mért teljes fehérjetartalomra (mg) normalizáltuk a gyártó protokollja szerint.

GSH mérés az egér agyában

A GSH-t 5,5′-ditio-bisz (2-nitro-benzoesav) (DTNB) alkalmazásával mértük. A citoplazmatikus sejtfrakciókat (80 μl) összekevertük 30 μl 10 mM DTNB-vel és 0,2 M Na2HPO4-gyel 300 μl végtérfogatig, és 15 perc múlva 412 nm-en rögzítettük az abszorbanciát. A GSH koncentrációit a teljes fehérjetartalomra (mg) normalizáltuk Pierce BCA Protein Assay készlettel a gyártó protokollja szerint.

A mikrorakatok szintézise

A B3 mikroarray szintetizátort (CustomArray, USA) 40 nukleotid hosszú oligonukleotid szonda szintéziséhez alkalmaztuk CustomArray ECD 4X2K/12K tárgylemezeken. A szintézist a gyártó ajánlásai szerint hajtották végre. Minden chipen elhelyeztek összesen 2020 egérgén-transzkriptumra specifikus, összesen 6 020 egyedi oligonukleotid-próba két ismétlését. A chip tervezését a Layout Designer szoftverrel (CustomArray, USA) végeztük. Az egyedi mikrochiphez az Illumina HT 12 v4 platform eredeti oligonukleotid szekvenciáit használtuk.

Könyvtári előkészítés és hibridizáció

Komplett teljes transzkriptóm-amplifikáció A reverz transzkripcióhoz és a könyvtár amplifikálásához a WTA2 kitet (Sigma) használtuk. A gyártó protokollját úgy módosítottuk, hogy az amplifikációs reakcióhoz biotinilezett dUTP-t tartalmazó dNTP-keveréket adtunk, aminek eredményeként a dTTP/biotin-dUTP végső aránya 5/1 volt. A microarray hibridizációt a CustomArray ElectraSense ™ hibridizációs és detektálási protokoll szerint hajtottuk végre. A hibridizációs keverék 2,5 μg címkézett DNS-könyvtárat, 6X SSPE-t, 0,05% Tween-20-at, 20 mM EDTA-t, 5x Denhardt-oldatot, 100 ng/μl ultrahangos borjú thymus gDNS-t, 0,05% SDS-t tartalmazott. A hibridizációs keveréket chip-kel inkubáltuk egy éjszakán át 50 ° C-on. A hibridizációs hatékonyságot elektrokémiai úton detektáltuk a CustomArray ElectraSense ™ Detection Kit és az ElectraSense ™ 4X2K/12K Reader segítségével.

Statisztikai analízis

A P-értékeket a Mann – Whitney teszttel, vagy a Student t-teszttel párosítva R (R: The R Project for Statisztikai Számítástechnika) segítségével számoltuk ki. A dobozdobozok mezői a mediánt jelentik 25% és 75% percentilisekkel, az alsó bajusz a minimális értéket, a felső bajusz a maximális értéket, a szélső értékeket pedig foltként ábrázolják. Az oszlopdiagram magasságai a szórás hibasávjai. A statisztikai elemzéseket R-ben programoztuk az Rstudio soft segítségével.

Eredmények

Az ALA hatása az egerek vér MeOH- és FA-tartalmára

Kísérleti megközelítést alkalmaztunk, amelyben az egereket ALA-val együtt adtuk 4 MP-vel, és kimutattuk, hogy az ALA (20 mg/kg) és a 4-MP (10 mg/kg) beadása a MeOH statisztikailag szignifikáns csökkenéséhez vezetett ( 1A) 1A) és FA (1B ábra) 1B) tartalom a vérben. Az ALDH2 aktivátorának, az Alda-1-nek (Chen és mtsai., 2008; Perez-Miller és mtsai., 2010) beadása szintén csökkentette az egér vér FA-értékét (ábra (1C ábra). 1C). Az eredmények kérdéseket vetnek fel az ALA MeOH és FA metabolizmusra gyakorolt hatásmechanizmusával kapcsolatban. Mivel az ALA antioxidáns tulajdonságokkal rendelkező multifunkcionális természetes anyag (Fujita és mtsai, 2008; Kamarudin és mtsai, 2014; Shi és mtsai, 2016), az aszkorbinsavat és a tokoferolt, ismert természetes antioxidánsokat (Halliwell, 2006) teszteltük képesek befolyásolni a MeOH és az FA metabolizmusát egerekben. Meglepő módon nem volt különbség a MeOH és FA szérumszintjeiben az aszkorbinsavval (200 mg/kg) vagy a tokoferollal (100 mg/kg) kezelt egerek és a kontrollcsoportok között (S1. Ábra).