Az elektro-akupunktúra genomszintű szabályozása az idegeken statisztika5 veszteség okozta elhízott egerek

Egyenlő mértékben járult hozzá ehhez a munkához: Shu-Ping Fu, Hao Hong

idegi

Szerepek vizsgálata, vizualizáció, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

¶ ‡ Ezek a szerzők első szerzői ennek a munkának.

Akupunktúra és orvostudományi kutatások laboratóriuma, Oktatási Minisztérium, Nanjing Kínai Orvostudományi Egyetem, Nanjing, Kína

Egyformán járult hozzá ehhez a munkához: Shu-Ping Fu, Hao Hong

Szerepek Projekt adminisztráció, Írás - eredeti vázlat, Írás - áttekintés és szerkesztés

¶ ‡ Ezek a szerzők első szerzői ennek a munkának.

Akupunktúra és orvostudományi kutatások laboratóriuma, Oktatási Minisztérium, Nanjing Kínai Orvostudományi Egyetem, Nanjing, Kína

Akupunktúra és orvostudományi kutatások laboratóriuma, Oktatási Minisztérium, Nanjing Kínai Orvostudományi Egyetem, Nanjing, Kína

Szerepek Az adatok kezelése

Tartozék Informatikai Iskola, Nanjing Kínai Orvostudományi Egyetem, Nanjing, Kína

Szerepek Az adatok kezelése

Akupunktúra és orvostudományi kutatások laboratóriuma, Oktatási Minisztérium, Nanjing Kínai Orvostudományi Egyetem, Nanjing, Kína

Akupunktúra és orvostudományi kutatások laboratóriuma, Oktatási Minisztérium, Nanjing Kínai Orvostudományi Egyetem, Nanjing, Kína

Akupunktúra és orvostudományi kutatások laboratóriuma, Oktatási Minisztérium, Nanjing Kínai Orvostudományi Egyetem, Nanjing, Kína

Szerepek Projekt adminisztráció

Akupunktúra és orvostudományi kutatások laboratóriuma, Oktatási Minisztérium, Nanjing Kínai Orvostudományi Egyetem, Nanjing, Kína

Szerepek Projekt adminisztráció

Akupunktúra és orvostudományi kutatások laboratóriuma, Oktatási Minisztérium, Nanjing Kínai Orvostudományi Egyetem, Nanjing, Kína

Szerepek Projekt adminisztráció

Akupunktúra és orvostudományi kutatások laboratóriuma, Oktatási Minisztérium, Nanjing Kínai Orvostudományi Egyetem, Nanjing, Kína

Genetikai és Élettani Laboratórium, Nemzeti Diabétesz, Emésztési és Vesebetegségek Intézete, Nemzeti Egészségügyi Intézetek, Bethesda, MD, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek konceptualizáció, finanszírozás megszerzése, felügyelet, írás - áttekintés és szerkesztés

Társulási Regeneratív Orvostudományi Kutatóközpont, Nyugat-Kínai Kórház, Szecsuani Egyetem, Csengdu, Szecsuán, Kína

  • Shu-Ping Fu,
  • Hao Hong,
  • Sheng-Feng Lu,
  • Chen-Jun Hu,
  • Hou-Xi Xu,
  • Qian Li,
  • Mei-Ling Yu,
  • Chen Ou,
  • Jian-Zhong Meng,
  • Tian-Lin Wang

Ábrák

Absztrakt

Az akupunktúra a hírek szerint hatékony az elhízással kapcsolatos betegségek kezelésében, de mechanizmusa még mindig nem világos. Ennek a mechanizmusnak a vizsgálatához elektroakupunktúrát (EA) alkalmaztunk az elhízás egérmodelljében, és RNS-seq-t használtunk a molekuláris következmények azonosítására. A STAT5 transzkripciós faktor törlése az idegsejtekből (Stat5NKO) elhízáshoz vezetett. Az akupunktúra viszont csökkentette a testtömeget és az epididymális fehér zsírszövet (Epi-WAT) és a testtömeg arányát, emellett csökkentette a glükóz, triglicerid és koleszterin plazmakoncentrációját. Ezenkívül az EA növelte a Stat5NKO elhízott egerek hidegállóképességét. Az EA megfordította a megváltozott génexpressziót a hipotalamuszban és az Epi-WAT-ban, különösen a Stat5NKO elhízott egerek hipotalamuszában. Ez a tanulmány első alkalommal nyújt betekintést az elhízás genomikus hálózataiba és azok elektro-akupunktúrás modulációjába, amely viszont feltárja azokat a lehetséges mechanizmusokat, amelyek megmagyarázzák az akupunktúra okozta súlycsökkenést.

Idézet: Fu S-P, Hong H, Lu S-F, Hu C-J, Xu H-X, Li Q és mtsai. (2017) Az elektro-akupunktúra genomszintű szabályozása az idegi Stat5-veszteség okozta elhízott egereken. PLoS ONE 12 (8): e0181948. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0181948

Szerkesztő: Johannes Fleckenstein, Berni Egyetem, SVÁJC

Fogadott: 2016. október 27 .; Elfogadott: 2017. július 10 .; Közzétett: 2017. augusztus 14

Ez egy nyílt hozzáférésű cikk, minden szerzői jogtól mentes, és bárki szabadon reprodukálhatja, terjesztheti, továbbíthatja, módosíthatja, továbbépítheti vagy más módon felhasználhatja bármilyen törvényes célra. A mű a Creative Commons CC0 közkincs dedikációja alatt érhető el.

Adatok elérhetősége: A nyers RNS-seq adatokat az NCBI GEO adatbázisába raktuk le GSE100599 csatlakozási szám alatt.

Finanszírozás: Ezt a munkát a Kínai Jiangsu tartomány Természettudományi Alapítványának (BK20130956 sz.) Nemzeti Kínai Természettudományi Alapítványának támogatása (81574063, 81403479, 81273838) támogatta.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Az elhízást a túlzott energiafogyasztásból és az elégtelen energiafelhasználásból eredő zsírfelhalmozódás jellemzi, ami a trigliceridek rendellenes, túlzott mértékű raktározásához vezet a zsírszövetben. A 2-es típusú cukorbetegség, a szív- és érrendszeri betegségek, a magas vérnyomás, a rák, valamint a megnövekedett morbiditási és halálozási ráta egyik legmagasabb kockázati tényezőjének tekinthető [1–4]. Az elhízási járvány négy évtizede növekszik, és az elhízottak száma 2030-ra a becslések szerint eléri az 1,12 milliárdot [5,6]. Azonban a jelenlegi elhízás elleni gyógyszerek és terápiák többségével nem sikerült megfelelő súlykontrollt elérni a betegeknél olyan mellékhatások miatt, mint hangulatváltozások, öngyilkossági gondolatok, valamint gyomor-bélrendszeri és kardiovaszkuláris szövődmények [7].

Az emberi elhízás genetikai kutatásai azt mutatják, hogy az elhízás ritka monogén formáiban az összes mutáció a központi idegrendszerben (CNS) rejlik, amely szabályozza a test energiaháztartását [17,18]. A STAT5 a jelátalakítók és a transzkripciós aktivátorok (STAT) családjának egyik legelvetemültebb tagja; nagymértékben kifejeződik a hipotalamusz neuronjainak különálló populációiban [19]. A STAT5-ről az adipogenezis és az elhízás létfontosságú tényezőként számoltak be. Az adipogenezis folyamata során tirozin helyén foszforilálódik, majd a sejtmagba transzlokálódik, hogy aktiválja a downstream génexpressziókat [20,21]. Az alkotmányosan aktív STAT5 helyettesítheti a növekedési hormont a preadipocyták adipogenezisének elősegítésében, de anti-sense oligonukleotidjai csillapíthatják ezt a hatást [22,23]. Korábbi in vivo kutatásaink azt találták, hogy mind a hím, mind a nőstény mutáns egerek, akiknek a központi idegrendszerben lévő Stat5a/b lókusai törlődtek (Stat5NKO), súlyos elhízás alakult ki, hyperphagia, hyperleptinemia, károsodott hidegre adott hőreakció és inzulinrezisztencia kíséretében [24 ]. De a központi STAT5 jelátvitel hogyan szabályozza az étvágyat, a termogenezist, valamint a perifériás lipidprofilt és az adipogenezist, továbbra sem tisztázott.

A korábbi kutatási eredmények nyomán ebben a tanulmányban feltártuk a Stat5 központi szerepét az elhízás elleni akupunktúrás kezelésben. Először akupunktúrás kezelést alkalmaztunk Stat5NKO elhízott egereken, ST36 és ST44 akupunktumokon, hogy értékeljük az akupunktúra hatékonyságát. Másodszor RNS-szekvenálást (RNS-seq) alkalmaztunk gén expressziós profilok előállítására a fehér zsírszövetben és a Stat5NKO elhízott egerek hipotalamuszában akupunktúrás vagy akupunktúrás kezeléssel, hogy feltárjuk ezekben az egerekben a génexpresszió jellemzőit, és az akupunktúra következtében differenciáltan expresszált gének (DEG). Adataink arra utalnak, hogy a központi idegrendszeri STAT5 különböző szerepet játszik a hipotalamuszban és a fehér zsírszövetben a génátírási tevékenység során, és hogy az akupunktúra nagy mennyiségű DEG-t szabályozhat normális expressziós szintjük felé, különösen a hipotalamuszban. Így az akupunktúra súlycsökkentő hatása annak funkcionális génszabályozó mechanizmusainak tulajdonítható.

Anyagok és metódusok

Állatok és csoportosítás

Közép specifikus Stat5-deletált egereket (Stat5NKO egereket) állítottunk elő az előzőekben leírtak szerint (Yongzhi Cui; 2004). Röviden kereszteztük azokat az egereket, amelyek a Nestin promoter (Nestin-Cre) által expresszált Cre rekombinázt expresszálták. Dr. Hennighausen (NIH, USA). A Stat5fl/fl és Stat5NKO egereket 23 ± 1 ° C-on tartottuk 12 órás világos/sötét ciklusban, szabad hozzáféréssel a vízhez és a chow ételekhez. Western blot-t használtunk a Stat5NKO egerek deléciós hatékonyságának megerősítésére (S1 ábra). A 12 hetes Stat5NKO egereket, amelyek testtömege 20% -kal nehezebb, mint a Stat5fl/fl egerek, elhízott egereknek szelektáltuk és Stat5NKO csoportba, Stat5NKO + EA csoportba osztottuk, ugyanazokat a hetes Stat5fl/fl egereket Stat5fl/fl-be osztottuk. csoport és Stat5fl/fl + EA csoport, mindegyik csoportnak 10 egere van. A testtömeg és az élelmiszer-fogyasztás minden csoportban hetente egyszer került rögzítésre. Ezt a vizsgálatot a Nanjing Kínai Orvostudományi Egyetem Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá, és minden eljárást az Országos Egészségügyi Állattenyésztési és Felhasználási Intézet iránymutatásainak megfelelően hajtottak végre.

EA beavatkozás

Az egereket nagy dózisú pentobarbiton intravénás injekcióival eutanizálták. Az egerek lapockaterületén elhelyezkedő hipotalamust és zsírszövetet, beleértve az epididymis fehér zsírszövetet (Epi-WAT), az inguinalis fehér zsírszövetet (Ing-WAT) és a barna zsírszövetet (BAT), boncoltuk, lemértük és azonnal felpattintottuk - folyékony N2-ben lefagyasztva és -80 ° C-on tárolva további elemzés céljából.

A plazma triglicerid, koleszterin, LDL, leptin és glükózszint kimutatása

A keringő triglicerid (TG), az összkoleszterin (TC), az alacsony sűrűségű lipoprotein (LDL) (F001-1 a TG, F002-1 a koleszterin, A113-1 az LDL; Jiancheng Biotechnológiai Intézet) és a leptin (CRYSTAL) koncentrációja CHEMINC, # 90030) ELISA módszerrel detektáltuk a gyártó ajánlásai szerint. 40 μl standardot vagy egér szérumot adtunk egy 96 lyukú bevonattal ellátott lemezre 10 μl biotinnal jelzett antitesttel, és 30 percig 37 ° C-on inkubáltuk. Öt mosás után a HRP konjugátum reagenst további 60 percig keverjük 37 ° C-on. Ezután a mintákat kromogén oldatokkal inkubáltuk 15 percig 37 ° C-on. Az OD értékeket 450 nm-en detektáltuk a Multiskan FC (Thermo Scientific, USA) alkalmazásával a stop oldat hozzáadása után. A TG, TC, LDL és leptin szinteket standard görbével számszerűsítettük. A glükóz koncentrációját a plazmában glükométerrel (Johnson & Johnson Biological Devices, Kína) és glükóz tesztcsíkokkal (One Touch Utra, Lot: 3836186) mértük.

Szövettani elemzés

A szöveteket 4% paraformaldehidben rögzítettük és paraffinba ágyazottuk. Haematoxilin- és eozinfestést (H&E festés) a 6 μm-es Epi-WAT metszeteken korábban leírtak szerint végeztünk. Az elemzéshez szükséges képeket fénymikroszkóppal (Nikon, Japán) szereztük be. Az adipocitaátmérő elemzéséhez állatonként öt képet gyűjtöttünk Image J szoftver segítségével (National Institutes of Health Bethesda, MD, USA). Manuálisan köröztük az adipocitákat (állatonként több mint 250 sejt) és mértük az adipocita átmérőket [25].

Egerek hideg állóképességi kísérlete

A hűtött helyiségekben végzett kísérletekhez az egereket még mindig egyedül helyezték el, és szabadon hozzáférhettek a vízhez és az élelemhez (korábban a súlyát is figyelték), a ketrecbe vastag párnázatot is tettünk, hogy egyszerre melegen tartsunk. Az egereket éheztettük, és 24 órán át 4 ° C-os hideg helyiségbe helyeztük. A testhőmérsékleteket különböző időközönként (0, 3h, 6h, 12h, 24h) figyeltük a nap folyamán rektális szondával elektrohőmérővel (TH212, Hongauchengyun, Kína).

RNS-seq és számítási elemzés az RNS-seq adatokhoz

A központi STAT5 potenciális szerepének feltárása az elhízás kialakulásában, valamint az EA elhízás alapú molekuláris mechanizmusának feltárása érdekében a hipotalamusz RNS-seq-jét és az Epi-WAT-t új generációs nagy áteresztőképességű szekvenálással végeztük.

A hipotalamusz teljes RNS-ét és az Epi-WAT-t Trizol® Reagent (Invitrogen, 15596018) alkalmazásával izoláltuk. Az RNS-koncentrációt Qubit® 2.0 fluorométerrel (Invitrogen) határoztuk meg, Qubit® RNS BR assay készlettel (Invitrogen, Q10211). Az RNS minőség-ellenőrzését (Agilent, 1309) az Agilent 2100 Bio-analizátorral (Agilent Technologies, Inc., CA, USA) végeztük a gyártó protokolljainak megfelelően.

Az RNS-szekvenciához RNS könyvtárat készítettünk a TruSeq RNS Sample Preparation v2 (Illumina; 15025062) protokoll szerint, majd klasztergenerálással és szekvenálással követtük cBOT Multiplex re-hibridizációs lemezt és TruSeq SBS V3 kit (Illumina; 15021668). A szekvenálást az Illumina Hiseq 2000 (Illumina, USA) segítségével végeztük. Az adatok elemzését az előzőekben leírtak szerint végeztük. A nyers FASTQ fájlokat kivontuk az Illumina BCL-ből az Illumina CASAVA program segítségével, majd a TopHat program segítségével igazítottuk az egér referencia genomjához (UCSC mm9 összeállítás). A Cufflinks programot használták az egyedi átiratok összeállításához, a Cuffdiff programot pedig a differenciális transzkript expressziós elemzéshez. A gének funkcionális annotációját és útvonalait a DAVID Bioinformatikai Erőforrások [22] felhasználásával elemezték. A hőtérképet a Cluster és a TreeView szoftver készítette. Az egynél kevesebb FPKM-mel rendelkező géneket (átlagos fragmensek a transzkriptum kilobázisára vonatkoztatva/millió feltérképezett fragmens) kiszűrtük. A fel- és a le-szabályozást a relatív transzkripció szintjeként határoztuk meg a Log2-szeres változás (FC) ≥ | ± 1 | és P érték 1. ábra. Az EA kezelés helyreállította a Stat5NKO által kiváltott elhízott fenotípust, javította az energia-anyagcserét és a hidegtűrést a Stat5NKO elhízott egerekben.

(A) A testtömeg megfigyelése a négy csoportban, n = 10 minden csoportban. (B) Az élelmiszer-fogyasztás mérése, n = 10 minden csoportban. (C) Az epididymális és inguinalis fehér zsírszövet, a barna zsírszövet és az egér testtömegének aránya, n = 10 minden csoportban. (D) Az egér szérum leptinjét ELISA-val detektáltuk, a glükózszintet glükométerrel mértük 4 hetes elektro-akupunktúrás kezelés után, n = 10 minden csoportban. (E & F) Az EA kezelés csökkentette a Stat5NKO elhízott egerek adipocita méretét. Az Epi-WAT (E) H&E festése az átlagos adipocita átmérővel (F) együtt EA és kontrollcsoport egerekben, n = 5 minden csoportban. (G) Az EA-kezelés csökkentette a Stat5NKO elhízott egerek szérum TG- és TC-szintjét. A szérum koleszterin (TC), a triglicerid (TG) és az alacsony sűrűségű lipoprotein (LDL) szintjét ELISA-val mértük. n = 10 minden csoportban. (H) Az EA kezelés növelte a hideg állóképesség képességét a Stat5NKO elhízott egerekben. Az egereket 4 ° C-os hideg szobában helyeztük el, a rektális hőmérsékletet 3, 6, 12 és 24 óra múlva mértük; n = 6 minden csoportban. * P # P ## P 1. táblázat: Differenciálisan expresszált gének (DEG), log2 (FC)> | ± 1 | és p érték 2. ábra. A felfelé vagy lefelé szabályozott gének GO annotációjának és KEGG útvonalainak elemzése a Stat5NKO egerek hipotalamuszában és az Epi-WAT.

(A – F). (A) A Stat5NKO egerek hipotalamuszában az 1. táblázatban bemutatott 388 felfelé szabályozott gén sejtkomponens-annotációs eredményei, amelyek az 1. táblázatban láthatók. (B) A Stat5NKO egerek hipotalamuszában található 338 felfelé szabályozott gén főbb KEGG-útjai az 1. táblázatban. (C) A Stat5NKO egerek 1047 felfelé szabályozott génjének Epi-WAT annotációs eredményei az 1. táblázatból származnak. (D) A Stat5NKO egerek 1106 lefelé szabályozott génjének Epi-WAT sejtkomponensek annotációs eredményei az 1. táblázatból származnak. (E) KEGG útvonalak az eredmény az 1. táblázatban bemutatott 1047 génből származik; (F) A KEGG útvonal eredményét az 1. táblázatban bemutatott 1106 génből nyertük.

Venn-diagramok és GO-annotációs elemzés a ko-szabályozott génekről mind a központi (hipotalamusz), mind a perifériás (Epi-WAT) szövetekben (A-D). (A) Venn-diagramokat készítettünk az RNS-seq adatkészletek alapján. A piros körök jelzik a felfelé vagy lefelé szabályozott gének számát az Epi-WAT-ban (vs. Stat5fl/fl csoport); a zöld körök jelzik a hipotalamuszban felfelé szabályozott gének számát (vs. Stat5NKO csoport). A kék körök a lefelé szabályozott gének számát jelentik a hipotalamuszban (vs. Stat5NKO csoport). (B) GO annotáció a társszabályozott génekről a Stat5NKO elhízott egerek hipotalamuszában és a WAT-ban. (C) KEGG útvonal a társszabályozott gének számára a hipotalamuszban és a Stat5NKO elhízott egerek WAT-jában. (D) A Stat5NKO elhízott egerek hipotalamuszában és a WAT-ban szabályozott gének GO annotációs eredményei.

Az EA-kezelés megfordította a kóros génexpressziót a Stat5 NKO elhízott egerekben.

Az EA-kezelés megváltoztatta a Stat5NKO egerek (F-I) hipotalamuszában (A-E) és Epi-WAT-ban lévő abnormálisan expresszált géneket. (A) Az átfedő terület a Stat5NKO csoportban a szabályozott génszámot (310) jelenti (szemben a Stat5fl/fl csoporttal), de csökkent az EA csoportban; (B) A hőtérképet az 5A-ban lévő 310 átfedő gén FPKM-értékeinek felhasználásával hoztuk létre; (C) Az 5A-ban lévő 310 átfedő gének útelemzése. (D) A PPAR jelátviteli útban részt vevő ismert gének expressziós szintje megváltozott a Stat5NKO csoportban (szemben a Stat5fl/fl csoporttal), és néhányat EA megfordított; (E) Az átfedő terület a Stat5NKO csoportban lefelé szabályozott génszámot (21) képvisel (szemben a Stat5fl/fl csoporttal), de az EA csoportban nőtt. (F) Az Epi-WAT 201 ko-szabályozott génjének útelemzése. (G) és (I) Venn diagramokat készítettünk az RNS-seq adatsorok alapján. A piros körök jelzik a Stat5NKO csoportban a lefelé vagy felfelé szabályozott gének számát (vs. Stat5 fl/fl csoport); a zöld körök (G, I) a felfelé vagy lefelé szabályozott gének számát jelentik az EA csoportban (vs. Stat5NKO csoport). (H) A hőtérképeket a Stat5NKO csoportban lefelé szabályozott génekkel és a Stat5NKO + EA csoport felfelé szabályozott génjeivel készítettük. A felfelé és lefelé szabályozott gének expressziós szintje vörös, illetve zöld színben jelenik meg.

Az RNS-seq adatok validálása

Az RNS-Seq adataink igazolásához kifejezetten ellenőriztük a jól ismert monogén elhízási fenotípussal kapcsolatos géneket. Megállapítottuk, hogy 21 ismert gén [18, 26, 27] jelent meg a Stat5NKO egerek hipotalamuszának listáján (5A. Ábra), és közülük kettő (Prl, Lep) a Stat5NKO csoport hipotalamuszában volt felfelé szabályozva. csökkentette az EA, de csak egy gént (Etv5) szabályoztak a Stat5 elvesztése miatt. Az Epi-WAT-ban 11 gént (Sec16b, Rasal2, Etv5, Slc39a8, Tfap2b, Nfe2l3, Faim2, Npc1, Sim1, Dgkg és Enpp1) szabályozott a Stat5 elvesztése, és kettőt (Slc39a8 és Faim2) jelentősen felfelé szabályozta az EA. Időközben öt gént (Grb14, Pter, Mtch2, Gtf3a, Tmem160) szabályoztak a Stat5NKO csoportban, a Grb14-et pedig az EA szabályozta. Ezenkívül qRT-PCR segítségével több gén relatív mRNS-expresszióját detektáltuk véletlenszerűen kiválasztott minták részhalmazában, hogy tovább teszteljük ezen adatok validálását. Az eredmények azt mutatták, hogy az RNS-seq adatok és a qRT-PCR adatok tendenciái hasonlóak voltak (5B. Ábra).