Az apai túlsúly vagy elhízás hatása az IVF-kezelés eredményére és a lehetséges mechanizmusokra

Qingling Yang

1 Reproduktív Orvosi Központ, a kínai Zhengzhou Egyetem első kórháza

Feifei Zhao

1 Reproduktív Orvosi Központ, a kínai Zhengzhou Egyetem első kórháza

Linli Hu

1 Reproduktív Orvosi Központ, a kínai Zhengzhou Egyetem első kórháza

Rui Bai

1 Reproduktív Orvosi Központ, a kínai Zhengzhou Egyetem első kórháza

Nan Zhang

1 Reproduktív Orvosi Központ, a kínai Zhengzhou Egyetem első kapcsolt kórháza

Guidong Yao

1 Reproduktív Orvosi Központ, a kínai Zhengzhou Egyetem első kapcsolt kórháza

Yingpu Sun

1 Reproduktív Orvosi Központ, a kínai Zhengzhou Egyetem első kórháza

Társított adatok

Absztrakt

A leukocita telomer hossza (LTL) rövidebb az elhízottaknál, mint a normál testsúlyú emberek. Nem ismert azonban, hogy a spermium telomer hossza (STL) összefügg-e az elhízással. A vizsgálat célja a férfiak testtömeg-indexének (BMI) az STL-re, az embrió minőségére és a klinikai eredményekre gyakorolt hatásának értékelése volt IVF-ben áteső pároknál. Összesen 651 pár került toborzásra, köztük 345 normál BMI-s és 306 túlsúlyos BMI-s férfi (normál BMI-csoport: 20–25 kg/m 2; túlsúlyos BMI-csoport:> 28 kg/m 2). Megállapítottuk, hogy azoknál a pároknál, akiknél a férfi BMI meghaladja a 28 kg/m 2 -et, szignifikánsan alacsonyabb a megtermékenyítési ráta, a jó minőségű embrió arány és a klinikai terhesség aránya a normális BMI-társaikhoz képest. A túlsúlyos BMI csoportban az átlagos STL szintén szignifikánsan rövidebb volt, mint a normál BMI csoporté. Az eredmények azt is kimutatták, hogy a magasabb BMI-vel rendelkező egyének ROS (reaktív oxigén fajok) tartalma és a spermium DNS fragmentációs sebessége magasabb volt, mint a normál BMI egyedekben. A mitokondriális aktivitás a túlsúlyos BMI csoportban is alacsonyabb volt, mint a normál BMI csoportban. Ez az első jelentés, amely megállapítja, hogy a túlsúlyos/elhízott férfiaknál az STL rövidebb, ami az IVF-ciklusokban tapasztalható gyengébb kezelési eredményeiknek tudható be.

A telomerek nagymértékben ismétlődő hexamerikus (TTAGGG) nukleotidszekvenciák a 14. kromoszóma végén. A kötött fehérjékkel együtt a telomerek megvédik a kromoszóma végeket attól, hogy felismerjék őket kettős szálú törésekként, amelyek javítást igényelnek. Egy tanulmány megállapította, hogy a spermában a hosszú telomerek rövidülése hozzájárulhat a normális embrionális hasadás megtermékenyítéséhez szükséges kritikus telomer hosszúság fenntartásához 15. Egy másik tanulmány kimutatta, hogy a spermával megtermékenyített vad típusú petesejtek a telomeráz-null egerek későbbi generációinak rövid telomerjeivel (TR -/-) megnövekedett embrió-töredezettséghez, alacsony embrióminőséghez és apoptózishoz vezettek 16. Legfrissebb tanulmányunk azt is kimutatta, hogy a spermium telomer hossza (STL) pozitív kapcsolatban áll az embrió minőségével az IVF-ben 17 .

Eredmények

A beteg alapvető jellemzői és az IVF-ciklus eredményei

(a) Normális BMI-vel (20–25 kg/m 2; N = 345) és túlsúlyos (> 28 kg/m 2; N = 306) férfival rendelkező párok megtermékenyítési arányainak összehasonlítása (khi-négyzet teszt). (b) A 3. nap kiváló minőségű embrió arányának összehasonlítása normál BMI-vel rendelkező férfiakkal (N = 345) és túlsúlyos BMI-vel rendelkező férfiakkal (N = 306, khi-négyzet teszt). (c) A normál BMI-vel rendelkező férfiak (N = 345) és a túlsúlyos BMI-vel rendelkező férfiak (N = 306, khi-négyzet teszt) klinikai terhességi arányának összehasonlítása.

Asztal 1

Paraméter Férfi BMI (kg/m 2)20–25 (N = 345)> 28 (N = 306) P

Férfi életkor (év)	30,4 ± 4,0	30,5 ± 3,9	0,91
Nő életkora (év)	29,7 ± 4,9	29,9 ± 3,9	0,48
Női BMI (kg/m 2)	22,4 ± 3,1	22,3 ± 3,6	0,26
Női bazális FSH (NE/L)	7,4 ± 2,1	6,9 ± 2,5	0.51
Gn időtartama (nap)	11,2 ± 1,9	11,0 ± 1,9	0,13
Gn dózis (NE)	2 034,8 ± 822,6	2 028,5 ± 817,7	0,92
Letöltött petesejtek (n)	11,3 ± 5,9	11,2 ± 6,5	0,63
Átült embriók (n)	2,0 ± 0,3	1,9 ± 0,5	0,32

BMI, testtömeg-index; FSH, tüszőszerkesztő hormon; az értékeket átlag ± szórásként mutatjuk be; A diákok t tesztjét használták a két csoport adatainak összehasonlítására.

2. táblázat

Paraméter Férfi BMI (kg/m 2)20–25 (N = 345)> 28 (N = 306) P

Spermium koncentráció (millió/ml)	59,9 ± 54,6	59,5 ± 51,8	0,83
Sperma térfogata (ml)	3,08 ± 1,69	3,79 ± 1,71	28 kg/m 2 (N = 306)
Kiigazítatlan	0,75 (0,64–0,88)
Kiigazítatlan	P 16, 17, 25. Mivel az elhízott férfiaknál általában rövidebb az LTL (a leukocita telomer hossza), minden beteg esetében megvizsgáltuk a relatív STL-t. Amikor összehasonlítottuk a két csoport STL-jeit, azt találtuk, hogy az átlagos relatív STL szignifikánsan rövidebb volt a túlsúlyos BMI csoportban, mint a normál BMI csoport (2. ábra). Korábbi tanulmányok azt is kimutatták, hogy az STL pozitív kapcsolatban áll az életkorral.

A relatív STL (T/S arány) összehasonlítása normál BMI-vel (20–25 kg/m 2; N = 345) és túlsúlyos (> 28 kg/m 2; N = 306) férfiaknál (Student's t teszt; szórások).

Fokozott oxidatív stressz, csökkent DNS-integritás és mitokondriális aktivitás a túlsúlyos/elhízott betegek spermájában

A túlsúlyos BMI-csoportból gyűjtött spermában az oxidatív stressz szintjének értékeléséhez az NBT-módszert alkalmaztuk a ROS-tartalom kimutatására. Összegyűjtöttük a spermát további 104 betegből, köztük 54 28 kg/m 2-nél nagyobb BMI-t és 50 normál BMI-s beteget. A túlsúlyos BMI-vel rendelkező férfiak szérumában az formazan termelődése szignifikánsan magasabb volt, mint a normál BMI-vel rendelkezőknél (1a. Kiegészítő ábra; P 26. Az érintett mechanizmusokat azonban rosszul értjük. Az elmúlt két évtizedben az ART népszerűbbé vált és segített sok meddő párnak saját gyermekében. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a női elhízás káros hatással van a termékenységre és az IVF kezelésének eredményeire; azonban viszonylag kevés tanulmány foglalkozott a férfi túlsúly/elhízás IVF során gyakorolt hatásával.

Egyre több tanulmány foglalkozik a telomer hosszának és a telomeráz rendszernek a reprodukcióban betöltött szerepének vizsgálatával. Telomeráz-null egerekben a vad típusú petesejtek spermával történő megtermékenyítése a késői generációk rövid telomerjeivel megnövekedett embrió-töredezettséget, alacsony embrió-minőséget és apoptózist eredményezett 16. Egy emberen végzett vizsgálat kimutatta, hogy a gomoly sejtekben a telomer hossza megjósolhatja a rendkívül kompetens és jó minőségű petesejteket 39. Egy másik tanulmány kimutatta, hogy a telomeráz jobban megjósolta az IVF-et követő terhességi eredményeket, mint a telomer 40-es hossza, és nemrégiben készült tanulmányunk azt is megállapította, hogy az STL pozitív kapcsolatban állt a korai embrionális fejlődéssel az IVF-ciklusokban 17. Ezenkívül számos tanulmány beszámolt a túlsúly/elhízás 20, 21, 22, 23 litára gyakorolt hatásáról. Megmértük az egyes betegek STL-jét; így ez a tanulmány elsőként értékeli, hogy a túlsúly/elhízás hogyan befolyásolja a relatív telomer hosszát az emberi spermában. Érdekes módon azt találtuk, hogy az átlagos STL szignifikánsan alacsonyabb volt a magasabb BMI-vel rendelkező férfiaknál a kontrollokhoz képest.

Összefoglalva azt tapasztaltuk, hogy az STL szorosan összefügg a BMI-vel, és hogy a magasabb BMI a rövidebb STL-ekkel, a mitokondriális aktivitás csökkenésével és a megnövekedett DNS-fragmentációval jár, ami a megnövekedett ROS-tartalom következménye lehet. Mindezek a változások alacsonyabb megtermékenyítési arányhoz, embrióminőséghez és klinikai terhességi rátához vezethetnek az IVF-ben szenvedő betegeknél. Ezek az eredmények együttesen segítenek megérteni az apai túlsúly/elhízás IVF-kezelésre gyakorolt hatásait. Javasoljuk, hogy az elhízás növeli a gyulladást és az oxidatív stresszt, ami a sperma telomer hosszának megrövidülését eredményezheti, ami végső soron rossz embrióminőséghez és csökkent terhességi rátához vezet. Az érintett ok-okozati mechanizmusok meghatározásához azonban további vizsgálatokra van szükség.

Kísérleti módszerek

A beteg kiválasztása

Mintánk 306 túlsúlyos hímből (> 28 kg/m 2) és 345 normális testsúlyú (20–25 kg/m 2) férfiból állt. Valamennyi beteg reprodukciós orvosi központunkban kezelték az első friss IVF ciklusokat. Valamennyi betegnél normális kromoszóma-kariotípus volt. Egyik férfinak sem volt Y-kromoszóma mikrotörlése vagy a spermatogén károsodás bármely nyilvánvaló oka. Az összes nő FSH-szintje 10 NE/L alatt volt. A nőket kizárták, ha a vizsgálat előtt jelen lévő petefészek-funkció károsodott, például műtét vagy káros gyógyszerek alkalmazása. Az ezen betegek STL-jének értékelése után újabb 104 beteg spermáját gyűjtöttük össze, köztük 54 beteget, akiknek BMI-értéke> 28 kg/m 2, és 50, életkornak megfelelő beteget, normál BMI-vel, hogy értékeljük a BMI hatását az oxidatív stresszre, a mitokondriális aktivitásra és A DNS-fragmentáció sebessége a spermában. Ezt a tanulmányt a Zhengzhou Egyetem Első Társult Kórházának Etikai Bizottsága hagyta jóvá, és az összes résztvevő tájékozott beleegyezést kapott az adatok és a sperma felhasználásáról. Végül az ebben a vizsgálatban alkalmazott összes módszert a jóváhagyott irányelveknek megfelelően hajtották végre.

IVF eljárás

A spermaelemzést a WHO protokoll (2010) szerint végeztük a petesejtek visszaszerzésének napján (0. nap). Az inszeminációt cumulus – oocita komplexek (COC) sűrűséggradiens centrifugálással kiválasztott spermiumokkal történő elhelyezésével végeztük. A gomoly sejteket 4 óra múlva eltávolítottuk. A megtermékenyítést 16–18 órás megtermékenyítés után igazolták. Minden egyes 3. nap embriót kiértékeltünk, és 1-től 5-ig osztályoztuk őket. A kiváló minőségű embriók közé tartoztak az I. és a II. Fokozatú embriók, amelyek meghatározása szerint hat-nyolc szimmetrikus, azonos méretű blasztomer volt fragmentáció nélkül (I. fokozat) vagy kevesebb, mint 10 % töredezettség (II. fokozat).

Telomer hosszmérés

Az átlagos STL-t genomi DNS-ben határoztuk meg, minden beteg számára valós idejű PCR-rel. A PCR reakciókat a 7500 Real-Time PCR rendszer (Applied Biosystems, USA) segítségével hajtottuk végre. A telomer primerek, kontroll gének primerek (36B4, egypéldányos gén) és a PCR beállítások megegyeztek a 17. előtt leírtakkal. Mindegyik mintát három példányban hajtottuk végre, és az egyes reakciókhoz ismert mennyiségű referencia-DNS sorozatbeli hígításával standard görbét hoztunk létre. A telomer és az egy (T/S) másolat arányát használtuk a relatív telomer hosszúság kiszámításához. A laboratóriumi alkalmazottak, akik vakok voltak az eset-kontroll státuszra és az eredményértékelésre, elvégezték az összes mérést.

ROS termelési vizsgálat

Szabványosított protokollt alkalmaztunk fotometrikus nitrokék-tetrazólium (NBT) vizsgálat elvégzésére a szeminális ROS-termelés mérésére a formazan-termelés révén 53. Miután a spermát 5 percig foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) mossuk 300 g-nál 5 percig, a spermiumokat 200 µl PBS-ben szuszpendáltuk. Ezután 100 μl 0,1% NBT-t (Sigma-Aldrich, USA) adunk hozzá és inkubáljuk 37 ° C-on 45 percig. A spermiumokat ezután kétszer PBS-ben mostuk 500 g-nál 5 percig. Pontosan 60 μl DMSO-t (Sigma-Aldrich) és 2 M KOH-ot használtunk az intracelluláris formazán termék szolubilizálására. A kapott színreakciót mikrolemez-olvasóval mértük 630 nm-en (BIO-RAD, Finnország). A ROS termelést mikro gramm formazánban fejeztük ki 107 spermiumban. A DMSO-ban oldott formazán szubsztrát ismert koncentrációiból standard görbét kaptunk.

Mitokondriális aktivitás vizsgálata

A spermium mitokondriális aktivitását a Hrudka 54 által leírt módszerrel detektáltuk. Röviden, a spermát 1: 3 arányban PBS-ben hígítottuk 1 mg/ml 3, 3′-diaminobenzidinnel (DAB) a sperma cseppfolyósítása után, majd inkubátorba helyeztük 1 órán át 37 ° C-on. 10 μl-es kenetet adtunk a tárgylemezre. Ezután a levegőn szárított tárgylemezt 10% -os formaldehid alkalmazásával 10 percig rögzítettük. Minden mintához pontosan 500 spermiumot számláltunk Olympus BX51 mikroszkóppal. A spermiumokat a középső rész foltos hossza alapján osztályozták. Az I – III. Osztály a festett középdarab 100% -ának, több mint 50% -ának, és kevesebb, mint 50% -ának felelt meg. A IV. Osztály nem volt foltos a középső részen.

DNS-fragmentáció meghatározása

Spermium-kromatin-diszperziós (SCD) készletet használtak a DNS-fragmentáció sebességének kimutatására a spermában a gyártó ajánlásai szerint (BRED, Life Science Technology Inc., Shenzhen, Kína). Röviden: 60 μl hígított nyers spermamintát adtunk egy Eppendorf-csőbe, és teljesen összekevertük 80 ° C-on 20 percig melegített olvasztott agarózzal. Pontosan 30 μl keveréket adunk egy előre bevont tárgylemezhez, és a tárgylemezt 5 percig 4 ° C-on hűtjük. A tárgylemezt 7 percig az A, a B oldatban 25 percig inkubáltuk, majd 5 percig desztillált vízben mostuk. Dehidratáló kezelés után etanol-koncentrációk sorozatával (70–90–100%) a tárgylemezt Wright-oldat és PBS keverékében inkubáltuk 16 percig. A tárgylemezt ezután mossuk és levegőn szárítjuk. Minden mintához pontosan 500 spermiumot számláltunk Olympus BX51 mikroszkóppal. A nagy vagy közepes méretű glóriákkal rendelkező spermiummagokat nem töredezettnek tekintették, míg a kis magú vagy halo nélküli spermiumokat fragmentált DNS-nek tekintették.

statisztikai elemzések

A demográfiai adatokat a két csoport átlagának ± SD-ként mutatjuk be. A normális eloszlásoktól való eltérések vizsgálatához a Kolmogorov – Smirnov-normalitási tesztet használtuk. A Student t tesztjét a normálisan elosztott adatok elemzésére, a Mann-Whitney U tesztet a nem parametrikus adatok elemzésére használták. A kvalitatív adatok elemzéséhez khi-négyzet tesztet alkalmaztunk. Az STL és a páciens BMI közötti kapcsolat értékeléséhez általános lineáris regressziós modellt alkalmaztunk. Többváltozós logisztikus regresszióval vizsgálták, hogy a férfi BMI befolyásolja-e a klinikai terhességet a női BMI, a női életkor, az átvitt embriók száma, az alap FSH szintje, a férfi életkor és a spermiumok száma alapján a túlsúlyos BMI csoportban. Az összes statisztikai elemzést az SPSS szoftver 16.0 verziójával (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) végeztük. P értéke (126K, pdf)

Köszönetnyilvánítás

Ezúton szeretnénk köszönetet mondani minden betegnek, aki részt vett ebben a vizsgálatban. Ezt a munkát a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (31271605 és 31471404 támogatás a Yingpu Sun számára), a Nemzeti Tudományos Kínai Fiatal Tudósok Alapítványának (31401274 támogatás Qingling Yang számára) és az Első Társult Kórház Ifjúsági Innovációs Alapjának támogatásával finanszírozták. Zhengzhou Egyetem (Qingling Yanghoz).